CN107365755A - 一种新型脂肪酶及其基因、工程菌和制备方法 - Google Patents

一种新型脂肪酶及其基因、工程菌和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种新型脂肪酶及其基因、工程菌和制备方法。通过分子生物学技术手段获得野生型的脂肪酶基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，利用易错PCR技术对野生型脂肪酶基因进行随机突变，得到脂肪酶突变体G47I，及其编码基因mpcl3，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌WB600和毕赤酵母GS115中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得耐热脂肪酶。

Description

一种新型脂肪酶及其基因、工程菌和制备方法
技术领域：
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种新型脂肪酶突变体及其制备与应用。
背景技术：
脂肪酶(Lipase,E.C.3.1.1.3)，全称为三酰基甘油酯基水解酶(triacylglyce-rolacylhydrolase)，可以在水不溶性底物与水界面间水解三酰甘油酯生成甘油二酯、甘油单酯，还包括酯化、转酯、醇解、酸解、氨解等一系列生物反应。脂肪酶广泛分布于自然界中，在动植物与微生物中均发现有脂肪酶的存在。而来源自微生物的脂肪酶相对于动植物更具有优势：易于培养，生产周期短且产量高，便于工业化生产；来源广泛，由于微生物脂肪酶数量众多、类型各异，拥有更为宽泛的反应pH值、反应温度和底物选择性，更加适于工业应用。由此，微生物脂肪酶是工业化生产最重要的来源。根据已有报道，已经发现产脂肪酶的微生物有65个属，其中细菌28个属，酵母菌10个属，其他真菌23个属以及放线菌4个。其中用于商品化的微生物脂肪酶有27种，真菌脂肪酶有19种，细菌8种。总的来说，目前研究较多的是真菌脂肪酶。相较于细菌来源的脂肪酶，真菌脂肪酶拥有更好的热稳定性、pH稳定性、底物选择性、有机溶剂中的活性等优点，成为重要的脂肪酶来源。
总体而言，脂肪酶由于其分布广泛，其催化反应多样，且能在有机相体系中进行催化反应，可广泛应用于食品、洗涤剂、药物合成、造纸、化妆品、纺织、污水处理、生物降解、和生物柴油等工业，脂肪酶是非常重要的工业用酶。但是，工业所用脂肪酶多为中温酶，其热稳定性差，在高温下的半衰期非常短。这不仅限制了其应用范围，还增加了工业应用成本，为实际应用带来困难。因此，提高脂肪酶的热稳定性至关重要。
定向进化属于蛋白质的非理性设计，属于蛋白质工程的范畴。通常手段是利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏、高通量的筛选技术，从而能够在短时间内得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的改构酶，采用的手段一般是易错PCR。与此不同，需要事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，并根据这些因素有的放矢做对其DNA进行改造的是定点突变。
定点突变，又称为理性设计，就是在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定长度的核苷酸序列，由于其迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。本发明所使用的重叠PCR技术是定点突变技术的一种，该技术可以简单、快速的将两个或多个基因片段通过末端互补、重叠延伸进行体外基因的拼接。重叠PCR技术可以获得依靠限制性内切酶消化难以得到的产物，并且方便快速，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。
枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌。许多枯草芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素，并且属于人体肠道菌促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长，此外其能够高效地分泌各种蛋白质，在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究的也十分清楚，密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、对培养基无特殊要求等优点。
毕赤酵母属于单细胞低等真核生物，是表达外源基因比较理想的工具。它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，还因为含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，可用甲醇严格地调控外源基因的表达。另外，培养成本低，产物易分离。所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐。能够对外源蛋白基因进行稳定遗传，且作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型。此外，毕赤酵母细胞表面展示系统不但具有外源基因的翻译后加工能力和蛋白的折叠加工及适度糖基化等优点，而且，经该系统得到的全细胞催化剂可以重复利用从而降低生产成本。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种新型耐热脂肪酶及其制备与应用。
实现本发明目的的技术路线概述如下：
通过基本的分子生物学技术手段获得野生型的脂肪酶基因，通过酶切、连接等构建重组载体之后，利用易错PCR技术对野生型脂肪酶基因进行随机突变，得到脂肪酶突变体G47I，及其编码基因mpcl3，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌WB600和毕赤酵母GS115中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得耐热脂肪酶。
在本发明中采用如下定义：
1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2.脂肪酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如Gly47Ile，表示位置47的氨基酸由野生型脂肪酶的Gly替换成Ile，位置的编号对应于SEQID No.1中野生型脂肪酶的氨基酸序列编号。
在本发明中，小写斜体pcl表示野生型脂肪酶的编码基因，小写斜体mpcl3表示突变体脂肪酶的编码基因，信息如下表。
脂肪酶 氨基酸突变位点 基因突变位点 氨基酸SEQ ID No. 核苷酸SEQ ID No.
野生型 — — 1 2
G47I Gly47Ile GGA→ATT 3 4
所述的脂肪酶及其突变体的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600，表达载体为pBSA43；
所述的脂肪酶及其突变体的宿主细胞为毕赤酵母GS115，表达载体为pPIC 9K；
所述的脂肪酶及其突变体的宿主细胞为毕赤酵母GS115，展示载体为pPIC 9K-Flo。
本发明的实验方案具体如下：
1、一种获得耐热脂肪酶突变体编码基因的过程，包括如下步骤：
(1)将野生型脂肪酶基因pcl与载体pET-22b(+)连接，构建重组质粒pET-pcl，通过易错PCR随机突变野生型脂肪酶基因，得到耐热脂肪酶突变体编码基因mpcl3；
(2)将含有耐热脂肪酶突变体编码基因的质粒pET-mpcl3保存。
2、一株含耐热脂肪酶基因的枯草芽孢杆菌重组菌株及以此制备耐热脂肪酶的过程包括如下步骤：
(1)将保存的含有耐热脂肪酶突变体编码基因的pET-mpcl3进行酶切，得到的耐热脂肪酶突变体编码基因mpcl3，与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBSA43通过连接得到新的重组载体；
(2)将重组载体转化入枯草芽孢杆菌WB600中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到耐热脂肪酶。
3、一株含有耐热脂肪酶基因的毕赤酵母重组菌株及以此制备耐热脂肪酶的过程包括如下步骤：
(1)将保存的含有耐热脂肪酶突变体编码基因的pET-mpcl3进行酶切，得到的耐热脂肪酶突变体编码基因mpcl3，与表达载体pPIC 9K通过连接得到新的重组载体；
(2)将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到的重组菌株经过遗传霉素筛选和脂肪酶的酶活测定，得到耐热脂肪酶的高产菌株；
(3)之后进行发酵，制备耐热脂肪酶。
4、一株含有耐热脂肪酶基因的毕赤酵母细胞表面展示重组菌株及以此制备耐热脂肪酶全细胞催化剂的过程包括如下步骤：
(1)将保存的含有耐热脂肪酶突变体编码基因的pET-mpcl3进行酶切，将得到的脂肪酶突变体编码基因mpcl3，与毕赤酵母展示载体pPIC 9K-Flo通过连接得到新的重组载体；
(2)将重组载体转化入宿主菌株毕赤酵母GS115中，得到毕赤酵母细胞表面展示脂肪酶重组菌株。
(3)将重组菌株发酵后制备酵母细胞表面展示耐热脂肪酶基因全细胞催化剂。
本发明还提供上述脂肪酶突变体及其基因的应用。
有益效果：
1、本发明利用易错PCR技术对野生型脂肪酶进行随机突变，得到耐热性提高的突变体G47I，在45℃保温时，野生型脂肪酶在30min左右丧失全部酶活力。本发明提供的脂肪酶突变体在保温30min后，G47I能保持65.15％的残余酶活。
2、本发明分别使用了枯草芽孢杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统、毕赤酵母表面展示系统，实现耐热脂肪酶突变体不同方式的高效表达。
说明书附图：
图1酶活热稳定性曲线
其中，A为35℃下分别保温30、60、90、120min的热稳定性曲线；
B为40℃下分别保温30、60、90、120min的热稳定性曲线；
C为45℃下分别保温30、60、90、120min的热稳定性曲线；
WT为本发明野生型脂肪酶，G47I为本发明脂肪酶突变体；
图2为本发明野生型脂肪酶基因的PCR扩增电泳图
其中：M为DNA Marker，1为脂肪酶基因；
图3为本发明重组质粒pBSA43-mpcl3酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为pBSA43-mpcl3经BamH I和Hind III双酶切；
图4为本发明重组质粒pPIC 9K-mpcl3酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为pPIC 9K-mpcl3经EcoR I和Not I双酶切；
图5为本发明重组质粒pPIC 9K-Flo-mpcl3酶切验证图
其中：M为DNA Marker，1为pPIC 9K-Flo-mpcl3经过SnaB I和EcoR I双酶切。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明，但本发明不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明实施例所用培养基如下：
PDA培养基(100mL)：100mL土豆汁，2.0g葡萄糖。
LB培养基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。
MD培养基(g/L)：YNB 13.4，葡萄糖20，生物素4×10-4。
YPD培养基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20。
BMGY培养基(g/L)：YNB 13.4，酵母提取物10，蛋白胨20，甘油10，生物素4×10-4，pH6.0。
BMMY培养基(g/L)：YNB 13.4，酵母提取物10，蛋白胨20，甲醇5g，生物素4×10-4，pH6.0。
上述培养基的固体培养基均添加2％琼脂。
实施例1：野生型脂肪酶基因的获得
1.野生型脂肪酶基因来自圆弧青霉(Penicillium cyclopium)CICC 41049菌株，提取其总RNA。
(1)菌株活化：从甘油管中吸取100μL保存的圆弧青霉孢子液，均匀涂布于PDA茄子瓶内，28℃恒温培养5d；
(2)转接：用无菌水将茄子瓶内孢子洗下，12000r/min离心1min，反复清洗，最后转接于50mL的PDA液体培养基中，置于摇床中，28℃，200r/min，培养2d；
(3)收集菌体：用双层灭菌的纱布，过滤菌体，并用无菌水冲洗，拧干，将菌体放置研钵内，加入液氮研磨至粉末；
(4)加入Trizol：将研磨后的粉末分别取少量分装至EP管中，各管内加入1mLTrizol试剂，室温旋窝震荡10min，冰上放置15min；
(5)酚仿抽提：每1mL Trizol试剂加入0.2μL的氯仿，震荡15s，室温放置3min，在4℃下，12000r/min离心15min，将上清转移至新的EP管中，再加入等体积的酚仿，在4℃下，12000r/min离心10min，取上清，重复酚仿抽提一次；
(6)沉降：加入等体积的异丙醇，混匀，-70℃放置20min，取出在4℃下12000r/min离心10min，除去上清；
(7)清洗与晾干：加入500μL的75％的乙醇，4℃下12000r/min离心5min，重复一次，其中75％乙醇是由DEPC处理水与乙醇按比例混合而成，空离一次，倒置晾干；
(8)保存：晾干后加入50μL的DEPC处理水，混匀，取出部分立即在经过DEPC处理过的水配制的1％琼脂糖凝胶上点样电泳，剩余部分经过55℃水浴10min，放置于-70℃保存。
2.反转录
(1)取总RNA2μg，加入10mM dNTP，Oligo dT(0.5μg/μL)各1μL，；
(2)70℃加热5min，冰上放置2min；
(3)离心数秒，使模版和RNA引物变性，聚集于EP管底部；
(4)在同一管中加入10×Buffer 2μL，RNase抑制剂1μL，反转录酶PrimerScripeReverse Transcriptase(50unit/μL)1μL以及RNase Free H2O 4.5μL(上述两试剂购自北京百泰克生物技术有限公司)；
(5)轻轻混匀后置于42℃，60min。然后置70℃，保温15分钟，可直接用于PCR。
3.设计野生型脂肪酶基因的扩增引物，序列如下：
上游P1(SEQ ID No.5)：
CGCGGATCCGCAACTGCTGACGCCGCTGC
下游P2(SEQ ID No.6)：
CCCAAGCTTTCAGCTCAGATAGCCACAACCAGCA
PCR扩增的反应体系为50μL，其组成为：
2×LAbuffer 25μL
dNTPs(2.5mmol/L) 2μL
上游引物P1(20μmol/L) 5μL
下游引物P2(20μmol/L) 5μL
模板cDNA 2μL
LATaq DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 10.5μL
总体积 50μL
扩增程序的设置为：
a.预变性:95℃5min；
b.变性：95℃30s；
c.退火：70℃45s；
d.延伸：72℃90s；
e.b-d反应30个循环；
f.延伸:72℃10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型脂肪酶基因的条带，共774bp(见图2)，再由小量DNA回收试剂盒回收PCR产物，得到了野生型脂肪酶基因，即pcl。
实施例2：大肠肝菌耐热脂肪酶重组菌的构建
1.野生型脂肪酶基因与pET-22b(+)载体进行连接。
纯化后的pcl与pET-22b(+)载体进行连接，随后将重组质粒化转入大肠杆菌DH 5α中，通过BamH I和Hind III双酶切，成功验证野生型脂肪酶基因已克隆至pET-22b(+)载体上构建了重组质粒pET-pcl。
2.易错PCR：以上述构建的重组质粒pET-pcl为模板，其反应体系如下：
ddH2O 21μL
重组质粒pET-pcl(5ng/μL) 1μL
上游引物P1(10μmol/L) 2μL
下游引物P2(10μmol/L) 2μL
Taq DNA聚合酶 0.5μL
10×Taq buffer 5μL
dATP(10mmol/L) 1μL
dGTP(10mmol/L) 1μL
dTTP(10mmol/L) 5μL
dCTP(10mmol/L) 5μL
MgCl2(25mmol/L) 10μL
MnCl2(10mmol/L) 1.25μL
体系完成后，进行易错PCR反应，程序设置如下：
a.预变性:95℃5min；
b.变性：95℃30s；
c.退火：70℃45s；
d.延伸：72℃90s；
e.b-d反应35个循环；
f.延伸:72℃10min。
PCR反应结束后，将PCR产物与载体质粒进行BamH I和Hind III双酶切，经过纯化回收，易错PCR产物与同样经过双酶切的载体质粒pET-22b(+)进行连接，通过化转至E.coliBL21(DE3)中，涂布于含Ampr(100μg/mL)的LB的固体平板中，37℃培养箱静置培养12h，得到转化子。
3.筛选方法：对硝基苯酚酯(p-Nitrophenyl Ester)是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP在碱性条件下显黄色，在405nm下有吸光值，且灵敏度很高且检测方便，非常适合于菌株的筛选。由于发酵上清存在目的蛋白，可以直接用发酵上清进行筛选。提前称取30mg对硝基苯酚酯至10mL异丙醇中配制成底物，配好后按1:9加入底物和0.05M pH 8.0的PBS缓冲液，配制成对硝基苯酚酯反应液。
4.突变体文库的筛选：在96孔板中每个孔中加入200μL含Ampr(100μg/mL)的LB液体培养基，随后，用灭过菌的牙签挑取每一个转化子的单克隆至96孔板中，挑取过程中尽可能使得每次都刚好沾到少量的菌。将96孔板转移至摇床培养，160r/min，37℃培养至OD600达到0.6-0.8，此时加入IPTG，至终浓度为0.5mM，随后进行低温诱导，16℃，160r/min培养16h。经过4000r/min离心10min(4℃下)，取50μL离心上清加入到含200μL对硝基苯酚酯反应液的96孔板中，检测出具有酶活的突变体后，这些突变体剩余发酵上清被均匀的分至两个一样的96孔板中，每个孔中50μL。板1立即检测酶活力，用排枪取200μL的反应液加入到各个孔中，在25℃的酶标仪内准确反应10min后，检测OD405。而板2放置在40℃培养箱30min，随后冰上放置10min后按同样方法在25℃下检测酶活力。
5.选取热稳定性提高的突变体。根据板1与板2的情况，计算每个突变体的残余酶活，选取相较于野生型热稳定性增加的突变体，对选取的突变体进行酶活与热稳定性的重复实验后，选取相对野生型耐热性明显提高的突变体接入平板，并送出菌样进行测序(北京华大生物工程公司)。
经过上述步骤的易错PCR，选取出热稳定性提高的突变体，测序后得到其中含有三个碱基突变，造成一个氨基酸突变，具体为Gly47Ile(GGA→ATT)，从而获得脂肪酶突变体G47I，及其编码基因mpcl3。
实施例3：枯草芽孢杆菌耐热脂肪酶重组菌的构建
1.表达载体pBSA43的构建
以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子P43(SEQ ID No.7)和能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacB(SEQ ID No.8)获得了表达载体pBSA43。它带有Ampr和Kanar基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记，同时又可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
2.构建耐热脂肪酶表达载体pBSA43-mpcl3
将易错PCR构建的耐热脂肪酶基因与枯草芽孢杆菌表达载体pBSA43都经BamHI和HindIII双酶切，随后进行连接，构建得到重组质粒pBSA43-mpcl3，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证(如图3所示)并测序，确定构建成功，即获得重组表达载体pBSA43-mpcl3。
3.表达载体pBSA43-mpcl3转化枯草芽孢杆菌WB600
向预冷的1mm电转杯中加入60μL感受态细胞中和1μL(50ng/μL)pBSA43-mpcl3，混匀并冰浴5min，设置参数(25μF，200Ω，4.5-5.0ms)，电击一次，随后立即加入1mL复苏培养基(LB+0.5mol/L山梨醇+0.5mol/L甘露醇)，混匀后吸取至1.5mL EP管中，37℃摇床震荡培养3h，离心后留取200μL复苏物涂布在具有抗性的LB平板上，37℃培养24h，挑取转化子，提质粒、酶切验证，得到枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-mpcl3。
实施例4：构建毕赤酵母耐热脂肪酶游离表达重组菌
1.耐热脂肪酶表达载体pPIC 9K-mpcl3的构建
将易错PCR纯化产物和毕赤酵母表达载体pPIC 9K经过EcoRI和NotI双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，选择Ampr的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功(如图4所示)，即得到重组表达载体pPIC 9K-mpcl3。
2.构建耐热脂肪酶高表达重组菌株
(1)质粒DNA的线性化
在转化毕赤酵母GS115之前，分别用SacI和SalI限制性内切酶对重组表达质粒pPIC 9K-mpcl3进行线性化酶切。
(2)线性化质粒pPIC 9K-mpcl3电转至毕赤酵母
①将感受态细胞与线性化质粒pPIC 9K-mpcl3加入到1.5mL预冷的离心管中，吹打混匀，随后加入预冷的电转杯中；
②对转化杯冰浴10min，随后电转化；
③电击后，立即加入1mL预冷的1mol/L的山梨醇溶液于电转杯中，并将电转液转移到新的1.5mL离心管中；
④30℃静置培养1-2h，吸取毕赤酵母GS115电转液200μL涂布在MD培养基上。
(3)阳性转化子的鉴定及脂肪酶高产菌株的筛选
①涂有电转液的MD平板在30℃培养2-3d；
②挑取转化子，提取酵母基因组，稀释100倍后作为模板进行PCR。另以转入空质粒pPIC 9K的毕赤酵母GS115/pPIC 9K作为对照，确定阳性转化子。
③确定阳性转化子后，先挑取在含不同浓度遗传霉素抗性平板上单菌落比较大的高遗传霉素抗性转化子，随后分别测定挑选出的转化子的脂肪酶酶活，从而得到脂肪酶的高产菌株GS115/pPIC 9K-mpcl3。
实施例5：毕赤酵母细胞表面展示耐热脂肪酶重组菌的构建
1.重组质粒pPIC 9K-Flo-mpcl3的构建
将易错PCR纯化产物和毕赤酵母表面展示表达载体pPIC 9K-Flo经过SnaB I和EcoR I双酶切，随后进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态中，选择Ampr的阳性转化子，菌落培养后提质粒，酶切验证成功(如图5所示)，即得到重组表达载体pPIC 9K-Flo-mpcl3。
2.毕赤酵母重组菌的构建
将测序验证正确的重组表达载体pPIC 9K-Flo-mpcl3经Sal I线性化后，用电转化法转化毕赤酵母GS115，MD平板筛选重组子，获得毕赤酵母细胞表面展示耐热脂肪酶重组菌GS115/pPIC 9K-Flo-mpcl3。
实施例6：耐热脂肪酶在枯草芽孢杆菌重组菌中的表达及制备
1.将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBSA43-mpcl3接种于含卡纳霉素(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，220r/min培养过夜；
2.按1％接种量转接于50mL的LB培养基中，37℃，220r/min培养48h，即得到耐热脂肪酶粗酶液；
3.随后采用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得G47I耐热脂肪酶纯酶酶粉。
实施例7：耐热脂肪酶在毕赤酵母游离表达重组菌中的表达及制备
1.挑取YPD平板上的毕赤酵母重组菌GS115/pPIC 9K-mpcl3接种至50mL的YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；
2.以1％的接种量转接至BMGY培养基中，30℃，250r/min培养约24h，随后4000r/min离心5min得到菌体，转接至BMMY培养基；
3.继续培养，30℃，250r/min，每隔24h补加250μL甲醇,在培养5d后，离心得上清，即得到脂肪酶的粗酶液；
4.然后采用分级盐析法沉淀酶蛋白，收集蛋白质沉淀，溶解后，透析除盐，再经离子交换层析、凝胶层析后，冷冻干燥制得G47I耐热脂肪酶纯酶酶粉。
实施例8：毕赤酵母细胞表面展示耐热脂肪酶全细胞催化剂的制备
1.挑取YPD平板上的毕赤酵母细胞表面展示耐热脂肪酶重组菌GS115/pPIC9K-Flo-mpcl3接种至50mL的YPD液体培养基中，30℃、250r/min培养24h；
2.以1％的接种量转接到新鲜BMGY培养基中，30℃，250r/min培养约24h，随后4000r/min离心5min得到菌体，转接至BMMY培养基；
3.继续培养，30℃，250r/min，每隔24h补加250μL甲醇。在培养5d后，离心收集取菌体，用过膜水冲洗1-2次，经真空冷冻干燥制得G47I毕赤酵母细胞表面展示耐热脂肪酶细胞催化剂。
实施例9：脂肪酶酶活力和热稳定性测定
1.脂肪酶酶活测定原理
在油水界面，脂肪酶可以将天然底物如橄榄油水解为甘油酯类和脂肪酸，通过使用标准浓度的NaOH滴定，可以定量计算出脂肪酶在一定时间内的水解效率，从而得到其酶活力大小。
2.脂肪酶酶活的定义
1.0g固体酶粉或者1.0mL液体酶，在一定温度和pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定脂肪酸，即1个酶活力单位(U/g或U/mL)。
3.脂肪酶酶活测定方法与步骤
根据国标法(GB-T 23535-2009)，其步骤为：pH计首先应校准，确保实验的准确性；取100mL烧杯两个，于空白杯(A)和实验杯(B)各加入底物溶液，即橄榄油乳化液4.0mL和磷酸缓冲液5.0mL，(A)中加入15mL 95％的乙醇，40℃预热5min；(A)和(B)中各加入酶液1mL，准确反映15min，随后(B)加入15mL 95％乙醇；两个烧杯中各加入一枚转子，置于磁力搅拌器上，边搅拌，边用0.05M的标准NaOH滴定，至pH 10.3，记录NaOH的消耗体积，计算酶活。样品均含有3组平行实验。
4.酶活测定结果如下表(以实施例6、7和8制备的G47I粗酶液和细胞催化剂，以及同样方法制备的野生型脂肪酶粗酶液和细胞催化剂为实验对象)：
5.热稳定性的检测
通过记录野生型与突变体在不同温度下，不同时间段内的残余酶活的变化，以体现脂肪酶的温度稳定性。以相同酶活力的野生型与突变体的酶粉保存于0.05M的pH 8.0的PBS缓冲液中，在35℃，40℃和45℃下分别保温30、60、90、120min，每个时间点测一次残余酶活力。测定方法按上述国标法进行。以未经过处理时的酶活为100％，计算处理后的残余酶活力，如图1所示。
由图1-A可以看出，在35℃下随着保温时间的增加，WT(WT代表野生型)的残余酶活明显下降，突变体的下降趋势较缓和，经过120min的保温，WT只保留了15.48％的残余酶活，而G47I则保持了54.28％的残余酶活；由图1-B得知，40℃时，WT经过90min保温就已经完全丧失酶活力，G47I在保温120min后，残余酶活为41.71％；由图1-C可得在45℃保温时，WT在30min左右丧失全部酶活力，突变体的酶活力也迅速下降，保温30min后，G47I能保持65.15％的残余酶活。
实施例10：耐热脂肪酶催化生成丙酸乙酯
以0.25M乙醇，0.2M丙酸，脂肪酶加酶量为1200U，溶剂选择为正壬烷，所有溶剂使用前加入3A分子筛去除水分。体系配好后放置在35℃摇床，150r/min反应20h。反应结束后，通过气质检测，在相同条件下，WT和G47I催化丙酸乙酯转化率分别为8％和45％。上述脂肪酶可以是实施例6、7或8制备的任意一种脂肪酶，均能达到同样的效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津科技大学
<120> 一种新型脂肪酶及其基因、工程菌和制备方法
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 258
<212> PRT
<213> 圆弧青霉（Penicillium cyclopium）CICC 41049
<400> 1
Ala Thr Ala Asp Ala Ala Ala Phe Pro Asp Leu His Arg Ala Ala Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Ala Ala Tyr Thr Gly Cys Ile Gly Lys Ala Phe Asp Val
20 25 30
Thr Ile Thr Lys Arg Ile Tyr Asp Leu Val Thr Asp Thr Asn Gly Phe
35 40 45
Val Gly Tyr Ser Thr Glu Lys Lys Thr Ile Ala Val Ile Met Arg Gly
50 55 60
Ser Thr Thr Ile Thr Asp Phe Val Asn Asp Ile Asp Ile Ala Leu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Glu Leu Ser Gly Val Thr Phe Pro Ser Asp Val Lys Ile Met
85 90 95
Arg Gly Val His Arg Pro Trp Ser Ala Val His Asp Thr Ile Ile Thr
100 105 110
Glu Val Lys Ala Leu Ile Ala Lys Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Glu Ala
115 120 125
Val Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Thr Ser Ile Ala His Val Ala
130 135 140
Leu Ala Gln Asn Phe Pro Asp Lys Ser Leu Val Ser Asn Ala Leu Asn
145 150 155 160
Ala Phe Pro Ile Gly Asn Gln Ala Trp Ala Asp Phe Gly Thr Ala Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Phe Asn Arg Gly Asn Asn Val Leu Asp Gly Val Pro Asn
180 185 190
Met Tyr Ser Ser Pro Leu Val Asn Phe Lys His Tyr Gly Thr Glu Tyr
195 200 205
Tyr Ser Ser Gly Thr Glu Ala Ser Thr Val Lys Cys Glu Gly Gln Arg
210 215 220
Asp Lys Ser Cys Ser Ala Gly Asn Gly Met Tyr Ala Val Thr Pro Gly
225 230 235 240
His Ile Ala Ser Phe Gly Val Val Met Leu Thr Ala Gly Cys Gly Tyr
245 250 255
Leu Ser
<210> 2
<211> 777
<212> DNA
<213> 圆弧青霉（Penicillium cyclopium）CICC 41049
<400> 2
gcaactgctg acgccgctgc cttccctgat ctgcaccgtg cagcaaagct ttcttccgct 60
gcctacacag gttgcatcgg aaaggccttc gatgtcacta tcaccaagag gatttatgac 120
ctcgtgaccg acaccaatgg attcgtcgga tactccaccg agaagaagac catcgcggtc 180
atcatgaggg gctcgactac catcaccgac ttcgtgaacg acattgacat tgctctcatc 240
actcctgagc tctcgggcgt gactttcccc tctgatgtga agatcatgag aggtgttcac 300
agaccttggt ccgctgtaca cgacaccatc attactgaag tcaaggctct cattgcgaag 360
taccctgatt acactctgga agcagtcgga cattccctcg gtggtgccct cacatccatt 420
gcccacgttg ccctggccca gaacttcccg gacaagtcac ttgtcagcaa tgcccttaac 480
gccttcccca tcggcaacca agcgtgggcc gactttggta ctgcgcaggc cggtaccttc 540
aaccgcggaa ataacgttct tgacggtgtc cctaacatgt actcgagccc gcttgttaac 600
ttcaagcact atggaaccga atactacagc tctggtaccg aggctagcac cgtgaagtgc 660
gaaggccagc gtgacaagtc ttgctctgcc ggcaatggca tgtacgctgt cactcccggt 720
cacatcgcaa gctttggcgt cgtgatgctt actgctggtt gtggctatct gagctga 777
<210> 3
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ala Thr Ala Asp Ala Ala Ala Phe Pro Asp Leu His Arg Ala Ala Lys
1 5 10 15
Leu Ser Ser Ala Ala Tyr Thr Gly Cys Ile Gly Lys Ala Phe Asp Val
20 25 30
Thr Ile Thr Lys Arg Ile Tyr Asp Leu Val Thr Asp Thr Asn Ile Phe
35 40 45
Val Gly Tyr Ser Thr Glu Lys Lys Thr Ile Ala Val Ile Met Arg Gly
50 55 60
Ser Thr Thr Ile Thr Asp Phe Val Asn Asp Ile Asp Ile Ala Leu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Glu Leu Ser Gly Val Thr Phe Pro Ser Asp Val Lys Ile Met
85 90 95
Arg Gly Val His Arg Pro Trp Ser Ala Val His Asp Thr Ile Ile Thr
100 105 110
Glu Val Lys Ala Leu Ile Ala Lys Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Glu Ala
115 120 125
Val Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Thr Ser Ile Ala His Val Ala
130 135 140
Leu Ala Gln Asn Phe Pro Asp Lys Ser Leu Val Ser Asn Ala Leu Asn
145 150 155 160
Ala Phe Pro Ile Gly Asn Gln Ala Trp Ala Asp Phe Gly Thr Ala Gln
165 170 175
Ala Gly Thr Phe Asn Arg Gly Asn Asn Val Leu Asp Gly Val Pro Asn
180 185 190
Met Tyr Ser Ser Pro Leu Val Asn Phe Lys His Tyr Gly Thr Glu Tyr
195 200 205
Tyr Ser Ser Gly Thr Glu Ala Ser Thr Val Lys Cys Glu Gly Gln Arg
210 215 220
Asp Lys Ser Cys Ser Ala Gly Asn Gly Met Tyr Ala Val Thr Pro Gly
225 230 235 240
His Ile Ala Ser Phe Gly Val Val Met Leu Thr Ala Gly Cys Gly Tyr
245 250 255
Leu Ser
<210> 4
<211> 777
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcaactgctg acgccgctgc cttccctgat ctgcaccgtg cagcaaagct ttcttccgct 60
gcctacacag gttgcatcgg aaaggccttc gatgtcacta tcaccaagag gatttatgac 120
ctcgtgaccg acaccaatat tttcgtcgga tactccaccg agaagaagac catcgcggtc 180
atcatgaggg gctcgactac catcaccgac ttcgtgaacg acattgacat tgctctcatc 240
actcctgagc tctcgggcgt gactttcccc tctgatgtga agatcatgag aggtgttcac 300
agaccttggt ccgctgtaca cgacaccatc attactgaag tcaaggctct cattgcgaag 360
taccctgatt acactctgga agcagtcgga cattccctcg gtggtgccct cacatccatt 420
gcccacgttg ccctggccca gaacttcccg gacaagtcac ttgtcagcaa tgcccttaac 480
gccttcccca tcggcaacca agcgtgggcc gactttggta ctgcgcaggc cggtaccttc 540
aaccgcggaa ataacgttct tgacggtgtc cctaacatgt actcgagccc gcttgttaac 600
ttcaagcact atggaaccga atactacagc tctggtaccg aggctagcac cgtgaagtgc 660
gaaggccagc gtgacaagtc ttgctctgcc ggcaatggca tgtacgctgt cactcccggt 720
cacatcgcaa gctttggcgt cgtgatgctt actgctggtt gtggctatct gagctga 777
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcggatccg caactgctga cgccgctgc 29
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccaagcttt cagctcagat agccacaacc agca 34
<210> 7
<211> 305
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagctcagca ttattgagtg gatgattata ttccttttga taggtggtat gttttcgctt 60
gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa acatcaccct 120
cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc ggggctgttt gcgtttttgc cgtgatttcg 180
tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca aagctgtaat ggctgaaaat tcttacattt 240
attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa atataaagtg 300
atagc 305
<210> 8
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca acagtattaa cctttactac cgcactgctg 60
gcaggaggcg caactc 76

Claims (6)

1.一种脂肪酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。
2.权利要求1所述脂肪酶突变体的编码基因。
3.权利要求2所述脂肪酶突变体的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID No.4所示。
4.权利要求1所述脂肪酶突变体或权利要求4所述的基因的用途。
5.一种包含权利要求4所述的基因的表达载体或宿主细胞。
6.如权利要求5述的表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为pBSA43，宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600；或者，所述表达载体为pPIC 9K，宿主细胞为毕赤酵母GS115；或者，展示载体为pPIC9K-Flo，宿主细胞为毕赤酵母GS115。
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