CN112280696B - 一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用 - Google Patents

一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112280696B
CN112280696B CN202011299929.0A CN202011299929A CN112280696B CN 112280696 B CN112280696 B CN 112280696B CN 202011299929 A CN202011299929 A CN 202011299929A CN 112280696 B CN112280696 B CN 112280696B
Authority
CN
China
Prior art keywords
saccharomyces cerevisiae
organic carbon
carbon source
culture
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011299929.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112280696A (zh
Inventor
周文俊
刘天中
纪晓彤
高莉丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Original Assignee
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS filed Critical Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority to CN202011299929.0A priority Critical patent/CN112280696B/zh
Publication of CN112280696A publication Critical patent/CN112280696A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112280696B publication Critical patent/CN112280696B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过研究发现，在酿酒酵母发酵培养过程中，通过控制有机碳源的补加量，使发酵培养液中的有机碳源浓度持续维持在超低的水平，在这种状态下，酿酒酵母细胞内与乙醇合成相关的酶的活性因作用底物的匮乏而大幅降低，但与脂肪酸合成相关的酶的活性并不会受到显著影响，从而使有机碳源的流向偏向脂肪酸合成，最终使得酿酒酵母细胞内油脂的大量积累。本发明原料成本低，培养方法简单易行，有利于其工业化生产应用，因此具有良好的实际生产应用之价值。

Description

一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培 养方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其主要被用于酿造业和面点食品加工行业，同时也是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛。酿酒酵母的油脂中富含一种在自然界中非常稀有且价格昂贵的ω-7单不饱和脂肪酸——棕榈油酸(十六碳烯酸，C16:1)。经研究证实，棕榈油酸在一些慢性疾病如代谢综合症、糖尿病和炎症中具有良好的预防和治疗作用，已经引起人们广泛关注，并被开发成医药制剂在欧美等国家上市，但这些产品原料通常主要来自难以商业化养殖或种植的野生动植物资源，如深海鱼、澳洲坚果、沙棘等，难以满足市场需求。棕榈油酸在酿酒酵母总脂中的占比可以达到50％左右，因此其在棕榈油酸生产领域具有极为重要的价值和非常良好的应用前景。但是，由于酿酒酵母自身并不能大量积累油脂，通常，其油脂含量只有细胞干重的5％左右，即使在缺氮等油脂诱导培养基中培养，其油脂含量也很少超过自身干重的20％，因此一般不认为酿酒酵母是一种良好的产油微生物，也鲜有对酿酒酵母产油的研究。这主要是因为酿酒酵母在发酵培养过程中优先将有机碳源转化成生物量和乙醇而不是进行油脂积累，因此如果要用酿酒酵母进行油脂生产，有机碳源对油脂的得率很低，单位油脂生产的糖耗必然很高。同时酿酒酵母过低的油脂含量也不利于细胞内油脂的提取，导致提取率过低。上述原因都大幅度推高了酿酒酵母生产油脂的成本。
目前通过优化培养基，特别是控制碳氮比等来提高酿酒酵母的油脂含量是最为常用的方法。如杨实权等(杨实权,等.响应面法优化酿酒酵母产油脂条件.微生物学通报,2010,37(1):91-95.)报道通过响应面法实验对酿酒酵母的培养基进行优化，发现在葡萄糖15％(w/v，下同)，蛋白胨0.2％，酵母浸粉0.4％，柠檬酸0.471％，MgSO4·7H2O 0.1％，ZnSO4·7H2O 0.2％，CaCl2 0.025％，FeSO4·7H2O 0.005％的优化培养基中，培养4天后的酿酒酵母油脂含量最高可达14.55％。然而这一油脂含量与其他产油微生物相比，非常之低，根本不具有生产应用价值。He等(He Q,et al.Oleaginicity of the yeast strainSaccharomyces cerevisiae D5A.Biotechnology for Biofuels,2018,11(1):258)研究了一株酿酒酵母的高碳氮比培养基诱导培养，发现在优化的高有机碳浓度(50g/L)低氮浓度(5mM)的培养基发酵培养酿酒酵母，其油脂含量提高到20％。这表明高碳氮比的油脂诱导培养对于酿酒酵母油脂积累的强化作用仍然是非常有限的，根本无法满足工业生产油脂的要求(例如，一般的产油农作物和产油微生物的油含量在40％左右，如果低于这一值则认为产油性价比不高，不宜作为油脂生产途径)。近些年研究人员试图通过基因工程改造的手段提高酿酒酵母的油脂含量。但油脂产量也未得到显著提高(Kyung Ok Yu,et al.Developmentof a Saccharomyces cerevisiae strain for increasing the accumulation oftriacylglycerol as a microbial oil feedstock for biodiesel production usingglycerol as a substrate.Biotechnology&Bioengineering,2012,110(1):343-347)，同时基因工程微生物用于生产食品等原料的安全性还存在巨大争议，因此基因工程微生物生产食品类原料在短期内还难以实现商业化应用。
发明内容
针对上述现有技术，经长期的技术与实践探索，本发明提供一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用。本发明通过研究发现，在酿酒酵母发酵培养过程中，通过控制有机碳源的补加量，使发酵培养液中的有机碳源浓度持续维持在超低的水平，在这种状态下，酿酒酵母细胞内与乙醇合成相关的酶的活性因作用底物的匮乏而大幅降低，但与脂肪酸合成相关的酶的活性并不会受到显著影响，从而使有机碳源的流向偏向脂肪酸合成，最终使得酿酒酵母细胞内油脂的大量积累，有利于其工业化生产应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，所述培养方法包括：在酿酒酵母培养过程中，通过控制有机碳源的补加量，使培养液中的有机碳源浓度持续维持在超低水平，以促进酿酒酵母油脂的积累；其中，所述的培养液中有机碳源浓度持续维持在超低水平是指培养液中有机碳源浓度持续维持在≤1g/L。
本发明通过对酿酒酵母的碳代谢途径进行分析研究发现，其油脂含量低的主要原因是酿酒酵母会将有机碳源优先转化成乙醇，而不是油脂的基本构成单元脂肪酸。因此，要提高酿酒酵母的油脂含量，从有机碳源向乙醇和脂肪酸合成的分配入手，通过调控手段使有机碳源较少地流向乙醇的合成，而较多地流向脂肪酸的合成，是一个比较有效的强化酵母产油的方法，从而完成本发明。
本发明的第二个方面，提供上述培养方法获得的酿酒酵母和/或油脂。
其中，所述油脂包含棕榈油酸。
本发明的第三个方面，提供上述培养方法、酿酒酵母和/或油脂在如下任意一种或多种中的应用：
1)食品领域；
2)酿造领域；
3)医药领域。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1)上述技术方案提供了一种提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，通过控制有机碳源的补加量，使培养液中的有机碳源浓度持续维持在超低的水平，在这种状态下，有机碳源的流向向脂肪酸合成的一侧偏移，最终导致酿酒酵母细胞内油脂的大量积累，经试验证明，通过该方法可以使酿酒酵母的油脂含量达到细胞干重的50％。
2)需要说明的是，上述技术方案所提供的方法与与现有技术中通过高碳氮比促进微生物油脂积累的普遍方法并不相同，且其作用原理也是完全不同的。现有技术中普遍做法其作用原理是通过培养液中氮元素的缺乏抑制微生物的生长和蛋白质的合成，从而降低蛋白质在细胞干重中的占比，因此，相对地细胞干重中另外两种主要成分糖类和油脂的含量会得到提高。但上述普遍方法中的氮缺乏条件会导致培养液中的微生物细胞密度(即生物量)大幅度降低，进而导致油脂产量和油脂产率的降低。而上述技术方案提供的方法的作用原理是利用酿酒酵母细胞内与乙醇合成相关的酶的活性在有机碳因作用底物极度低下的情况下大幅降低，而与脂肪酸合成相关的酶的活性变化不大的特性来实现超低有机碳源浓度控制培养的油脂合成强化。因此，本发明所提供的方法完全区别于普遍方法。
3)从促进油脂积累的效果来看，上述技术方案所提供的方法可使酿酒酵母的油脂含量达到细胞干重的50％，而现有技术中的普遍方法通常只能使酿酒酵母的油脂含量达到细胞干重的20％以下，因此上述技术方案是普遍方法所能达到的效果的2.5倍以上。同时，上述技术方案所提供的方法可以使酿酒酵母的细胞密度达到40g/L以上，而普遍方法由于其对生长的限制作用而只能使酿酒酵母的细胞密度达到4g/L左右(由本发明实施例提供)，因此，通过简单计算可知，上述技术方案所能达到的油脂产量为20g/L，而普遍方法所能达到的油脂产量不足0.8g/L，可见上述技术方案所提供的方法的油脂产量是现有技术中普遍方法的25倍以上。同时，在另一项以酿酒酵母产油为目的的研究中，尽管对酿酒酵母进行了基因改造以强化其油脂合成途径，但其油脂含量只有11.6％，油脂产量也仅有0.023g/L(Kyung Ok Yu,et al.Development of a Saccharomyces cerevisiae strain forincreasing the accumulation of triacylglycerol as a microbial oil feedstockfor biodiesel production using glycerol as a substrate.Biotechnology&Bioengineering,2012,110(1):343-347)，上述技术方案其产油效果是其的870倍。这一方面再次说明了酿酒酵母油脂积累的困难程度，另一方面也凸显了上述技术方案的有益技术效果。
4)上述技术方案所提供的方法还可以避免产油酿酒酵母菌株大规模筛选所具有的工作量庞大且结果具有随机性和不确定性的不足，对酿酒酵母菌株具有广泛适用性，因此更具实际推广应用之价值。
5)上述技术方案由于可以大幅提高酿酒酵母的油脂含量，因此在油脂提取过程中可以采用更简单的油脂提取工艺，也可以获得更高的油脂提取率，并可降低油脂提取成本，提高有机碳源向目标产物的转化率，降低培养成本，有利于实际化生产应用。
6)酿酒酵母的油脂中富含非常稀有且价格昂贵的棕榈油酸，其对糖尿病、代谢功能综合征、高血脂、高血压等疾病具有显著的预防和治疗效果。但如前所述，目前棕榈油酸主要来源于难以商业化养殖或种植的野生动植物资源，因此由于资源问题而导致市场发展受限。而糖尿病、代谢功能综合征、高血脂、高血压等疾病的发生发展日趋严峻，因此上述技术方案提供的方法恰好可以解决棕榈油酸资源不足的问题，具有极大的工业化应用价值，同时可以产生极其重要的社会效益和经济效益。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中不同有机碳源浓度对酿酒酵母生长和油脂含量的影响；
图2为本发明实施例2中超低浓度有机碳源和氮缺乏对酿酒酵母生长和油脂含量影响的对比；
图3为本发明实施例3中厌氧和好氧培养条件下超低浓度有机碳源对酿酒酵母生长和油脂含量的影响；
图4为本发明实施例4中不同种类的有机碳源在超低浓度下对酿酒酵母生长和油脂含量的影响；
图5为本发明实施例5中在超低浓度有机碳源条件下不同培养时间的酿酒酵母油脂含量；
图6为本发明实施例6中在不同培养阶段开始维持超低浓度有机碳源对酿酒酵母油脂含量的影响；
图7为本发明实施例7中不同酿酒酵母菌株在超低浓度有机碳源条件下的油脂含量；
图8为本发明实施例8中在超低浓度有机碳源条件下不同培养基组成对酿酒酵母油脂含量的影响；
图9为本发明实施例9中超低浓度有机碳源条件下酿酒酵母的脂肪酸组成。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，现有技术中采用酿酒酵母生产油脂的方法普遍存在产油脂率过低，无法满足工业化生产需求等问题。
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，所述培养方法包括：在酿酒酵母培养过程中，通过控制有机碳源的补加量，使培养液中的有机碳源浓度持续维持在超低水平，以促进酿酒酵母油脂的积累；其中，所述的培养液中有机碳源浓度持续维持在超低水平是指培养液中有机碳源浓度持续维持在≤1g/L。
本发明通过对酿酒酵母的碳代谢途径进行分析研究发现，其油脂含量低的主要原因是酿酒酵母会将有机碳源优先转化成乙醇，而不是油脂的基本构成单元脂肪酸。因此，要提高酿酒酵母的油脂含量，从有机碳源向乙醇和脂肪酸合成的分配入手，通过调控手段使有机碳源较少地流向乙醇的合成，而较多地流向脂肪酸的合成，是一个比较有效的强化酵母产油的方法，从而完成本发明。
本发明的又一具体实施方式中，所述酿酒酵母学名为Saccharomycescerevisiae，又称面包酵母，或者出芽酵母，或者通俗地称为啤酒酵母，或者红酒酵母，或者白酒酵母，或者葡萄酒酵母，或者果酒酵母。
本发明的又一具体实施方式中，所述的培养过程包括厌氧发酵培养过程和/或好氧发酵培养过程。
本发明的又一具体实施方式中，所述培养方法还包括：
在发酵培养基中进行酿酒酵母的培养，温度控制为14～38℃，转速控制为20～1000rpm，空气通气量为0.1～5vvm，pH为3～6.5。
其中，所述发酵培养基含有酵母浸粉0～7％(优选为1～7％)，蛋白胨0～7％(优选为1～7％)。
本发明的又一具体实施方式中，所述有机碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、戊糖、糖蜜、甘油醛、醋酸盐、淀粉及其水解糖、纤维素水解糖中的一种和/或多种以任意比例混合而成的混合物。
本发明的又一具体实施方式中，所述的培养液中有机碳源浓度持续维持在超低水平这一过程可以起始于整个培养过程的任何阶段；以酿酒酵母生长曲线为例，即可以是在酿酒酵母迟滞期、对数生长期、稳定期或衰亡期中的任意时期。
本发明的又一具体实施方式中，所述的培养液中有机碳源浓度持续维持在超低水平这一过程的持续时间为1-10天。
本发明的又一具体实施方式中，在培养过程中，除有机碳源外，既可以向培养液中添加任何微生物培养所需的营养物质和/或微量元素，也可以不添加任何其它物质。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述培养方法获得的酿酒酵母和/或油脂。
本发明的又一具体实施方式中，所述油脂包含棕榈油酸。如前所述，棕榈油酸，其对糖尿病、代谢功能综合征、高血脂、高血压等疾病具有显著的预防和治疗效果。本发明提供的方法恰好可以解决棕榈油酸资源不足的问题，因此具有极大的工业化应用价值，同时可以产生极其重要的社会效益和经济效益。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述培养方法、酿酒酵母和/或油脂在如下任意一种或多种中的应用：
1)食品领域；
2)酿造领域；
3)医药领域。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
以下实施例中，实施例1～6、8、9采用的酿酒酵母的编号为SC-17，购买自弗曼迪斯酵母公司，商品型号为S-23。
实施例1
在不同有机碳源浓度条件下，测定酿酒酵母的生长情况和油脂含量，具体实施步骤如下：
以葡萄糖为有机碳源，通过连续流加补料的方式培养酿酒酵母，在培养过程中用生物传感器实时测定培养液中葡萄糖的浓度，并调整葡萄糖母液的流加速度，使培养液中葡萄糖的浓度分别维持在0.1g/L、0.5g/L、1g/L、10g/L、20g/L、50g/L，持续培养4天后测定培养液中酿酒酵母的生物量(重量法)及其油脂含量(氯仿-甲醇法)。其他培养条件为：接种量5％，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，温度28℃，转速1000rpm，空气通气量5vvm，pH6。需要说明的是，10g/L至50g/L的葡萄糖浓度是目前微生物培养常用的浓度。
结果如图1所示，在葡萄糖维持浓度小于等于1g/L的培养组中，酿酒酵母的生物量可以达到40g/L以上，油脂含量为细胞干重的50％左右。而在葡萄糖浓度维持较高的其他培养组中，酿酒酵母的生物量只有15g/L到24g/L，油脂含量只有细胞干重的7％到11％，通过计算可知，超低浓度葡萄糖培养组中酿酒酵母的油脂产量是通过微生物常用培养方法所获得的油脂产量的8.3倍至21倍。
实施例2
在超低浓度有机碳源和氮缺乏情况下，对酿酒酵母生长和油脂含量影响的对比，具体实施步骤如下：
以葡萄糖为有机碳源，通过连续流加补料的方式培养酿酒酵母，在培养过程中用生物传感器实时测定培养液中葡萄糖的浓度，并调整葡萄糖母液的流加速度，使培养液中葡萄糖的浓度维持在0.5g/L。同时，以不添加氮源的培养组作为对照，通过一次添加150g/L的葡萄糖培养酿酒酵母。持续培养4天后测定培养液中酿酒酵母的生物量(重量法)及其油脂含量(氯仿-甲醇法)。其他培养条件为：接种量5％，酵母浸粉0％，蛋白胨7％，但氮缺乏培养组不添加酵母浸粉和蛋白胨，温度28℃，转速200rpm，空气通气量0.5vvm，pH6。
结果如图2所示，在葡萄糖维持浓度为0.5g/L的超低浓度有机碳源培养组中，酿酒酵母的生物量可以达到44g/L，油脂含量为细胞干重的50％。而在微生物产油诱导的普遍培养方法，即氮缺乏培养组中，酿酒酵母的生物量只有4g/L，油脂含量为18％，通过计算可知，超低浓度葡萄糖培养组中酿酒酵母的油脂产量是通过微生物常用诱导产油方法所获得的油脂产量的30.6倍。
实施例3
在厌氧和好氧培养条件下，研究超低浓度有机碳源对酿酒酵母生长和油脂含量的影响，具体实施步骤如下：
以葡萄糖为有机碳源，分别在厌氧和好氧条件下，通过连续流加补料的方式培养酿酒酵母，在培养过程中用生物传感器实时测定培养液中葡萄糖的浓度，并调整葡萄糖母液的流加速度，使培养液中葡萄糖的浓度维持在0.5g/L。持续培养4天后测定培养液中酿酒酵母的生物量(重量法)及其油脂含量(氯仿-甲醇法)。其他培养条件为：接种量5％，酵母浸粉7％，蛋白胨0％，温度38℃，转速200rpm，pH3。其中，厌氧条件下不通空气，好氧条件下空气通气量为0.1vvm。
结果如图3所示，在好氧条件下，葡萄糖维持浓度为0.5g/L的超低浓度有机碳源培养组中，酿酒酵母的生物量可以达到44g/L，油脂含量为细胞干重的50％。在厌氧条件下，葡萄糖维持浓度为0.5g/L的超低浓度有机碳源培养组中，酿酒酵母的生物量为28g/L，油脂含量为48％。由此可见，厌氧条件下虽然生物量有所降低，但油脂积累量依然可以达到很高的水平。在厌氧条件下，酿酒酵母油脂积累量极低，只有细胞干重的5％左右。因此，本方法在酿酒酵母的厌氧和好氧培养条件下都可极为显著地促进其油脂的积累，具有极大的有益效果。
实施例4
不同种类的有机碳源在超低浓度下，对酿酒酵母生长和油脂含量的影响，具体实施步骤如下：
分别以葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、纤维素水解糖为有机碳源，通过连续流加补料的方式培养酿酒酵母，在培养过程中用生物传感器法或比色法实时测定培养液中有机碳源的浓度，并调整有机碳源母液的流加速度，使培养液中有机碳源的浓度维持在0.5g/L，持续培养4天后测定培养液中酿酒酵母的生物量(重量法)及其油脂含量(氯仿-甲醇法)。其他培养条件为：接种量5％，酵母浸粉3％，蛋白胨3％)，温度14℃，转速20rpm，空气通气量0.5vvm，pH6.5。
结果如图4所示，在各种有机碳源条件下，维持超低浓度的有机碳源浓度都可以使酿酒酵母的生物量达到40g/L左右，油脂含量达到50％左右。因此，本方法对各种常用的有机碳源都具有适用性。
实施例5
在超低浓度有机碳源条件下，不同培养时间的酿酒酵母油脂含量，具体实施步骤如下：
以葡萄糖为有机碳源，通过连续流加补料的方式培养酿酒酵母，在培养过程中用生物传感器实时测定培养液中葡萄糖的浓度，并调整葡萄糖母液的流加速度，使培养液中葡萄糖的浓度维持在0.5g/L，持续培养10天，每天测定培养液中酿酒酵母的油脂含量(氯仿-甲醇法)。其他培养条件为：接种量5％，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，温度28℃，转速200rpm，空气通气量0.5vvm，pH5。
结果如图5所示，培养初始时酿酒酵母油脂含量只有5％，培养1天后油脂含量增加至20％，2天后增加至40％左右，之后油脂含量维持在50％左右。由此可知，在超低浓度有机碳源持续较短的时间时就可以大幅增加酿酒酵母的油脂含量。
实施例6
在不同培养阶段开始维持超低浓度有机碳源对酿酒酵母油脂含量的影响，具体实施步骤如下：
以葡萄糖为有机碳源，分别在酿酒酵母的不同生长阶段为起点，通过连续流加补料的方式继续培养酿酒酵母，在培养过程中用生物传感器实时测定培养液中葡萄糖的浓度，并调整葡萄糖母液的流加速度，使培养液中葡萄糖的浓度维持在0.5g/L，持续培养4天后测定培养液中酿酒酵母的油脂含量(氯仿-甲醇法)。其他培养条件为：接种量5％，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，温度28℃，转速200rpm，空气通气量0.5vvm，pH6。其中，所述的不同培养阶段包括：迟滞期、对数生长期、稳定期以及衰亡期。
结果如图6所示，分别在酿酒酵母的不同生长阶段为起点，通过维持超低浓度的有机碳源继续培养酿酒酵母，均可以使其油脂含量达到50％左右。
实施例7
不同酿酒酵母菌株在超低浓度有机碳源条件下的产油脂含量的情况，具体实施步骤如下：
以葡萄糖为有机碳源，通过连续流加补料的方式培养40株酿酒酵母菌株，这些酿酒酵母菌株均通过商业渠道购买得到，分别编号为SC1至SC40，其中，SC1～SC6购买自安琪酵母公司(SY葡萄酒酵母、RW葡萄酒酵母、普通型酵母、低糖型酵母、耐高糖型酵母、白酒酵母)，SC7～SC17购买自弗曼迪斯酵母公司(S-33、BE-134、S-04、US-05、BE-256、WB-06、T-58、K-97、W-34/70、S-189、S-23)，SC18～SC32购买自红树杰克酵母公司(M44、M05、M21、M76、M36、M20、M02、M29、M42、M47、M41、M54、M84、M15、M31)，SC33～SC40购买自拉曼酵母公司(型号分别为温莎英式艾尔、赛森、慕尼黑、比利时修道院、钻石、西海岸BRY-97、伦敦ESD、诺丁汉)。在培养过程中用生物传感器实时测定培养液中葡萄糖的浓度，并调整葡萄糖母液的流加速度，使培养液中葡萄糖的浓度维持在0.5g/L，持续培养4天后测定培养液中酿酒酵母的油脂含量(氯仿-甲醇法)。其他培养条件为：接种量5％，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，温度28℃，转速200rpm，空气通气量0.5vvm，pH6。
结果如图7所示，通过维持超低浓度的有机碳源培养40株不同编号的酿酒酵母菌株，这些酿酒酵母菌株的油脂含量均可达到50％左右。说明本方法对酿酒酵母菌株具有广泛适用性。
实施例8
超低浓度有机碳源条件下，不同培养基组成对酿酒酵母油脂含量的影响，具体实施步骤如下：
以葡萄糖为有机碳源，在不同的培养基中通过连续流加补料的方式培养酿酒酵母，在培养过程中用生物传感器实时测定培养液中葡萄糖的浓度，并调整葡萄糖母液的流加速度，使培养液中葡萄糖的浓度维持在0.5g/L，持续培养4天后测定培养液中酿酒酵母的油脂含量(氯仿-甲醇法)。其中，不同的培养基分别为：YPD培养基(即除葡萄糖外还含有酵母浸粉1％，蛋白胨2％)，Glu培养基(只含有葡萄糖，不添加其他任何营养物质的培养基)，CZAPCK培养基(NaNO3 3g/L、K2HPO4 1g/L、KCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L)，LB培养基(酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L)。其他培养条件为：接种量5％，温度28℃，转速200rpm，空气通气量0.5vvm，pH6。
结果如图8所示，通过维持超低浓度的有机碳源在各种培养基中培养酿酒酵母，其油脂含量均可达到50％左右。由此可见，本方法对各种培养基具有广泛的适用性。
实施例9
在超低浓度有机碳源条件下，研究酿酒酵母的脂肪酸组成，具体实施步骤如下：
以葡萄糖为有机碳源，通过连续流加补料的方式培养酿酒酵母，在培养过程中用生物传感器实时测定培养液中葡萄糖的浓度，并调整葡萄糖母液的流加速度，使培养液中葡萄糖的浓度维持在0.5g/L，持续培养4天后测定酿酒酵母油脂的脂肪酸组成(气相色谱法)。其他培养条件为：接种量5％，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，温度28℃，转速200rpm，空气通气量0.5vvm，pH6。
结果如图9所示，酿酒酵母油脂的脂肪酸组成中以棕榈油酸(C16:1)为主，其占总脂肪酸的53％左右。如前所述，棕榈油酸是一种非常稀有且昂贵的单不饱和脂肪酸，它在医药领域具有非常重要的应用价值。而采用本发明所提供的方法可以大幅提高富含棕榈油酸的酿酒酵母油脂含量，从而有效解决棕榈油酸资源不足的问题，因此具有极大的工业化应用价值，也具有极佳的社会效益和经济效益。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (4)

1.一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法，所述培养方法包括：在酿酒酵母培养过程中，使培养液中的有机碳源浓度持续维持在超低水平，其中，所述的培养液中有机碳源浓度持续维持在超低水平是指培养液中有机碳源浓度持续维持在≤1g/L，并且≥0.1g/L；
在发酵培养基中进行酿酒酵母的培养，温度控制为14~38℃，转速控制为20~1000rpm，空气通气量为0.1~5vvm，pH为3~6.5；
其中，所述发酵培养基还含有蛋白胨0~7%，酵母浸粉0~7%；
所述有机碳源包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糖蜜、淀粉、纤维素水解糖中的一种或多种；
所述的培养液中有机碳源浓度持续维持在超低水平这一过程的持续时间为2-10天。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，通过控制有机碳源的补加量控制培养液中的有机碳源浓度。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，培养过程包括厌氧发酵培养过程和/或好氧发酵培养过程。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的培养液中有机碳源浓度持续维持在超低水平这一过程起始于整个培养过程的任一阶段。
CN202011299929.0A 2020-11-19 2020-11-19 一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用 Active CN112280696B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011299929.0A CN112280696B (zh) 2020-11-19 2020-11-19 一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011299929.0A CN112280696B (zh) 2020-11-19 2020-11-19 一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112280696A CN112280696A (zh) 2021-01-29
CN112280696B true CN112280696B (zh) 2022-11-15

Family

ID=74398649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011299929.0A Active CN112280696B (zh) 2020-11-19 2020-11-19 一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112280696B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114032259B (zh) * 2021-12-15 2023-10-10 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种酵母菌的高密度发酵及十六碳烯酸提取方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105441524A (zh) * 2016-01-27 2016-03-30 扬州大学 一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法
CN110923268A (zh) * 2019-12-11 2020-03-27 北京工商大学 酿酒酵母y3401的培养方法及其在白酒酿造中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5328984B2 (zh) * 1973-11-09 1978-08-17
JPH0683672B2 (ja) * 1986-04-28 1994-10-26 鐘淵化学工業株式会社 醗酵法によるパルミトレイン酸の製造法
CN102311927A (zh) * 2011-08-19 2012-01-11 华南理工大学 一种酿酒酵母高密度发酵培养基和酿酒酵母高密度发酵方法
CN103773694B (zh) * 2012-10-23 2016-08-03 中国石油化工股份有限公司 一种高效培养含油微生物的方法
CN103965304B (zh) * 2013-01-31 2016-06-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种产油酵母脂滴蛋白及其编码基因与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105441524A (zh) * 2016-01-27 2016-03-30 扬州大学 一种通过共培养提高以蔗糖为碳源下微藻油脂产率的方法
CN110923268A (zh) * 2019-12-11 2020-03-27 北京工商大学 酿酒酵母y3401的培养方法及其在白酒酿造中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112280696A (zh) 2021-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yuangsaard et al. Selection and characterization of a newly isolated thermotolerant Pichia kudriavzevii strain for ethanol production at high temperature from cassava starch hydrolysate
Yue et al. The influence of nitrogen sources on ethanol production by yeast from concentrated sweet sorghum juice
EP3214168B1 (en) Saccharomyces cerevisiae capable of being co-fermented by multiple carbon sources and application thereof
CN102351605B (zh) 珍稀食药用菌绣球菌的液体发酵培养方法及其专用培养基
CN102102084A (zh) 东方伊萨酵母菌、其组合物和应用
CN102210449A (zh) 干巴菌的液体深层发酵培养及其调味品和富硒产品的制备方法
Tian et al. A symbiotic yeast to enhance heterotrophic and mixotrophic cultivation of Chlorella pyrenoidosa using sucrose as the carbon source
Lai et al. Optimization of submerged culture conditions for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides from Lignosus rhinocerus
CN102630490A (zh) 一种提高虫草素含量的蛹虫草菌丝体的人工培养方法
Camelia et al. Yeast isolation and selection for bioethanol production from inulin hydrolysates
CN1837352A (zh) 高密度培养异养小球藻的方法
CN104278107A (zh) 一种基于溶氧调控高山被孢霉发酵产花生四烯酸油脂的方法
CN112280696B (zh) 一种通过维持超低浓度有机碳源提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及其应用
CN112391421A (zh) 一种通过调节酿酒酵母发酵液总盐含量提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及高产油酿酒酵母
CN112280697B (zh) 一种通过调控发酵培养液pH提高酿酒酵母油脂含量的培养方法及高产油酿酒酵母
TWI385248B (zh) 一種蟲草屬培養基之配方
Xu et al. The effect of exopolysaccharide biosynthesis and related enzyme activities of Grifola frondosa by the addition of ethanol extracts from traditional Chinese medicine, Gastrodia tuber
Bechem et al. Characterization of palm wine yeasts using osmotic, ethanol tolerance and the isozyme polymorphism of alcohol dehydrogenase
CN1269981A (zh) 营养保健蜜醋生产方法
Abi et al. Improved laminaribiose phosphorylase production by Euglena gracilis in a bioreactor: a comparative study of different cultivation methods
CN101948759A (zh) 一种深黄被孢霉及其应用
Sarkar et al. Optimization of citric acid production from aspergillus niger using pineapple waste as feedstock in submerged fermentation
CN114276937A (zh) 一种利用山药作为碳源发酵蝙蝠蛾拟青霉的方法
CN105624212B (zh) 一种以微藻为原料生产2,3-丁二醇的方法
CN112391299B (zh) 亚硫酸盐联合甘油在提高酿酒酵母油脂含量中的应用及方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant