CN108841807B

CN108841807B - 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体

Info

Publication number: CN108841807B
Application number: CN201810692918.5A
Authority: CN
Inventors: 张田
Original assignee: Guangdong Fenglvyuan Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: GUANGDONG FENGLVYUAN BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN108841807A

Abstract

一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了由米曲霉(Aspergillus oryaze)脂肪酶作为亲本，经分子生物学技术而获得的热稳定性提高的脂肪酶突变体。在这个突变体的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突变为：Leu156Cys。以该突变体在不同温度条件下保温10min后失去50％酶活力的温度(T_50％ ¹⁰)及50℃的半衰期(t₅₀ ^1/2)表示，该突变体的热稳定性得到了提高，具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

Description

一种热稳定性提高的脂肪酶突变体

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，具体地说涉及利用分子生物学技术获得热稳定性提高的脂肪酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

近年来，脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)在工业应用方面取得了很大进展。脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、环境友好等优点，已经在洗涤、造纸、制革、食品、纺织等领域得到了广泛的应用，并已经成为全球酶制剂市场上重要的品种。脂肪酶可以从动、植物中提取，也可以由多种微生物产生。由于微生物脂肪酶种类多，来源广，周期短，便于工业生产和提纯，所以在各领域中得到了极为广泛的应用中。米曲霉是一种非常安全的产酶菌，目前已经被美国FDA和WHO认定为安全菌株(GRAS)，它所分泌的脂肪酶AOL3(GenBank AB039325)具有安全无毒，作用底物广，对中、长链的甘油三脂具有很高的选择性等优势(Toida J,Fukuzawa M,Kobayashi G,Ito K,Sekiguchi J.Cloning and sequencing of thetriacylglycerol lipase gene of Aspergillus oryzae and its expression inEscherichia coli.FEMS Microbiol Lett.2000,189:159-164.)，在食品、洗涤和生物柴油领域展现出了重要的应用潜力。但是很多食品、洗涤剂以及生物柴油的制备或者使用过程都需要在较高温度下进行，而AOL3属于中温脂肪酶，在50℃下的半衰期不到2min，热稳定性差。这不仅显著地提高了AOL3的应用成本，而且限制了它的应用领域，急需对其热稳定性进行改良和提高。

定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过随机突变人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质，实现分子水平的模拟进化。近10年来，定向进化技术已经在脂肪酶性质改造领域取得了巨大的成功，主要集中于提高酶的热稳定性，提高酶的催化活力，改进底物特异性，对应立体选择性等方面(Katja Zorn,Isabel Oroz-Guinea,Henrike Brundiek,Uwe T.Bornscheuer.Engineering and application ofenzymes for lipid modification,an update.Prog Lipid Res.2016,63:153-164)。

大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，培养周期短，抗污染能力强等特点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。在前期研究中，发明人已经成功将米曲霉脂肪酶AOL3在大肠杆菌中进行了高效表达。本发明以大肠杆菌为表达系统，利用易错PCR和定向进化技术对米曲霉脂肪酶AOL3进行大量随机突变和筛选，获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。

酶分子的热稳定性提高可以用半衰期(t^1/2)来表征。即在较高温度条件下，酶的活力降低到原来活力一半时所需的时间。半衰期长，则酶稳定性高。反之，热稳定性差。因此，t^1/2的提高代表了酶分子热稳定性的提高。本发明中的t₅₀ ^1/2表示在50℃条件下，脂肪酶及其突变体的半衰期。

酶分子的热稳定性提高还可以用T_50％ ¹⁰来表征。即在不同温度条件下对酶分子孵育10min，获得酶分子活力失去50％的温度，此温度越高表示酶分子热稳定性越强。

定义：

氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

脂肪酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置置换氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如Leu156Cys，标识位置156的氨基酸由亲本脂肪酶的Leu替换成Cys，位置的编号对应于附件序列表中亲本米曲霉脂肪酶AOL3的氨基酸序列编号。

发明内容

本发明的技术方案：一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，由米曲霉脂肪酶基因出发，运用易错PCR定向进化技术获得；所述的米曲霉脂肪酶具有SEQ ID No:1所示的氨基酸残基序列；所述脂肪酶突变体具有SEQ ID No：2所示的氨基酸残基序列，由254个氨基酸组成，有1个突变氨基酸，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：3。

用于表达所述的脂肪酶突变体的表达载体为PET-28a；

用于表达所述的表达载体的微生物宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)；

与亲本米曲霉脂肪酶相比，所述脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高，以不同温度条件下孵育10min后获得的酶活力失去一半时的温度T_50％ ¹⁰及50℃的半衰期t₅₀ ^1/2来表示热稳定性的提高，本发明的脂肪酶突变体的提高幅度如表1所示：

表1

本发明运用易错PCR以及定向进化技术对米曲霉脂肪酶进行突变和筛选，获得了脂肪酶突变体Leu156Cys。以t₅₀ ^1/2及T_50％ ¹⁰来表示，脂肪酶突变体的热稳定性得到了提高。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

上述热稳定性提高的脂肪酶突变体可以应用于洗涤、食品、造纸或生物柴油等领域中。

附图说明

图1为脂肪酶突变体Leu156Cys的正向测序峰图。

具体实施方式

下列实施例中所用的方法，如无特殊说明均为常规方法，具体步骤可以参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,Dsvid W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold SpringHarbor)。所用引物均由上海生工合成。

实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下：

LB液体培养基：10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，pH 7.0，灭菌后4℃保存；

LB固体培养基：10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母提取物，20g/L琼脂，pH 7.0，灭菌后铺平板；

卡那霉素(Kanamycin)：100mg/mL，水溶，过滤除菌，-20℃避光保存；

实施例1利用易错PCR技术构建表达脂肪酶突变体的文库

野生型米曲霉脂肪酶基因(GenBank Accession:AB039325)由上海生工合成，根据米曲霉脂肪酶基因的序列设计正向引物P1，其核苷酸序列如SEQID NO：4所示，其中含有限制性酶EcoRI切点；反向引物P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，其中含有限制性酶NotI切点；以合成的米曲霉基因为模板，利用易错PCR技术在体外向米曲霉脂肪酶基因引入核苷酸突变。易错PCR的反应条件如下：表2：

表2反应体系

PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min；然后将目标片段回收。利用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切后与经过同样双酶切的质粒pET-28a(Novagen)进行连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于LB固体培养基(含100μg/mL的卡那霉素)。37℃恒温培养12小时，将所有转化子转移至LB液体培养基(含100μg/mL的卡那霉素)进行培养，然后利用质粒抽提试剂盒，提取质粒。将抽提后的质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，涂布于LB固体培养基(含100μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养，待转化子长出，突变体文库构建完成。

实施例2米曲霉脂肪酶突变体文库的筛选

用牙签逐个挑取转化子至96孔板，每个孔加入150μL的LB液体培养基(含100μg/mL的卡那霉素)，37℃220rpm培养10小时后加入0.5mM的IPTG，20℃180rpm诱导表达12小时，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有米曲霉脂肪酶的大肠杆菌裂解液。

将裂解液在50℃下保温3min，冰浴5min，室温放置10min，测定每孔的残余酶活力，以同等条件下保温后的野生型米曲霉脂肪酶为对照，筛选出热稳定性有显著提高的突变体，并进行测序；经过多轮突变和筛选，获得了1个优秀的突变体Leu156Cys，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3，图1为其突变位点的正向测序峰图。

上述脂肪酶活力测定采用对硝基苯酚酯法(pNPP法)。首先在酶标板按照表3制备对硝基苯酚的标准曲线。然后在酶标板的其它孔中，依次加入96μL的Tris-HCl缓冲液(1M，pH 7.5)，2μL 20mM的对硝基苯酚棕榈酸酯，2μL的酶液，37℃反应10min后，加入100μL无水乙醇中止反应，以未转化的大肠杆菌裂解液作为空白对照，测OD405，根据标准曲线计算残留酶活力。每分钟分解产生1μg对硝基苯酚需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

表3对硝基苯酚的标准曲线制备

实施例3野生型米曲霉脂肪酶及Leu156Cys突变体脂肪酶的分离纯化

经过易错PCR和高通量筛选初步获得了热稳定性提高的突变体Leu156Cys，为了进一步准确测定突变体热稳定性提高的幅度，本发明人挑取含有野生型米曲霉脂肪酶基因和Leu156Cys突变体脂肪酶基因的大肠杆菌进行扩大培养和诱导表达，并对表达的脂肪酶进行分离纯化和酶热稳定性测定，其具体步骤如下：

(1)米曲霉脂肪酶及突变体的诱导表达及分离纯化

分别挑取1株含野生型米曲霉脂肪酶基因、Leu156Cys突变体基因的大肠杆菌接种至5mL的LB液体培养基(含100μg/mL的卡那霉素)，37℃培养8h。然后将1mL菌液接种至50mL培养液中，进行扩大培养至OD＝0.6，加入IPTG至0.5mmol/L,20℃下诱导表达15h，然后收集菌体，获得重组表达米曲霉脂肪酶及突变体的大肠杆菌。

将收集到的菌体重悬于5mL平衡缓冲液(10mM Na2HPO4,1.8mMKH2PO4,140mMNaCl,2.7mM KCl,pH8.0)进行超声破碎，然后离心收集上清液。用10倍体积的平衡缓冲液平衡镍亲和柱，将超声破碎后的菌体上清液上到镍亲和柱，用10倍体积的平衡缓冲液洗掉未结合的杂蛋白，最后用5mL洗脱缓冲液[50mM NaH2PO4,300mM NaCl,500mM imidazole(咪唑),pH8.0]将吸附在亲和柱上的蛋白洗脱下来。将收集到的洗脱液进行透析过夜，获得了纯化后重组酶。

(2)纯化酶的热稳定分析

50℃的半衰期t₅₀ ^1/2

50℃的t₅₀ ^1/2表示在50℃条件下孵育，脂肪酶失去50％的酶活力所需要的时间。具体测定方法如下：在50℃下分别孵育纯化后的野生型米曲霉脂肪酶、Leu156Cys突变体脂肪酶，在不同处理时间取样，用实施例2中的pNPP法测定脂肪酶参比活力百分比。比活力百分比的ln值对时间t(min)作图，直线的斜率为失活常数K_inact，由t₅₀ ^1/2＝ln2/K_inact得到脂肪酶在该温度下的半衰期。

脂肪酶的T_50％ ¹⁰测定

T_50％ ¹⁰表示在不同温度条件下孵育10min，脂肪酶活力失去50％时的温度。具体方法如下：将纯化后的野生型米曲霉脂肪酶、Leu156Cys突变体脂肪酶分装到EP管中，利用金属水浴锅在不同温度下保温10min，然后于冰上放置5min，室温放置10min，测定每管中的残余活力。以残余活力百分比的ln值对保温温度T(℃)作图，得到斜率K，由T_50％ ¹⁰＝ln2/K得到脂肪酶的T_50％ ¹⁰

测定的T_50％ ¹⁰、t₅₀ ^1/2如下表4：

表4测试结果

本发明运用易错-PCR技术对米曲霉脂肪酶进行多轮的随机突变，并通过高通量筛选技术，获得了热稳定提高的突变体Leu156Cys，该突变体的T_50％ ¹⁰及50℃的t₅₀ ^1/2相对于野生型米曲霉脂肪酶得到了明显的提高。具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

以上所述并非对本发明的技术范围作任何限制，凡依据本发明技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 张田

<120> 一种热稳定性提高的脂肪酶突变体

<141> 2018-06-29

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 254

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 1

Met His Leu Ala Ile Lys Ser Leu Phe Val Ser Leu Leu Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Leu Ala Ser Pro Leu Pro Ser Asn Ala Leu Val Glu Arg Asn Ala

20 25 30

Pro Leu Asn Glu Phe Leu Ser Ala Leu Leu Ser His Leu Pro Ala Ile

35 40 45

Asp Gly Thr Ile Asp Ala Val Ser Gly Val Ile Thr Asp Phe Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Asp Leu Thr Gly Ala Arg Thr Thr Gln Asn Gly Tyr Ile

65 70 75 80

Gly Val Cys Thr Asp Tyr Thr Val Leu Phe Ala Arg Gly Thr Ser Glu

85 90 95

Pro Gly Asn Val Gly Val Leu Val Gly Pro Pro Leu Ser Glu Ala Phe

100 105 110

Glu Gln Ala Val Gly Ala Lys Ala Leu Ser Phe Gln Gly Val Asn Gly

115 120 125

Tyr Asn Ala Asp Val Ala Gly Tyr Leu Ala Gly Gly Asp Ala Ala Gly

130 135 140

Ser Lys Ser Met Ala Ser Leu Ala Ser Glu Val Leu Ser Lys Cys Pro

145 150 155 160

Asp Thr Lys Leu Val Met Ser Gly Tyr Ser Gln Gly Cys Gln Ile Val

165 170 175

His Asn Ala Val Glu Gln Leu Pro Ala Ala Asp Ala Ser Lys Ile Ser

180 185 190

Ser Val Leu Leu Phe Gly Asp Pro Tyr Ala Gly Lys Ala Phe Pro Asn

195 200 205

Val Asp Ala Ser Arg Val His Thr Val Cys His Ala Gly Asp Thr Ile

210 215 220

Cys Asn Asn Ser Val Val Ile Leu Pro Pro His Leu Thr Tyr Ala Val

225 230 235 240

Asp Val Thr Asn Ala Val Gln Phe Ala Val Ala Ala Ala Asn

245 250

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 2

Met His Leu Ala Ile Lys Ser Leu Phe Val Ser Leu Leu Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Leu Ala Ser Pro Leu Pro Ser Asn Ala Leu Val Glu Arg Asn Ala

20 25 30

Pro Leu Asn Glu Phe Leu Ser Ala Leu Leu Ser His Leu Pro Ala Ile

35 40 45

Asp Gly Thr Ile Asp Ala Val Ser Gly Val Ile Thr Asp Phe Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Asp Leu Thr Gly Ala Arg Thr Thr Gln Asn Gly Tyr Ile

65 70 75 80

Gly Val Cys Thr Asp Tyr Thr Val Leu Phe Ala Arg Gly Thr Ser Glu

85 90 95

Pro Gly Asn Val Gly Val Leu Val Gly Pro Pro Leu Ser Glu Ala Phe

100 105 110

Glu Gln Ala Val Gly Ala Lys Ala Leu Ser Phe Gln Gly Val Asn Gly

115 120 125

Tyr Asn Ala Asp Val Ala Gly Tyr Leu Ala Gly Gly Asp Ala Ala Gly

130 135 140

Ser Lys Ser Met Ala Ser Leu Ala Ser Glu Val Cys Ser Lys Cys Pro

145 150 155 160

Asp Thr Lys Leu Val Met Ser Gly Tyr Ser Gln Gly Cys Gln Ile Val

165 170 175

His Asn Ala Val Glu Gln Leu Pro Ala Ala Asp Ala Ser Lys Ile Ser

180 185 190

Ser Val Leu Leu Phe Gly Asp Pro Tyr Ala Gly Lys Ala Phe Pro Asn

195 200 205

Val Asp Ala Ser Arg Val His Thr Val Cys His Ala Gly Asp Thr Ile

210 215 220

Cys Asn Asn Ser Val Val Ile Leu Pro Pro His Leu Thr Tyr Ala Val

225 230 235 240

Asp Val Thr Asn Ala Val Gln Phe Ala Val Ala Ala Ala Asn

245 250

<210> 3

<211> 765

<212> DNA

<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400> 3

atgcatcttg ctatcaagtc tctctttgtc tctctcctcg gagccagcgt tctcgcaagc 60

cctcttccca gcaatgctct ggttgagaga aacgctcccc tgaatgagtt cctcagcgct 120

cttctgtcgc atctgcctgc catcgatggc accatcgacg cggtgtcggg tgtgatcacc 180

gattttgatc aattgctcgc cgacctcact ggtgctcgaa ccacacaaaa tggatatatt 240

ggtgtctgca cggactacac cgttctcttc gcccgcggaa ccagtgagcc cggaaacgtc 300

ggtgtccttg ttggacctcc tctttctgaa gcgtttgagc aagccgtcgg tgcaaaagcc 360

ttgagcttcc agggcgtcaa cggctataac gcagatgtcg cgggttattt ggctggaggt 420

gacgctgccg gtagcaagtc aatggcatcc ctggccagcg aagtttgctc caaatgtcct 480

gacactaagc tcgtcatgag cggctactct cagggttgcc agattgttca caacgccgtt 540

gagcagctcc ctgccgcaga cgctagcaag atcagcagcg tcctcctctt cggagaccca 600

tacgcgggca aggccttccc caacgttgat gcttcccgtg tgcacactgt gtgccacgcc 660

ggagatacta tttgcaacaa cagcgtcgtt atcctgcccc ctcacctgac ctacgctgtt 720

gatgtgacta acgcggttca atttgctgtt gcggctgcga actaa 765

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagagaattc atgcatcttg ctatcaagtc tctct 35

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagagcggcc gcgttcgcag ccgcaacagc aaat 34

Claims

1.一种热稳定性提高的脂肪酶突变体，所述的脂肪酶突变体由氨基酸序列为SEQ IDNO：1的脂肪酶的156位氨基酸Leu变为Cys得到；其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

2.一种多核苷酸分子，其编码权利要求1中所述的脂肪酶突变体。

3.一种重组质粒，所述的重组质粒为携带有编码权利要求2中所述的脂肪酶突变体基因的质粒。

4.一种微生物宿主细胞，其包含权利要求3所述的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的微生物宿主细胞，其选自大肠杆菌。

6.权利要求1的脂肪酶突变体在洗涤、食品、造纸或生物柴油领域中的应用。