CN110564707B - 玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1及其编码基因和应用 - Google Patents

玉米赤霉烯酮水解酶突变体zhdm1及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用。玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1，通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的第136‑142位氨基酸突变得到。本发明的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的酶活力是野生型的2.9倍，因此，本发明高酶活力突变体能够满足能源、食品和饲料等领域中对于玉米赤霉烯酮降解活性的要求，具有广阔的应用前景。

Description

玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)又被称为F-2毒素，它是由多种镰刀菌属产生的非甾体、具有类雌激素性质的霉菌毒素。ZEN的雌激素效应毒性不仅仅表现在损害雌性动物生殖能力，而且能引起雄性动物生殖系统的损害。此外，高剂量ZEN还具有肝肾毒性、肠道毒性、免疫毒性及其霉菌毒素的联合毒性，严重危害动物健康。
微生物降解法消除ZEN污染是利用微生物在代谢过程中产生的酶与ZEN作用，破坏ZEN分子的毒性基团，使其被降解或转化为无毒产物的过程。生物降解法降解ZEN专一性强、ZEN分子被转化效率高、不会引起环境污染，并且能够保留饲料原有营养价值。但目前所发现的玉米赤霉烯酮水解酶活性均较低，阻碍了玉米赤霉烯酮水解酶的大规模工业化生产及应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1。
本发明的再一目的在于提供上述突变体的编码基因。
本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。
本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。
本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的应用。
根据本发明的具体实施方式，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的第136-142位氨基酸由ASVTGME突变为DILLHIH得到，其中，野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MSTTRATKTVTTKDGIKWHVEQEGNGPDIVLVPDGLGECQMFDKPMSIIAASGFRVTTFDMPGMSRSRDAPPETYRDVTGHKLAGYVDTLLEELKIPIASVWGCSSGATTVLALCAAFPERVRNAMPHELPTVNPASVTGMEEKDPAVISQEMAAVSRSISGGTEAWDALGPEVHARLHDNYVRWARGYPVTIPPSAPTKSEVLHKRPVDWTVGGGTPTAMFFDNIVIAVKEGLNIGLLPGGHFPYVSHPEAFAEYVVETCRKYI
玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MSTTRATKTVTTKDGIKWHVEQEGNGPDIVLVPDGLGECQMFDKPMSIIAASGFRVTTFDMPGMSRSRDAPPETYRDVTGHKLAGYVDTLLEELKIPIASVWGCSSGATTVLALCAAFPERVRNAMPHELPTVNPDILLHIHEKDPAVISQEMAAVSRSISGGTEAWDALGPEVHARLHDNYVRWARGYPVTIPPSAPTKSEVLHKRPVDWTVGGGTPTAMFFDNIVIAVKEGLNIGLLPGGHFPYVSHPEAFAEYVVETCRKYI
玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ATGTCCACCACCAGAGCCACCAAGACTGTTACCACCAAGGATGGAATTAAGTGGCATGTTGAGCAAGAAGGAAACGGTCCAGACATTGTGTTGGTTCCAGATGGTTTGGGTGAGTGTCAAATGTTTGATAAGCCCATGTCCATTATTGCAGCCTCCGGTTTTAGAGTCACTACCTTTGATATGCCAGGTATGAGTAGATCCAGAGATGCTCCTCCAGAAACTTACAGAGATGTTACCGGTCATAAGCTGGCTGGTTACGTTGACACTTTGCTTGAGGAATTGAAGATTCCAATTGCTTCTGTTTGGGGTTGTTCCTCTGGTGCTACTACTGTTCTGGCCTTGTGTGCTGCTTTTCCAGAAAGAGTTAGAAATGCCATGCCACACGAGTTGCCAACTGTTAACCCAGATATTTTACTTCATATTCATGAGAAGGACCCTGCTGTTATTTCTCAAGAAATGGCTGCTGTTTCAAGATCAATTAGTGGTGGTACTGAAGCCTGGGATGCTTTAGGACCAGAAGTTCATGCTAGACTTCATGATAATTACGTTAGATGGGCTAGAGGTTACCCAGTGACTATTCCACCATCTGCCCCAACCAAGTCTGAGGTTTTGCATAAGAGACCAGTTGATTGGACAGTTGGTGGTGGTACCCCAACTGCTATGTTTTTTGATAATATTGTCATCGCTGTCAAGGAAGGTTTGAACATTGGTTTGTTGCCAGGTGGTCATTTCCCATACGTTTCTCATCCTGAAGCTTTTGCTGAATACGTTGTTGAGACTTGTAGAAAGTACATTTAA
上述序列包含终止子，共798bp。
本发明还提供包含上述编码基因的重组表达载体，优选为pPICZ(α)A-zh607-AH。
本发明还提供包含上述编码基因的重组菌株，优选为毕赤酵母X33(pPICZ(α)A-zh607-AH)。
根据本发明具体实施方式的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的制备方法，包括以下步骤：
(1)用包含玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
(2)培养重组菌株，诱导表达玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1；
(3)分离并纯化所表达的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1。
本发明还提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的应用，尤其是在能源、食品和饲料领域。
本发明的有益效果：
本发明的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的酶活力由野生型的4940U/mg提高到了14419U/mg，是野生型的2.9倍，因此，本发明高酶活力突变体能够满足能源、食品和饲料等领域中对于玉米赤霉烯酮降解活性的要求，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1显示赤霉烯酮水解酶野生型及突变体在毕赤酵母X33中表达后的SDS-PAGE电泳检测结果。
具体实施方式
1、菌株及载体：本发明的表达宿主Pichia pastoris X33，表达质粒载体pPICZ(α)A。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrog公司，其它都为国产试剂。
3、大肠杆菌培养基LLB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl，pH自然)。毕赤酵母培养基YPD(Yeast Extract 1％,Trytone 2％，Glucose 2％pH自然)；BMGY(YeastExtract 1％,Trytone 2％,YNB10％,生物素0.1％,pH自然)；BMMY(Yeast Extract 1％，Trytone 2％，甲醇0.5％，YNB 10％，生物素0.1％，pH自然)。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1含野生型赤霉烯酮水解酶基因的重组菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)的制备
1.1扩增赤霉烯酮水解酶蛋白野生型ZH607的核酸序列zh607
经密码子优化后，得到赤霉烯酮水解酶ZH607的编码基因zh607。采用PCR的方法扩增zh607基因及载体pPICZ(α)A核酸片段，通过重组试剂盒将两者连接，获得重组质粒pPICZ(α)A-zh607，并转化毕赤酵母X33，获得重组毕赤酵母菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)。
PCR所用引物如下：
表1野生型赤霉烯酮水解酶及载体扩增特异性引物
Figure BDA0002188222010000041
其中，zh607-pPICZ(α)A-F及zh607-pPICZ(α)A-R用于扩增赤霉烯酮水解酶野生型ZH607的基因编码序列；pPICZ(α)A-zh607-F及pPICZ(α)A-zh607-R用于扩增可与zh607基因重组的pPICZ(α)A载体核酸片段。
扩增结束后，将PCR产物进行核酸电泳检测，zh607和pPICZ(α)A条带大小分别为835bp和3579bp(加引物)，分别回收纯化。
1.2构建重组菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)
将回收的zh607与pPICZ(α)A基因片段通过试剂盒重组酶进行重组连接，然后将重组产物转化大肠杆菌TransⅠ感受态，并涂布于LLB(含100μg/mL zeocin)进行筛选。
待测序正确后，利用SacI限制性内切酶将重组质粒pPICZ(α)A-zh607进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞X33进行诱导表达，得到重组表达菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)。
实施例2含突变型赤霉烯酮水解酶基因的重组菌株X33(pPICZ(α)A-zh607-AH)的制备
2.1重组质粒pPICZ(α)A-zh607-AH的构建
经优化突变位点设计为将136-142位的ASVTGME替换为DILLHIH，通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得赤霉烯酮水解酶突变质粒pPICZ(α)A-zh607-AH。所用引物如表2所示：
表2突变体玉米赤霉烯酮水解酶特异性引物
Figure BDA0002188222010000051
2.2构建重组菌株X33(pPICZ(α)A-zh607-AH)
利用SacI将重组质粒pPICZ(α)A-zh607-AH进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞X33进行诱导表达，得到重组表达菌株X33(pPICZ(α)A-zh607-AH)。
实施例3赤霉烯酮水解酶蛋白野生型ZH607及突变体ZHDM1的获得
3.1蛋白ZH607及ZHDM1的诱导表达
将得到的重组表达菌株X33(pPICZ(α)A-zh607)及X33(pPICZ(α)A-zh607-AH)接种至YPD培养基中进行种子培养，200rpm，30℃培养48h后，以1％接种量转接至BMGY培养基中，200rpm，30℃培养48h，富集足够的菌体后收集菌体并加入到含有1％甲醇的BMMY培养基中进行诱导表达。
2.蛋白ZH607及ZHDM1的纯化
将诱导表达后的菌液12000rpm，10min离心，收集上清进行浓缩，再用10mM磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调pH至7.6)进行透析，然后将透析后的酶液进行离子交换层析，A液为10mM磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调pH至7.6)，B液为A液加1M Nacl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE，蛋白ZH607及ZHDM1蛋白纯化结果见图1。
实施例4玉米赤霉烯酮水解酶ZH607及突变体ZHDM1的活性检测
诱导表达后对玉米赤霉烯酮水解酶ZH607及突变体ZHDM1进行纯化及酶活的测定。
酶活的测定方法(ZEN由DMSO溶)：
Figure BDA0002188222010000052
Figure BDA0002188222010000061
37℃反应0.5h，加入800μL DMSO终止反应。
终止反应后通过HPLC检测对照组及实验组ZEN剩余峰面积。
酶活力单位(U)：在37℃，反应0.5h条件下，在1h内能转化1μg ZEN的酶量。
酶活计算(每毫升酶液所含酶活力单位)：反应体系中ZEN初始含量*(对照组峰面积-实验组峰面积)/对照组峰面积*2*稀释倍数*10。
在pH8.0,35℃的最适条件下对纯化的玉米赤霉烯酮水解酶ZH607和突变体ZHDM1进行比活性测定。经HPLC检测，ZH607的比活力为4940U/mg,突变体ZHDM1的比活力为14419U/mg，经定点突变，突变体ZHDM1的酶活力是野生型的2.9倍。
实施例5玉米赤霉烯酮水解酶野生型和突变体的基本特性
诱导表达后对ZH607、ZHDM1粗酶液进行纯化并测定基本性质。
在pH 5.0-11.0，37℃的条件下测定，ZH607、ZHDM1的最适pH,反应时间为30min,使用的缓冲液为：130mM的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH 5.0-7.0)、130mM的Tris-HCl(pH 8.0)和130mM的甘氨酸-NaOH(pH 9.0-11.0)。为测定pH稳定性，将纯化后的酶液在37℃,pH 5.0的条件下孵育1h,在标准条件下(pH 8.0，37℃，反应30min)测定其剩余活性。反应测定具体方法如实施例4所示。
在25℃-55℃的温度范围，pH 8.0的条件下反应30min测定温度对纯化ZH607、ZHDM1活性的影响。
结果显示，ZH607、ZHDM1的最适pH为8.0，最适温度均为35℃。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Thr Thr Arg Ala Thr Lys Thr Val Thr Thr Lys Asp Gly Ile
1 5 10 15
Lys Trp His Val Glu Gln Glu Gly Asn Gly Pro Asp Ile Val Leu Val
20 25 30
Pro Asp Gly Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Lys Pro Met Ser Ile
35 40 45
Ile Ala Ala Ser Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met
50 55 60
Ser Arg Ser Arg Asp Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Arg Asp Val Thr Gly
65 70 75 80
His Lys Leu Ala Gly Tyr Val Asp Thr Leu Leu Glu Glu Leu Lys Ile
85 90 95
Pro Ile Ala Ser Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Thr Thr Val Leu
100 105 110
Ala Leu Cys Ala Ala Phe Pro Glu Arg Val Arg Asn Ala Met Pro His
115 120 125
Glu Leu Pro Thr Val Asn Pro Ala Ser Val Thr Gly Met Glu Glu Lys
130 135 140
Asp Pro Ala Val Ile Ser Gln Glu Met Ala Ala Val Ser Arg Ser Ile
145 150 155 160
Ser Gly Gly Thr Glu Ala Trp Asp Ala Leu Gly Pro Glu Val His Ala
165 170 175
Arg Leu His Asp Asn Tyr Val Arg Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Val Thr
180 185 190
Ile Pro Pro Ser Ala Pro Thr Lys Ser Glu Val Leu His Lys Arg Pro
195 200 205
Val Asp Trp Thr Val Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Met Phe Phe Asp
210 215 220
Asn Ile Val Ile Ala Val Lys Glu Gly Leu Asn Ile Gly Leu Leu Pro
225 230 235 240
Gly Gly His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Ala Phe Ala Glu Tyr
245 250 255
Val Val Glu Thr Cys Arg Lys Tyr Ile
260 265
<210> 2
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Thr Thr Arg Ala Thr Lys Thr Val Thr Thr Lys Asp Gly Ile
1 5 10 15
Lys Trp His Val Glu Gln Glu Gly Asn Gly Pro Asp Ile Val Leu Val
20 25 30
Pro Asp Gly Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Lys Pro Met Ser Ile
35 40 45
Ile Ala Ala Ser Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met
50 55 60
Ser Arg Ser Arg Asp Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Arg Asp Val Thr Gly
65 70 75 80
His Lys Leu Ala Gly Tyr Val Asp Thr Leu Leu Glu Glu Leu Lys Ile
85 90 95
Pro Ile Ala Ser Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Thr Thr Val Leu
100 105 110
Ala Leu Cys Ala Ala Phe Pro Glu Arg Val Arg Asn Ala Met Pro His
115 120 125
Glu Leu Pro Thr Val Asn Pro Asp Ile Leu Leu His Ile His Glu Lys
130 135 140
Asp Pro Ala Val Ile Ser Gln Glu Met Ala Ala Val Ser Arg Ser Ile
145 150 155 160
Ser Gly Gly Thr Glu Ala Trp Asp Ala Leu Gly Pro Glu Val His Ala
165 170 175
Arg Leu His Asp Asn Tyr Val Arg Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Val Thr
180 185 190
Ile Pro Pro Ser Ala Pro Thr Lys Ser Glu Val Leu His Lys Arg Pro
195 200 205
Val Asp Trp Thr Val Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ala Met Phe Phe Asp
210 215 220
Asn Ile Val Ile Ala Val Lys Glu Gly Leu Asn Ile Gly Leu Leu Pro
225 230 235 240
Gly Gly His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Ala Phe Ala Glu Tyr
245 250 255
Val Val Glu Thr Cys Arg Lys Tyr Ile
260 265
<210> 3
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtccacca ccagagccac caagactgtt accaccaagg atggaattaa gtggcatgtt 60
gagcaagaag gaaacggtcc agacattgtg ttggttccag atggtttggg tgagtgtcaa 120
atgtttgata agcccatgtc cattattgca gcctccggtt ttagagtcac tacctttgat 180
atgccaggta tgagtagatc cagagatgct cctccagaaa cttacagaga tgttaccggt 240
cataagctgg ctggttacgt tgacactttg cttgaggaat tgaagattcc aattgcttct 300
gtttggggtt gttcctctgg tgctactact gttctggcct tgtgtgctgc ttttccagaa 360
agagttagaa atgccatgcc acacgagttg ccaactgtta acccagatat tttacttcat 420
attcatgaga aggaccctgc tgttatttct caagaaatgg ctgctgtttc aagatcaatt 480
agtggtggta ctgaagcctg ggatgcttta ggaccagaag ttcatgctag acttcatgat 540
aattacgtta gatgggctag aggttaccca gtgactattc caccatctgc cccaaccaag 600
tctgaggttt tgcataagag accagttgat tggacagttg gtggtggtac cccaactgct 660
atgttttttg ataatattgt catcgctgtc aaggaaggtt tgaacattgg tttgttgcca 720
ggtggtcatt tcccatacgt ttctcatcct gaagcttttg ctgaatacgt tgttgagact 780
tgtagaaagt acatttaa 798

Claims (7)

1.玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的第136-142 位氨基酸由ASVTGME突变为DILLHIH得到，其中，所述野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1基因，其特征在于，编码权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1。
3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.包含权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1基因的重组表达载体。
5.包含权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1基因的重组菌株。
6.制备权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）用包含玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
（2）培养重组菌株，诱导表达玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1；
（3）分离并纯化所表达的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1。
7.权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1用于水解玉米赤霉烯酮的应用。
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