CN103965304B

CN103965304B - 一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN103965304B
Application number: CN201310038897.2A
Authority: CN
Inventors: 赵宗保; 朱志伟; 张素芳
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2013-01-31
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2033-01-31
Also published as: CN103965304A

Abstract

本发明涉及一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用。所述产油酵母脂滴蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQ ID NO：1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相关活性的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。绿色荧光蛋白共定位和油脂发酵分析证明本发明的产油酵母脂滴蛋白及其编码基因能显著提高细胞油脂积累和贮存量。本发明还通过基因异源表达获得了可显著提高油脂积累量的重组工程菌株。本发明的产油酵母脂滴蛋白及其编码基因可应用微生物油脂、脂肪酸衍生物生产菌株构建，以及作为肥胖病人治疗药物筛选的靶标。

Description

一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种产油酵母脂滴蛋白及其基因与应用。具体地，所述产油酵母脂滴蛋白以及编码其的核苷酸来源于掷孢酵母(Sporobolomycesroseus)。本发明还提供一种构建油脂生产重组细胞的方法。

背景技术

油脂是一种氧含量低、能量密度高、碳链长度适中的可再生资源，可以代替化石资源作为化学工业和可再生能源产业的基本加工原料，是人类从碳氢经济向碳氢氧经济过渡的重要链接，其市场潜力巨大。自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞内贮存超过其细胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯为主，具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等，其中产油酵母包括Rhodotorula，Candida，Cryptococcus，Rhizopus，Trichosporon和Yarrowia属中的某些菌株[RatledgeC，WynnJP.AdvApplMicrobiol2002，51，1-51]。利用微生物转化生物质资源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术，形成化学品的石化资源替代品生产新途径[赵宗保.中国生物工程杂志2005，25(2)，8-11]。

半个世纪以来，国内外微生物油脂研究的重点集中在菌株筛选、驯化和发酵工艺优化等领域，取得了重大进展。随着生物技术的快速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优化已不能满足产油微生物性状改良的需要。做为某一化学品的天然生产菌株，其特定的生产性能往往并非最优。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物技术领域研究的热点和难点。油脂发酵研究需要油脂代谢途径的重构和强化，赋予重组菌株生产新型脂肪酸衍生物的性能。由于优良土著生产菌株的遗传背景目前仍不清楚，油脂积累代谢调控相关基因克隆有限，寻找更多的油脂积累代谢调控相关基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。

研究人员发现，来源于产油微生物(圆红冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的异柠檬酸脱氢酶(IDH)和苹果酸酶(ME)的编码基因在土著菌油脂积累过程中有表达差异，酿酒酵母功能互补分析也证明这些基因可增加重组菌株的油脂含量，但并没能将一个非产油菌株成功改造成一个产油菌株[YangF，ZhangSF，ZhouYJ，ZhuZW，LinXP，ZhaoZK.Appl.Microbiol.Biotechnol.2012，94(4)，1095-1105]。实验结果暗示，微生物油脂积累代谢调控可能涉及更多的基因及其间的相互调节和相互作用。

脂滴(Lipiddroplets)是细胞内中性脂肪贮存的主要场所，直径从40nm至100μm不等，广泛存在于植物、昆虫和动物细胞中。其由极性单磷脂层包裹中性脂组成的疏水核心而构成，并且表面分布有很多蛋白，成熟脂滴中含量最丰富的表面蛋白是周脂素(perilipin)。做为脂滴相关蛋白家族(PAT家族)成员，周脂素具有典型的PAT-1结构域(氨基端1-100aa)；其中间1/4部分为疏水氨基酸组成的脂滴锚定结构域，而羧基端则和保护甘油三酯不被水解，增加油脂含量功能相关。Perilipin的功能与其磷酸化状态有关，在基础状态下，perilipin未磷酸化，在脂滴表达形成一种物理屏障，阻止脂肪酶接触到脂滴内的甘油三酯，从而保护脂滴内中性脂免受降解；在能量低下、营养匮乏的条件下，它被蛋白激酶A(PKA)磷酸化，招募激素敏感脂肪酶(HSL)到脂滴表面，水解中性脂，为细胞提供能量；因此该蛋白在调节脂质储存和降解具有重要作用[BickelPE，TanseyJT，WelteMA.BiochimBiophysActa.2009，1791(6)，419-440][MiuraS，GanJW，BrzostowskiJ，ParisiMJ，SchultzCJ，LondosC，OliverB，KimmelAR.JBiolChem.2002，277(35)，32253-32257]。该基因在动物与某些子实体真菌中广泛存在，但是在酿酒酵母中未发现周脂素同源蛋白；在动物体内，周脂素做为一种重要的信号调控“开关装置”，可以调控机体脂肪的储存和释放。

和动物的脂肪细胞一样，产油酵母合成的甘油三酯以脂滴的形式贮存在细胞内部，随着油脂积累量的增加，脂滴不断变大或相互融合，在油脂积累后期，脂滴几乎占据了整个产油酵母的细胞大小[ZhuZW，ZhangSF，LiuHW，ShenHW，LinXP，YangF，ZhouYJ，JinGJ，YeML，ZouHF，ZhaoZK.Nat.Commun.2012，3，1112，SupplementaryFigureS6]。2007年，在金龟子绿僵菌中首次鉴定了周脂素，并证明它具有保护脂滴免受降解的作用[WangC，StLegerRJ.JBiolChem.2007，282(29)，21110-21115]。最近，通过脂滴蛋白质组学研究，我们鉴定掷孢酵母(S.roseus)油脂积累期间一种新颖的周脂素(perilipin)样蛋白高丰度表达，并发现该蛋白的丰度与油脂含量成正比，将其命名为SrLDP1(S.roseuslipiddropletprotein1，掷孢酵母脂滴蛋白1)，根据实验结果，推测该基因与产油微生物油脂积累、贮运和代谢调控密切相关。截止专利提交日，NCBI上未检索到关于掷孢酵母perilipin的任何序列信息。

发明内容

本发明的目的是提供一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的产油酵母脂滴蛋白，名称为SrLDP1(S.roseuslipiddropletprotein1，掷孢酵母脂滴蛋白1)，来源于掷孢酵母S.roseusJCM8242，是由如下a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQIDNO：1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且具有所述脂滴蛋白相关活性的由SEQIDNO：1衍生的蛋白质。

其中所述“脂滴蛋白相关活性”是指促进脂滴融合、生长，增加脂滴内油脂积累，稳定脂滴形态与功能，参与油脂贮运和代谢调控相关的脂滴蛋白活性。

为了使本发明的产油酵母脂滴蛋白便于纯化，可以在上述(a)或(b)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签及其序列

标签	氨基酸残基个数	氨基酸序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
C-myc	10	EQKLISEEDL

Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			Poly-Phe	11	FFFFFFFFFFF

上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行常规蛋白质表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可能通过将SEQIDNO：2所示的DNA序列中缺失一个或几个编码氨基酸的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变获得其编码核苷酸序列而得到，任选地，在其编码核苷酸序列的5’端和3’端连上表1所示的标签的编码序列而便于纯化。

所述产油酵母脂滴SrLDP1的编码核苷酸序列(例如，srldp1)也属于本发明的保护范围。

因此，本发明还提供一种编码本发明的产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列。

优选地，所述核苷酸序列为SEQIDNO：2所示的DNA分子。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌株均属于本发明的保护范围。

因此，本发明还提供包含编码本发明的产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列的重组载体，优选是重组表达载体；提供导入了(例如，通过转化或转染技术导入)所述重组载体的重组细胞。所述重组细胞优选为酵母细胞、莱茵衣藻、蓝细菌、红球菌或大肠杆菌。

本领域技术人员应该理解，将编码产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列或包含编码产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列的重组载体导入宿主细胞可以按照本领域的常规技术进行，例如，可以通过转化、转染(例如，农杆菌介导的转染)或电穿孔等常规技术进行。

本发明还保护扩增所述基因的引物。

可用现有的担子菌表达载体和酿酒酵母表达载体构建含有所述编码基因(srldp1)的重组表达载体。

所述的担子菌表达载体包括根瘤农杆菌介导基因重组载体和可用于担子菌微弹轰击的载体等。所述的担子菌表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、掷孢酵母基因(如S.roseus的G3PDH基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。所述的酿酒酵母表达载体包括酿酒酵母游离型表达载体(携带2μm复制子或自主复制序列(ARS)，如pYX212、pYES2C/T等可自行购买的现有通用载体)和整合型表达载体(携带整合位点基因重组臂)。

使用srldp1构建重组酵母表达载体时，在其起始核苷酸前可加上任何一种诱导型启动子或组成型启动子，如三磷酸甘油醛脱氢酶启动子pG3PDH、半乳糖诱导启动子pGal10，启动子可单独使用或与其它启动子结合使用。

为了便于对转基因细胞系或重组菌株进行鉴定及筛选，可对所用载体进行修饰，如引入可在酵母细胞中表达的编码产生颜色变化的酶(如绿色荧光蛋白)或发光化合物的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记基因(如卡那霉素标记基因、博莱霉素标记基因、潮霉素标记基因)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)、以及营养筛选标记基因(如LEU2、URA3)等。

本发明的另一个目的是提供一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括：将编码本发明的产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列导入宿主细胞，得到油脂生产重组细胞。其中编码本发明的产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列的导入通过用包含所述核苷酸序列的重组载体转化宿主细胞实现。优选地，所述宿主细胞可以选自酵母、微藻、红球菌或大肠杆菌，其中所述酵母可以为酿酒酵母，其包括，但不限于，酿酒酵母INVSc1或BY4741；或者可以为掷孢酵母，其包括，但不限于，S.roseusJCM8242；所述红球菌包括，但不限于，浑浊红球菌，例如，R.opacusPD630；所述微藻选自衣藻或聚球藻，例如，但不限于，莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CC-849或聚球藻(Synechococcussp.)PCC7002。利用任何一种可以启动外源基因在酿酒酵母中表达的载体，将本发明所提供srldp1导入酿酒酵母细胞中，得到油脂生产重组酿酒酵母。利用任何一种可以启动外源基因在掷孢酵母(Sporobolomycesroseus)中表达的载体，将本发明所提供srldpl增加拷贝数，得到重组掷孢酵母。利用任何一种可以启动外源基因在莱茵衣藻中表达的载体，将本发明所提供srldp1导入莱茵衣藻中，得到油脂生产重组莱茵衣藻。利用任何一种可以启动外源基因在红球菌中表达的载体，将本发明所提供srldp1导入红球菌中，得到油脂生产重组红球菌。利用任何一种可以启动外源基因在大肠杆菌中表达的载体，将本发明所提供srldp1导入大肠杆菌中，得到油脂生产重组大肠杆菌。

本领域技术人员应该理解，为了便于编码本发明的产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列在宿主细胞中的表达，取决于所选用的宿主细胞品系，可以适当地对所述核苷酸序列进行密码子优化；为了便于筛选，可以在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端连接抗生素标记基因(如卡那霉素标记基因、博莱霉素标记基因、潮霉素标记基因)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)、以及营养筛选标记基因(如LEU2、URA3)等；为了便于纯化，可以在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端连接纯化标签的编码序列。

实验证明，本发明提供的产油酵母脂滴蛋白及其编码基因可显著提高重组细胞的油脂含量和脂滴稳定性。

综上所述，本发明提供下述：

1.一种产油酵母脂滴蛋白，是下述(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.一种编码第1项的产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列。

3.根据第2项所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQIDNO：2所示的DNA分子。

4.包含第2项或第3项的核苷酸序列的重组载体。

5.一种重组细胞，所述细胞导入第4项所述的重组载体。

6.一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括：将第2项或第3项所述基因导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞。

7.根据第6项所述的方法，其中通过用第4项所述的重组载体转化宿主细胞而导入第2项或第3项所述的基因。

8.根据第6项所述的方法，其中所述宿主细胞选自酵母、微藻、红球菌或大肠杆菌。

9.根据第8项所述的方法，其中所述酵母选自酿酒酵母或掷孢酵母，所述微藻选自衣藻或聚球藻，所述红球菌是浑浊红球菌。

10.根据第9项所述的方法，其中所述衣藻是莱茵衣藻。

附图说明

图1为srldp1基因RT-PCR扩增结果，扩增条带为0.8kb。

图2为SrLDP1与其它物种perilipin的结构域组成分析示意图。

图3为SrLDP1原核表达质粒图谱。

图4为SrLDP1原核表达产物的SDS-PAGE分析。M：蛋白分子量标准；P：诱导细胞裂解液沉淀；S：诱导细胞裂解液上清。

图5为原核表达SrLDP1蛋白的镍亲和纯化。M：蛋白分子量标准；L：细胞裂解液；E1、E2：40mM咪唑洗脱组分。

图6为SrLDP1重组酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-SrLDP1。

图7为羧基端融合GFP的SrLDP1重组酿酒酵母表达质粒pYES2/CT-SrLDP1-GFP图谱。

图8为融合GFP的重组SrLDP1的表达定位。(A)SrLDP1-GFP表达宿主的亮场显微镜观察。(B)SrLDP1-GFP表达宿主的亮场显微镜观察。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定并本明。本发明的范围由权利要求及其等价体限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

掷孢酵母(S.roseus)JCM8242：购自日本微生物保藏中心(JapanCollectionofMicroorganisms，JCM)，分离自日本叶柳(Leafofwillow)，由M.Yoshizawa提交至日本东京大学IAM培养物保藏中心(IAMCultureCollection)，后移送至JCM。等同于S.roseus1AM13481。

掷孢酵母(S.roseus)ATCC66500：购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，分离自日本福冈空气，由I.Yamasaki经手AShiraishi提交ATCC，该菌株等同于CBS7500或IFO10566或JCM3763或NRRLY-17305。

以下实施例中所涉及的培养基配方及用途如下：

(1)YEPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，pH6.0，固体培养基则再加入琼脂粉15g/L；用于菌种活化培养、种子液制备和菌种短期保藏。

(2)限氮培养基：葡萄糖70g/L，酵母粉0.75g/L，(NH₄)₂SO₄0.1g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，pH5.6，并补加1％(V/V)的痕量元素液体(4.0g/LCaCl₂·2H₂O，0.55g/LFeSO₄·7H₂O，0.52g/Lcitricacid·H₂O，0.10g/LZnSO₄·7H₂O，0.076g/LMnSO₄·H₂O和100μl18MH₂SO₄)，用于菌株油脂积累和富含脂滴菌体的培养。

实施例1：掷孢酵母周脂素样蛋白的发现

掷孢酵母(S.roseus)JCM8242于液体YEPD培养基中30℃培养36h。离心收集湿菌体，用蒸馏水洗涤两次，于-80℃冰箱中储存，用于RNA和蛋白质提取。进行同样培养的样品(平行样品)则用于测定细胞干重和油脂含量。样品命名为‘YEPD’。

S.roseusJCM8242进行限氮培养基发酵，实现油脂积累。于FUS-15L生物反应器中进行，装液量8L，接种量10％，温度30℃，通气量0.8vvm，溶氧控制在40-50％饱和值(溶氧与搅拌联动)。pH通过滴加10.0MNaOH和2MHCl自动控制在5.6。分别取出培养了24h和96h的细胞培养液各50mL，样品分别命名为‘24h’和‘96h’。离心收集湿菌体，用蒸馏水洗涤两次，于-80℃冰箱中储存。平行样品用于测定细胞干重和油脂含量[LiYH，ZhaoZK，BaiFW.EnzymeMicrob.Technol.2007，41(3)，312-317]。

S.roseusJCM8242的脂滴(Lipiddroplets)蛋白质组分析：‘YEPD’、‘24h’和‘96h’这3个样品的脂滴分离纯化、脂滴蛋白抽提和鉴定操作同参考文献：[AthenstaedtK，JolivetP，BoulardC，ZivyM，NegroniL，NicaudJM，ChardotT.Proteomics.2006，6(5)，1450-1459][LiuH，ZhaoX，WangF，LiY，JiangX，YeM，ZhaoZK，ZouH.Yeast，2009，26，553-566][DingY，YangL，ZhangS，WangY，DuY，PuJ，PengG，ChenY，ZhangH，YuJ，HangH，WuP，YangF，YangH，SteinbuchelA，LiuP.J.LipidRes.2012，53，399-411])，其中，一个27kDa左右的SDS-PAGE蛋白条带经胰蛋白酶酶解后利用μHPLC-MS/MS方法分析发现，‘24h’和‘96h’样品中均出现的单一肽段(UniquePep)有19个：

R.AANLAAAILHR.L；

R.VDGYANGALDYVEK.R；

K.TLSEISAELDSVVK.A；

K.SETSEIVGKPR.Q；

R.QAADHAVAAFYAQIGK.S；

K.AQNILNYSQEK.L；

K.LTPVLESVK.A；

K.DTLDTAHSYVAANSYTNALYER.A；

K.SQETLHGLQDRLAK.T；

R.LPLERVDGYANGALDYVEK.R；

R.LEPLQKRLP.L；

R.AYGYPVVK.D；

K.SQETLHGLQDR.L；

KAVPSLPAQAQSHAQPYLDGLGEAALYVKK；

K.EVTRSDATVSEK.A；

K.LTPVLESVKAYAFK.T；

K.QVEEKGEEVK.E；

K.AYAFK.T；

R.SDATVSEK.A。

在‘24h’和‘96h’样品中这些肽段含量总量(PepCount)分别为55和380，‘96h’样品肽段丰度是‘24h’样品的6倍左右，并在‘96h’样品中达到最高。样品重复分析三次，数据分析基于三次重复分析中鉴定到的蛋白累加。

实验中获得的MS/MS数据(24h’和‘96h’均出现的UniquePep(单一肽段))使用TurboSEQUEST(BioWorks3.2)软件进行数据检索，数据库为掷孢酵母基因组数据库(http://genome.jgi-psf.org/pages/blast.jsf？db＝Sporo1)。搜库参数设置同参考文献[LiuH，ZhaoX，WangF，LiY，JiangX，YeM，ZhaoZK，ZouH.Yeast，2009，26，553-566]。发现这些肽段均来源于一个多肽(编号为jgi|Sporo1|29053|fgenesh1_pg.C_scaffold_10000071，全长1282aa)羧基端约240aa左右的序列。由于实验数据显示这些肽段MS/MS数据均来源于27kDa左右的SDS-PAGE蛋白条带，故推测jgi|Sporo1|29053|fgenesh1_pg.C_scaffold_10000071预测错误。下载该蛋白序列经Blastp分析后发现，正确的蛋白质序列应如SEQIDNO：1所示，鉴定该蛋白质(基因)为一种新颖的周脂素。

将SEQIDNO：1所示的蛋白质命名为SrLDP1。SrLDP1由242氨基酸残基组成；理论等电点为6.97；经过序列分析SrLDP1没有信号肽标识，为胞内酶；根据SrLDP1氨基酸序列可以将该酶归于周脂素家族，属于脂滴相关蛋白；但SrLDP1的结构与子囊菌、哺乳动物细胞来源的周脂素相差较大，与来自圆红冬孢酵母的周脂素具有最大同源性；为一种新颖的周脂素；SEQIDNO：1所示的SrLDP1，自氨基端第4-117为周脂素结构域，84-240为载脂蛋白(apolipoprotein)结构域，周脂素结构域和载脂蛋白结构域部分重叠(图2)。

实施例2：掷孢酵母srldp1基因的克隆

根据SrLDP1的氨基酸序列，设计简并引物：

srldp1-sence：ATGGARCARACNTTYCC(N：A/C/G/T，R：A/G，Y：C/T)

srldp1-anti：TTAYTCNGAYTTNGTCGT(N：A/C/G/T，Y：C/T)(/代表“或”)

引物方向均为5’至3’方向。

利用液氮研磨加RNAiso方法[YangF，TanHD，ZhouYJ，LinXP，ZhangSF.Mol.Biotechnol.2010，47(2)，144-151]提取S.roseusJCM8242总RNA。RNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的两条带。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得OD_260/280＝2.0，表明总RNA质量很好。总RNA样品冻存于-80℃备用。

利用HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKit(购自Takara)合成cDNA第一链。20μl反应体系，首先，将2μl总RNA(～1μg)，Oligo(dT)和Random6mer)各100nmol/L，2.0μlDEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TaKaRa公司)，加入到PCR管中混匀，于65℃保温5min，立即置于冰上冷却2min，加入酶Mix(HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKit自带反转录酶，购自Takara)，DEPC处理水补齐20μl，42℃30min进行反转录，70℃15min灭活反转录酶。

以反转录合成的cDNA第一链为模板，进行srldp1基因的简并PCR扩增，5×PCR缓冲液(TakaRa)10.0μl，dNTPs(10mM，TaKaRa)1.0μl，引物srldp1-sence(100mM)和srldp1-anti(100mM)各1.0ul，PrimeStar(大连TakaRa)0.5μl，合成的cDNA第一链模板1.0μl，ddH₂O补齐至50μl，于94℃保温3min，然后于94℃30s，61℃30s，72℃1min，35个循环，再加入TaqDNA聚合酶(TakaRa)1.0μl进行扩增产物的3’末端加A，72℃20min，4℃结束反应。扩增产物进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到0.85kb左右的条带(图1)。利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号：NEP013-2)，按照供应商建议步骤(NEP013-2说明书)纯化PCR产物。PCR产物参照TaKaRa公司提供的方法(D101A说明书)克隆到pMD18-T载体，得到重组质粒pMD18T-srldp1，转化入E.coliDH5α感受态细胞，挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取(碧云天质粒小量提取试剂盒，货号：D0003)。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，测序结果表明，所扩增到的核苷酸序列为SEQIDNO：2，编码氨基酸序列是SEQIDNO：1的蛋白质。将SEQIDNO：1所示的蛋白命名为SrLDP1，将克隆得到的SEQIDNO：2所示的核苷酸命名为srldp1。阳性重组质粒命名为pMD18T-srldp1。经Blastp分析，SrLDP1可归于周脂素家族，属于脂滴相关蛋白。但SrLDP1的结构与子囊菌、哺乳动物细胞来源的周脂素相差较大，SrLDP1除具有周脂素结构域(自氨基端第4-117aa)外，还兼具载脂蛋白(apolipoprotein)结构域(自氨基端第84-240aa)，周脂素结构域和载脂蛋白结构域部分重叠，为一种新颖的周脂素(图2)。

实施例3：掷孢酵母srldp1基因的原核表达和蛋白纯化

根据srldp1的核苷酸序列设计加相应酶切位点的引物(引物srldp1-EcoRI-F的下划线部分为EcoRI酶切位点，引物srldp1-NotI-R的下划线部分为NotI酶切位点)，序列如下：

srldp1-EcoRI-F：GGAATTCATGGAACAAACTTTCCCCGCCACC

srldp1-NotI-R：AAAAGGAAAAGCGGCCGCTTAGTCGGAGTTCGTCGTCTCTTT

引物方向均为5’至3’方向。

以实施例2构建的克隆载体pMD18T-srldp1为模板，利用引物srldp1-EcoRI-F和srldp1-NotI-R扩增srldp1编码区序列，PCR片段经EcoRI/NotI双酶切，连入同样双酶切的pET28a载体(回收酶切大片断用于连接反应)，转化E.coliDH5a化学感受态细胞，经测序验证正确构建的重组质粒命名为pET28a-srldp1(图3)。

将pET28a-srldp1质粒转化E.coliB121(DE3)宿主，得到表达菌株BL21/pET28a-srldp1。挑单菌落接种于10mlKan-LB培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，并含卡那霉素50μg/ml)，37℃培养4-6h至OD_600nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mMIPTG进行诱导，30℃培养过夜。诱导表达结束后，取1ml菌液，于4℃，8000rpm离心5min收集菌体，菌体沉淀用200μl细菌裂解缓冲液(100mMTris-HCl，20％甘油，2mMEDTA，1.5mMDTT，pH7.5)重悬，利用超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，超细探头，功率为60W，脉冲2s，间歇2s，总时间1min)，至菌液变澄清；16000×g，4℃离心10min，取上清为可溶性蛋白部分，利用等体积的裂解缓冲液重悬沉淀；利用SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(12％丙烯酰胺凝胶)。结果如图4所示，0.1mMIPTG诱导条件下，重组SrLDP1几乎完全可溶表达，分子量大约为33kDa(SrLDP1理论分子量为26.6kDa，加标签后融合蛋白分子量为32.5kDa)。

蛋白纯化过程按照InvitrogenNi-NTApurificationsystem指导说明进行，以镍离子做为亲和离子，依靠咪唑浓度梯度(30-100mM咪唑)洗脱目的蛋白。BL21/pET28a-srldp1进行200ml体积诱导表达(200mlKan-LB培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，并含卡那霉素50μg/ml)，37℃培养4-6h至OD为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mMIPTG进行诱导，30℃培养过夜)，离心收集菌体，加入50ml细菌裂解缓冲液(100mMTris-HCl，20％甘油，2mMEDTA，1.5mMDTT，pH7.5)重悬，超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，功率为60W，脉冲2s，间歇3s，总时间10min)，至菌液变澄清；16000×g，4℃离心10min，取上清可溶性蛋白，利用0.22μm低蛋白结合的滤膜过滤后，上样至镍亲和层析柱(体积5ml)，再用30-100mM咪唑浓度梯度(参考InvitrogenNi-NTApurificationsystem(货号：K950-01)说明书)洗脱蛋白。所有纯化操作均在4℃进行，并保证预冷所有的相关缓冲液。纯化得到的蛋白保存于20％甘油中，分装后在-70℃保存。蛋白纯度由SDS-PAGE(12％丙烯酰胺凝胶)分析，结果如图5所示，洗脱组分E1和E2中重组SrLDP1蛋白纯度均大于90％。

将重组大肠杆菌BL21/pET28a-srldp1接种M9-N培养基(M9限氮培养基：2％葡萄糖，0.6％Na₂HPO₄，0.3％KH₂PO₄，0.05％NaCl，1mMMgSO₄，0.1mMCaCl₂，0.1％(v/v)1000×微量元素混合液；1000×微量元素混合液成分：2.7％FeCl₃·6H₂O，0.2％ZnCl₂·4H₂O，0.2％CaCl₂·2H₂O，0.2％Na₂MoO₄·2H₂O，1.9％CuSO₄·5H₂O，0.5％H₃BO₃)，37℃，200rpm振荡培养24h，每隔6h取样，留做油脂含量分析[RudeMA，SchirmerA.Curr.Opin.Microbiol.2009，12，274-281]。结果发现，发酵终点时，与对照菌株BL21/pET28a相比，BL21/pET28a-srldp1胞内油脂含量由10％增加到18.2％，可见，胞内油脂含量提高了82％。证明srldp1基因可促进大肠杆菌油脂积累，增加其胞内油脂含量。

实施例4：掷孢酵母srldp1基因的酵母表达和脂滴定位

根据srldp1的核苷酸序列设计以下引物，用于构建羧基端带有GFP的Perilipin-GFP融合表达载体(引物PG-PER-F的下划线部分为EcoRI酶切位点，引物PG-GFP-R的下划线部分为NotI酶切位点)：

PG-PER-F：GGAATTCAACATGGAACAAACTTTCCCCGCCACC

PG-PER-R：TGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTTAGTCGGAGTTCGTCGTCTCTTT

PG-GFP-F：GAGAAGGAGGGCGAGGGGGAGAAGCAGATGACCATGATTACGCCAAGCT

PG-GFP-R：AAAAGGAAAAGCGGCCGCTCATTTGTAGAGCTCATCCATGCCATG

引物方向均为5’至3’方向。

步骤一SrLDP1重组酿酒酵母表达载体的构建

(1)pYES2/CT-SrLDP1载体构建：实施例3中的引物srldp1-EcoRI-F和srldp1-NotI-R扩增片段经EcoRI/NotI双酶切后连入同样酶切的pYES2/CT(购自Invitrogen)载体(回收酶切大片断用于连接反应)。经EcoRI/NotI酶切鉴定可释放出0.7kb插入片段和5.9kbp的YES2/CT载体片断的重组质粒送TaKaRa测序，测序正确的重组质粒命名为pYES2/CT-SrLDP1(图6)。

(2)pYES2/CT-SrLDP1-GFP载体构建：以先前构建的克隆载体pMD18T-srldp1为模板，利用引物PER-EcoRI-F和pG-PER-R扩增SrLDP1片段；以pGFPuv载体为模板，利用引物pG-GFP-F和pG-GFP-R，扩增GFP片段；SrLDP1和GFP扩增片段利用DNA胶回收试剂盒纯化后，利用Overlap-extensionPCR技术得到SrLDP1-GFP融合基因，纯化后经EcoRI/NotI酶切后连入同样酶切的pYES2/CT(购自Invitrogen)载体。经EcoRI/NotI酶切鉴定可释放出1.5kb插入片段和5.9kbp的YES2/CT载体片断的重组质粒送TaKaRa测序，测序正确的重组质粒命名为pYES2/CT-SrLDP1-GFP(图7)。

步骤二SrLDP1重组酿酒酵母表达菌株的构建

将2个重组质粒pYES2/CT-SrLDP1和pYES2/CT-SrLDP1-GFP分别转化至酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)INVSc1(购自Invitrogen，基因型：MATa/α，his3Δ1/his3Δ1，leu2/leu2，trpl-289/trpl-289，ura3-52/ura3-52)中。转化方法如下：单个酵母菌落接种于5mlYPD培养基(20g/L蛋白胨，10g/L酵母浸提物，20g/L葡萄糖，pH6.0)，过夜培养；以1∶50接种于100ml新鲜的YPD培养基，培养8h左右，此时OD值约为1.0-1.2，冰浴15min；4℃，2000×g离心10min收集菌体，悬浮于50ml冰冷的ddH₂O，2000×g离心10min离心收集菌体，然后悬浮于20ml冰冷的1M山梨醇，2000×g离心10min离心收集菌体，倒尽溶液，菌体悬浮于0.5-1.0ml冰冷的山梨醇，此时OD值约为100-200。50μl电转感受态细胞中加入0.5-1μg质粒DNA(DNA体积不超过5μl)，冰上放置10min，转移至冰冷(0℃)的电转杯中，参数设置：电阻600，电压1500V，电容15μF，温度0℃，电击时间约为5ms，电击完加入1ml冰冷的山梨醇，于30℃摇床温浴2h，涂于SC-Uracil平板(0.67％YNBW/Oaminoacidsbutwithammoniumsulfate，2％葡萄糖，0.01％亮氨酸，0.01％色氨酸，0.005％组氨酸，1.5％琼脂粉)，30℃培养3-4天至长出转化子。转化子接种于SC-Ura液体培养基(0.67％YNBW/Oaminoacidsbutwithammoniumsulfate(无氨基酸酵母基础氮源，含硫酸铵，购自BDDific，货号：291920)，2％葡萄糖，0.01％亮氨酸，0.01％色氨酸，0.005％组氨酸)过夜，3-4ml菌液离心收集菌体，玻璃珠破碎细胞，提取质粒DNA转化E.coliDH5a，转化子提取质粒，EcoRI/NotI酶切验证正确的质粒来源重组菌则分别命名为INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1和INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1-GFP。

步骤三SrLDP1重组酿酒酵母表达菌株中SrLDP1的表达

INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1和INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1-GF分别接种5mlSC-Ura液体培养基(0.67％YNBW/Oaminoacidsbutwithammoniumsulfate(无氨基酸酵母基础氮源，含硫酸铵，购自BDDific，货号：291920)，2％葡萄糖，0.01％亮氨酸，0.01％色氨酸，0.005％组氨酸)培养过夜，OD值达到4.2，离心弃上清，加入50mlSCg-Ura诱导培养基(20g/L半乳糖代替葡萄糖，其它成分同SC-Ura液体培养基)，30℃，200rpm诱导培养过夜，取少量细胞进行荧光显微镜观察。使用pYES2/CT(购自Invitrogen)表达载体，外源基因的表达受到诱导型启动子GAL1p控制，只有培养基中存在半乳糖时，才能诱导表达。利用玻璃株破碎酵母细胞壁方法提取了2个重组酵母菌株INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1和INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1-GFP诱导表达48h后的菌体总蛋白，SDS-PAGE分析后可发现，与同样培养条件下的pYES2/CT(购自Invitrogen)空载体转化NVSc1对照菌株相比，INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1和INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1-GFP分别有27kDa和55kDa的特异蛋白条带的表达。同时，INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1-GFP表达产物C端融合GFP蛋白，与同样培养条件下的pYES2/CT(购自Invitrogen)空载体转化NVSc1对照菌株和NVSc1-pYES2/CT-SrLDP1菌株相比，在荧光显微镜(NikonCo.)330-380nm激发波长下可观察到明显的绿色荧光(图8)。图8的结果表明半乳糖诱导培养基中，目的融全蛋白perilipin-GFP有效表达，且表达的perilipin-GFP融合蛋白定位为脂滴上。

步骤四SrLDP1重组酿酒酵母表达菌株油脂生产分析

INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1和INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1-GFP分别接种5mlSC-Ura液体培养基(0.67％yeastnitrogenbaseW/Oaminoacidsbutwithammoniumsulfate(无氨基酸酵母基础氮源，含硫酸铵，购自BDDific，货号：291920)，2％葡萄糖，0.01％leuine，0.01％tryptophan，0.005％histidine)30℃，200rpm培养24h。按1∶30比例分别转接SC-Ura-NL限氮培养基(10％半乳糖，0.1％酵母浸粉，0.4％KH₂PO₄，0.15％MgSO₄·7H₂O，痕量元素溶液500μL/50mL培养基，NH₄Cl0.025％，pH6.0，C/N比(mol/mol)＝300，痕量元素溶液配方：0.4％CaCl₂·H₂O，0.055％FeSO₄·7H₂O，0.052％水合柠檬酸，0.01％ZnSO₄·7H₂O，0.0076％MnSO₄·H₂O，180mM硫酸)，30℃，200rpm培养4d，每隔24h取样，留做油脂含量分析[LiYH，ZhaoZK，BaiFW.EnzymeMicrob.Technol.2007，41(3)，312-317]和荧光观测。

每隔24h取样的菌液，8000rpm室温离心5min收集菌体，用1mLPBS缓冲液(0.15MKCl，10mMK₃PO₄，pH7.0)洗涤细胞三遍，用1mLPBS缓冲液重悬细胞，加入6μL0.1g/L尼罗红丙酮溶液，室温避光染色10min，用尼康80i荧光显微镜(NikonCo.)在510-560nm激发波长下观察红色中性脂肪滴；切换到330-380nm激发波长下，则观察相同位置的绿色荧光标记。结果显示，脂滴被尼罗红染为桔红色，随着发酵时间延长，脂滴逐渐增多并增大相互融合；切换到330-380nm激发波长下，则可观察到INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1-GFP中绿色荧光蛋白定位于脂滴位置。

而油脂含量分析结果显示，2个重组菌株INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1和INVSc1-pYES2/CT-SrLDP1-GFP于发酵终点(4d)，胞内油脂含量均可超过30％以上，符合产油微生物的定义。证明srldp1基因可显著增加非产油脂微生物胞内油脂含量，赋予重组菌株油脂生产性状。

实施例5：掷孢酵母srldp1的表达水平分析

根据半定量PCR引物设计要求，设计了掷孢酵母ACTIN和srldp1半定量RT-PCR引物，序列如下：

ACTIN-F：GCTGTCTTCCCCTCGATTGT

ACTIN-R：GGGTCAGGATACCACGCTTC

srldp1-F：GCCCAGATTGGAAAGTCG

srldp1-R：GAGGTAAGGTTGAGCGTGA

引物方向均为5’至3’方向。

S.roseusATCC66500于液体YEPD培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，pH6.0)中30℃培养36h。离心收集湿菌体，用蒸馏水洗涤两次，于-80℃冰箱中储存，用于RNA提取。平行样品用于测定细胞干重和油脂含量。样品命名为‘YEPD’。

S.roseusATCC66500进行限氮发酵培养基(葡萄糖70g/L，酵母粉0.75g/L，(NH4)2SO40.1g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，pH5.6)发酵，实现油脂积累。于FUS-15L生物反应器中进行，装液量8L，接种量10％(v/v)，温度30℃，通气量0.8vvm，溶氧控制在40-50％(溶氧与搅拌联动)。pH通过滴加10.0MNaOH和2MHCl自动控制在5.6。分别取出培养了24h和96h的细胞培养液各50mL，样品分别命名为‘24h’和‘96h’。离心收集湿菌体，用蒸馏水洗涤两次，于-80℃冰箱中储存，用于RNA提取。平行样品用于测定细胞干重和油脂含量[LiYH，ZhaoZK，BaiFW.EnzymeMicrob.Technol.2007，41(3)，312-317]。

利用ProRedKit(购自Qbiogen，Inc.，CA，Cat#：6550-600)，结合样品破碎仪(homogenizationsystem，购自MPBiomedicals)按照产品说明书，快速提取‘YEPD’、‘24h’和‘96h’样品的总RNA。RNA质量分析同实施例2。总RNA样品冻存于-80℃备用。

‘YEPD’、‘24h’和‘96h’样品的总RNA均稀释至50ng/μl，利用HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKitwithgDNAEraser(购自Takara)合成cDNA第一链，RT体系为10μl，总RNA的加入量为500ng，其它操作同实施例2。

以ACTIN为内参基因，利用HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKitwithgDNAEraser(购自Takara)，经半定量RT-PCR方法分析perilipin的表达水平，PCR反应体系为25μl：2×SYBRPrimixExtaq12.5μl，上游引物(10μM)和下游引物(10μM)各0.5μl，RT反应产物2μl，加ddH₂O至25μl。PCR反应条件：95℃30sec，接下来，95℃5sec，60℃30sec，共进行25个循环。反应结束后进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，利用SYNGENE凝胶成像分析系统(英国Syngene公司)分析条带灰度(即凝胶软件分析条带获得的平均密度，理论上，使用等量的cDNA进行PCR，条带的灰度值与其对应的样品mRNA的量成正比)，将‘YEPD’、‘24h’和‘96h’样品srldp1基因的条带灰度值除以各自的ACTIN内参基因的条带灰度值进行校正，再分别分析‘YEPD’、‘24h’和‘96h’样品中经内参矫正后的srldp1基因的表达水平。结果显示，S.roseusATCC66500中，srldp1基因的表达水平随其油脂含量增加而增强(表2)，与实施例1中的脂滴蛋白质组学分析数据相吻合。

表2srldp1基因表达水平与油脂含量相关性分析

	YEPD	24h	96h
				胞内油脂含量(％)	9.2	32	59
srldp1基因表达水平	0.6	39.2	126.4

实施例6：SrLDP1重组莱茵衣藻的构建

根据srldp1的核苷酸序列设计以下引物(引物srldp1-Kpn-F的下划线部分为KpnI酶切位点，引物srldp1-NotI-R的下划线部分为NotI酶切位点)：

srldp1-KpnI-F：5’-CTGGAATTCAACATGGCCACCGTCAACGAGAAGC-3’

srldp1-NotI-R：5’-ATCGCGGCCGCTCACTGCTTCTCCCCCTCGCC-3’

引物方向均为5’至3’方向。

以实施例2中构建的克隆载体pMD18T-srldp1为模板，利用引物srldp1-Kpn-F和srldp1-NotI-R扩增srldp1编码区序列，PCR片段经KpnI/NotI双酶切，连接入同样双酶切的pChlamy_1(购自Invitrogen，货号：A14258)载体(回收酶切大片断用于连接)，转化E.coliDH5a化学感受态细胞，挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取(碧云天质粒小量提取试剂盒，货号：D0003)。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，经测序验证正确构建的重组质粒命名为pChlamy_1-SrLDP1。利用ScaI将重组质粒pChlamy_1-SrLDP1线性化，再利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号：NEP013-2)，按照供应商建议步骤(NEP013-2说明书)纯化PCR产物，-20℃保存备用。

莱茵衣藻(C.reinhardtii)CC-849(购自微藻资源中心(ChlamydomonasResourceCenter))利用TAP培养基(购自Invitrogen，货号：A1379801)培养至OD₇₅₀值为0.5，按照试剂盒说明书(货号：A14258)制备莱茵衣藻CC-849电击感受态细胞，取250μl感受态细胞，加入2μg前述线性化的pChlamy_1-SrLDP1重组质粒，室温下温育5min，按照如下参数(电压600V，电容50μF，电阻无穷大)，利用Bio-RadGenePulserII进行电击转化。转化后立即加入5mlTAP-40mM蔗糖溶液(TAP购自Invitrogen，货号：A1379801，补加40mM蔗糖)，于6孔培养板28℃，50μEm^-2s^-1条件下复苏24h，再2000rpm离心5min收集藻体，涂布于TAP-agar-Hygromycin平板(TAP购自Invitrogen，货号：A1379801，补加2％琼脂粉，100μg/ml潮霉素)，28℃，50μEm^-2s^-1条件下培养5d，挑取潮霉素抗性转化子，利用srldp1-Kpn-F和srldp1-NotI-R进行PCR鉴定，阳性克隆命名为CC-849/pChlamy_1-SrLDP1。

重组莱茵衣藻CC-849/pChlamy_1-SrLDP1接种TAP限氮培养基(缩写为TAP-N：Tris碱20mM，MgSO₄·7H₂O0.83mM，CaCl₂·2H₂O0.45mM，K₂HPO₄1.65mM，KH₂PO₄1.05mM，冰醋酸0.1％(V/V)，痕量元素溶液1ml/l培养基，痕量元素溶液配方：Na₂EDTA·2H₂O5g/100ml，ZnSO₄·7H₂O2.2g/100ml，H₃BO₃1.14g/100ml，MnCl₂·4H₂O0.5g/100ml，FeSO₄·7H₂O0.5g/100ml，CoCl₂·6H₂O0.16g/100ml，CuSO₄·5H₂O0.16g/100ml，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O0.11g/100ml)28℃，持续光照70μEm^-2s^-1条件下培养4d，每隔24h取样，留做油脂含量分析和荧光观测[MoelleringEricR.，Benning1Christoph，EukaryoticCell2010，9，97-106]。结果发现，与对照藻株莱茵衣藻CC-849相比，重组莱茵衣藻CC-849/pChlamy_1-SrLDP1胞内油脂含量由28％增加到44.8％。同时，荧光显微镜观察发现，发酵终点时CC-849/pChlamy_1-SrLDP1胞内的脂滴可占据细胞体积的50％以上，而对照莱茵衣藻CC-849藻株的脂滴相对较小，数目也少，仅占据胞内20％左右的体积。证明srldp1基因可促进莱茵衣藻脂滴的生长和油脂积累，显著增加产油微藻胞内油脂含量。

实施例7：SrLDP1重组浑浊红球菌的构建

根据srldp1的核苷酸序列设计以下引物(引物srldp1-BamHI-F的下划线部分为BamHI酶切位点，引物srldp1-SacI-R的下划线部分为SacI酶切位点)：

srldp1-BamHI-F：5’-CTGGGATCCATGGCCACCGTCAACGAGAAGC-3’

srldp1-SacI-R：5’-ATCCAGCTCCTGCTTCTCCCCCTCGCC-3’

引物方向均为5’至3’方向。

根据pGEFPuv的核苷酸序列设计以下引物(引物GFPuv-SacI-F的下划线部分为SacI酶切位点，引物GFPuv-XbaI-R的下划线部分为XbaI酶切位点)：

GFPuv-SacI-F：5’-CTCCAGCTCatgagtaaaggagaagaactt-3’

GFPuv-XbaI-R：5’-TCCTCTAGAttatttgtagagctcatccat-3’

引物方向均为5’至3’方向。

以实施例2中构建的克隆载体pMD18T-srldp1为模板，利用引物srldp1-BamHI-F和srldp1-SacI-R扩增srldp1编码区序列，PCR片段经BamHI/SacI双酶切，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号：NEP013-2)，按照供应商建议步骤纯化酶切大片段；以pGFPuv载体(购自clontech)为模板，利用引物GFPuv-SacI-F和GFPuv-XbaI-R，扩增GFPuv片段，PCR片段经SacI/XbaI双酶切，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号：NEP013-2)，按照供应商建议步骤纯化酶切大片段；pJAM2质粒[Triccas，J.A.，T.Parish，W.J.Britton，andB.Giquel.FEMSMicrobiol.Lett.1998，167，151-156]利用BamHI/XbaI双酶切后回收大片段。将srldp1酶切大片段、GFPuv酶切大片段和pJAM2酶切大片段按3∶3∶1的摩尔比混合，利用T4DNA连接酶连接环化，转化E.coliDH5a化学感受态细胞，挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取(碧云天质粒小量提取试剂盒，货号：D0003)。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，经测序验证正确构建的重组质粒命名为pJAM-SrLDP1-GFPuv。

利用电击转化方法，将pJAM-SrLDP1-GFPuv质粒转化至浑浊红球菌(R.opacus)PD630(购自德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH))，挑取抗性转化子进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性转化子命名为PD630/pJAM-SrLDP1-GFPuv[KalscheuerR，M.Arensko¨tter，andASteinbu¨chel.ApplMicrobiolBiotechnol1999，52，508-515.]。

将重组浑浊红球菌PD630/pJAM-SrLDP1-GFPuv接种于含0.01g/lNH₄Cl和10g/l葡萄糖酸钠的MSM培养基[SchlegelHG，H.Kaltwasser，andG.Gottschalk.Arch.Mikrobiol.1961，38，209-222.]，28℃，200rpm，培养24h，每隔6h取样，留做油脂含量分析和荧光观测[JanMarcHorstRobenek，AlexanderSteinbüchelAppl.Environ.Microbiol.2006，72(10)，6743.]。结果发现，与对照菌株R.opacusPD630相比，重组浑浊红球菌PD630/pJAM-SrLDP1-GFPuv胞内油脂含量由60％增加到了78％。同时，荧光显微镜观察发现，发酵终点时R.opacusPD630/pJAM-SrLDP1-GFPuv胞内形成一个大的脂滴可占据细胞体积的50％以上，而对照菌株R.opacusPD630的脂滴相对较小，仅占据胞内30％左右的体积。证明srldp1基因可促进浑浊红球菌脂滴的形成、生长和油脂积累，显著增加其胞内油脂含量。

实施例8：SrLDP1组成型表达重组掷孢酵母菌株的构建

根据srldp1的核苷酸序列设计以下引物(引物srldp1-NcoI-F的下划线部分为NcoI酶切位点，引物srldp1-EcoRV-R的下划线部分为EcoRV酶切位点)：

srldp1-NcoI-F：5’-CTGCCATGGAACATGGCCACCGTCAACGAGAAGC-3’

srldp1-EcoRV-R：5’-ATCGAATTCTCACTGCTTCTCCCCCTCGCC-3’

引物方向均为5’至3’方向。

以实施例2中构建的克隆载体pMD18T-srldp1为模板，利用引物srldp1-NcoI-F和srldp1-EcoRV-R扩增srldp1编码区序列，PCR片段经EcoRV/NcoI双酶切，连接入同样双酶切的pRH203[LiuY，KohCM，SunL，HlaingMM，DuM，PengN，JiL.ApplMicrobiolBiotechnol.2013Jan；97(2)：719-729]载体中RtG3PDH启动子的下游(替换原GFP基因)，转化E.coliDH5a化学感受态细胞，挑选链霉素抗性转化子进行增菌培养、质粒提取(碧云天质粒小量提取试剂盒，货号：D0003)。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，经测序验证正确构建的重组质粒命名为pRH203-SrLDP1。将pRH203-SrLDP1转化农杆菌AGL1[LazoGR，SteinPA，LudwigRA.Biotechnology(NY).1991，9(10)，963-967.]。挑取壮观霉素抗性转化子，利用引物srldp1-NcoI-F和srldp1-EcoRV-R进行PCR鉴定，阳性重组子命名为AGL1/pRH203-SrLDP1。将重组农杆菌AGL1/pRH203-SrLDP1按YanbinLiu等人方法转化导入掷孢酵母(S.roseus)JCM8242，挑取潮霉素抗性转化子进行PCR鉴定，阳性重组子命名为掷孢酵母JCM8242G3PDH-srLDP1[LiuY，KohCM，SunL，HlaingMM，DuM，PengN，JiL.ApplMicrobiolBiotechnol.2013Jan；97(2)：719-729]。

将出发菌株掷孢酵母JCM8242和重组掷孢酵母JCM8242G3PDH-SrLDP1分别接种YEPD培养基，30℃，200rpm，培养3d，每隔24h取样，留做油脂含量分析和荧光观测[WuSG，ZhaoX，ShenHW，WangQ，ZhaoZK.Bioresour.Technol.2011，102(2)，1803-1807.]。结果发现，在不利于油脂积累的YEPD培养条件下，与对照菌株掷孢酵母JCM8242相比，重组掷孢酵母JCM8242G3PDH-SrLDP1胞内油脂含量增加了3倍，由12％增加到48％。同时，荧光显微镜观察发现，发酵终点时重组掷孢酵母JCM8242G3PDH-SrLDP1胞内的脂滴可占据细胞体积的60％以上。证明组成型表达的srldp1基因，由于不受原srldp1启动子的转录调控，所以在营养丰富条件下也可促进掷孢酵母脂滴的形成、生长和油脂积累，显著增加其胞内油脂含量。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims

1.一种产油酵母脂滴蛋白，其是由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种编码权利要求1的产油酵母脂滴蛋白的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQIDNO：2所示的DNA分子。

4.包含权利要求2或3的核苷酸序列的重组载体。

5.一种重组细胞，所述细胞导入权利要求4所述的重组载体。

6.一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括：将权利要求2或3所述的核苷酸序列导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中通过用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞而导入权利要求2或3所述的核苷酸序列。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞选自酵母、微藻、红球菌(Rhodococcus)或大肠杆菌(E.coli)。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或掷孢酵母(Sporobolomycesroseus)，所述微藻选自衣藻(Chlamydomonas)或聚球藻(Synechococcussp.)，所述红球菌是浑浊红球菌(Rhodococcusopacus)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述衣藻是莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)。