CN101979528B

CN101979528B - 一种酯酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101979528B
Application number: CN2010105216409A
Authority: CN
Inventors: 高俊莲; 王敏; 成晓杰; 刘华伟; 程敏; 张姝
Original assignee: BEIJING AGRICULTURAL BIOLOGICAL TECHNOLOGY Research CENTRE
Current assignee: BEIJING AGRICULTURAL BIOLOGICAL TECHNOLOGY Research CENTRE
Priority date: 2010-10-21
Filing date: 2010-10-21
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-10-21
Also published as: CN101979528A

Abstract

本发明公开了一种酯酶及其编码基因与应用。本发明所提供的酯酶，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由1)衍生的蛋白质。本发明应用宏基因组克隆技术获得的酯酶为能够分解短链脂肪酸的新型微生物酯酶，该酶在水解短链脂肪酸中的最适水解温度为20℃，最适pH值为8.0，最适底物为对硝基苯丁酸酯。本发明对利用宏基因组克隆技术开发获得新酶产品具有重要的意义。

Description

一种酯酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的一种酯酶及其编码基因与应用。

背景技术

酯酶和脂肪酶都是羧酸酯水解酶，并且被分为8个族。酯酶(Esterases)水解少于10个碳原子的短链脂肪酸的酯键，而脂肪酶(Lipase)则水解多于10个碳原子的长链脂肪酸的酯键。酯酶和脂肪酶都是分解脂肪的酶，可利用底物范围非常广泛。目前，酯酶和脂肪酶被广泛用于洗涤剂行业、油脂化工、生物化工、食品工业、饲料行业、医疗医药、手性合成等行业中，每年全球需求量高达1000吨。

由于酯酶和脂肪酶的商业重要性，使得酯酶和脂肪酶的研究一直受到重视。微生物酯酶和脂肪酶具有比动植物酯酶和脂肪酶的作用pH范围、作用温度范围以及对底物的专一性类型更广，便于工业生产中获得高纯度制剂等优势，因此微生物酯酶和脂肪酶研究已成为世界各国新酶研发的重要来源。已报道的产酶微生物的种类非常广泛，主要包括青霉、白地霉、根霉、假丝酵母等属的真菌以及无色杆菌、不动杆菌、碱杆菌、节杆菌、芽孢杆菌、乳杆菌、假单胞菌、葡萄球菌等属细菌。

尽管人们已从微生物中获得不少酯酶和脂肪酶，而且目前工业上应用的微生物酯酶和脂肪酶大多数都是采用传统的微生物纯培养的方法获得的，但是这种方式有很大的局限性。一方面，据估计自然界存在的各种微生物类群中获得纯培养的还不到1％，这使得只有很少一部分的微生物酯酶和脂肪酶得以研究利用，而近年来发展起来的宏基因组克隆技术使我们全面研究自然界广泛存在的未培养微生物的基因资源成为可能。另一方面，通过传统的微生物纯培养方法获得微生物酯酶和脂肪酶通常产量较低，而通过构建基因工程菌的方式发酵获得目的蛋白，其产量远非传统方式可比，最高能达到总蛋白量的50％。因此，采用宏基因组克隆等高通量筛选分子生物学技术开展微生物酯酶和脂肪酶的研究，对丰富微生物酯酶和脂肪酶家族成员，推动酯酶和脂肪酶的广泛应用都具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质，该蛋白质为酯酶。

本发明所提供的蛋白质，命名为Est01，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯酶活性的由1)衍生的蛋白质。

所述蛋白质的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有酯酶活性蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有酯酶活性蛋白的DNA分子。

含有所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒也属于本发明的保护范围。

所述重组载体为将所述的编码基因插入载体pET30a的多克隆位点得到的重组载体。

所述重组菌为将所述的重组载体转入宿主菌E.coli BL2(DE3)得到的重组菌。

扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

所述蛋白质、所述编码基因、所述重组载体和/或所述重组菌在水解短链脂肪酸脂中的应用也属于本发明的保护范围。

所述水解的温度为10℃-60℃或10℃-40℃或10℃-30℃或20℃-40℃，优选为20℃；所述水解的pH值为5.0-10.0或7.0-10.0或8.0-10.0或8.0-9.0，优选为8.0。

所述短链脂肪酸脂为对硝基苯丁酸酯、对硝基苯乙酸酯、对硝基苯辛酸酯、对硝基苯癸酸酯和/或三丁酸甘油酯。

本发明应用宏基因组克隆技术获得的酯酶为能够水解短链脂肪酸的新型微生物酯酶，该酶在水解短链脂肪酸反应中的最适温度为20℃，最适pH值为8.0，最适底物为对硝基苯丁酸酯。本发明对利用宏基因组克隆技术开发获得新酶产品具有重要的意义。

附图说明

图1为含有酯酶基因阳性克隆的水解圈。

图2为PCR扩增酯酶基因est01的电泳结果。

图3为酯酶基因的诱导表达后的SDS-PAGE电泳结果。

图4为粗酶裂解液的平板定性检测酯酶水解活性的结果。

图5为纯化的酯酶Est 01的平板定性检测酯酶水解活性的结果。

图6为牛血清蛋白(BSA)浓度-OD595吸光值标准曲线。

图7为对硝基苯酚(p-NP)浓度-OD405吸光值标准曲线。

图8为纯化的酯酶Est 01最适酶反应温度测定结果。

图9为纯化的酯酶Est 01最适酶反应pH值测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 酯酶基因的获得及酯酶功能验证

一、酯酶基因的获得

1、酯酶阳性克隆的筛选及序列测定分析

从四川江油县户用沼气池采集沼液样品，构建沼气发酵微生物宏基因组文库。采用含100μg/mL氨苄青霉素和1％(w/v)乳化三丁酸甘油酯的LB培养基作为选择性培养基，从该文库中筛选酯酶阳性克隆。将经过活化的96孔文库细胞培养板用影印接种针复制到直径为150mm的固体选择性培养基平板上，37℃下培养2天，筛选菌落周围有水解圈出现的阳性克隆。为了排除假阳性，提取所筛选的阳性克隆质粒，重新转化至大肠杆菌E.coli DH5α宿主细胞中，同时向E.coli DH5α宿主细胞中转入空载体pBluescript SK(+)作为阴性对照，在选择性平板上培养两天后仍有水解圈出现，则证明为真阳性克隆，结果如图1所示，图1中A为转入酯酶阳性克隆质粒的E.coli DH5α在选择性平板上培养两天后有水解圈出现，B为转入空载体pBluescript SK(+)的E.coliDH5α在选择性平板上培养两天后的未出现水解圈。从图1可见，与对照相比，转入酯酶阳性克隆质粒的E.coli DH5α培养两天后仍有水解圈出现，则证明为真阳性克隆。

提取所获得的阳性克隆质粒，送至上海生工生物工程有限公司测序，得到一个3857bp的核苷酸序列，采用NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)及DNAMAN序列分析软件对序列进行开放性阅读框(ORF)分析，并对可能的ORF进行Blast在线相似性分析，结果显示，其中长度为1194bp的ORF₃₉₈(序列表中序列1所示)与β-内酰胺酶相似性为45％。

2、酯酶全长基因est01的克隆

人工合成序列表中序列1所示DNA。

根据ORF₃₉₈序列，设计扩增出完整开放性阅读框的引物，上游引物为est 01F：CGG GGTACCATGAATAATTCAATAACGATTG；下游引物为est 01R：CCGGAATTCTCAAATAATTGAAGAAAAAATTAC，并在上下游引物中分别引入限制性内切酶位点(引物est 01F上引入Kpn I酶切位点，引物est 01R上引入EcoR I酶切位点，已用下划线标出)。以序列表中序列1所示DNA为模板，以est 01F和est 01R为引物，进行PCR扩增，反应体系为：EX Taq酶(2.5U/μL Takara公司)1μL，10倍缓冲液5μL，质粒DNA模板1μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，超纯水补足50μL。扩增程序为：94℃，3min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃，10min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示(图2中1为PCR扩增条带，M为2kb DNA Ladder)，从图2可见，扩增得到了约1.2kb的片段，回收此大小约1.2kb的片段。将所回收的约1.2kb的PCR扩增片段连接于pGEM-T Easy后转化DH5α，选取阳性克隆进行测序，测序结果表明该扩增产物的序列包含如序列表中序列1所示的序列，序列1由1194个核苷酸组成。其编码区为序列1自5’末端第1-1194位核苷酸，将该基因命名为est01，该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2所示，由397个氨基酸组成。将该蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列经蛋白质数据库和核苷酸数据库分别进行搜寻比较，未发现有任何相同氨基酸序列和核苷酸序列，该蛋白属于新型酯酶，归属于酯酶第VIII家族，将其命名为Est01。

二、酯酶功能验证

1、含有酯酶编码基因的重组菌的获得

将上述步骤一所回收的约1.2kb的扩增片段经过KpnI和EcoRI酶切，连接于经同样双酶切的表达载体pET30a(表达载体pET30a购自Novagen公司，产品目录号为69909-3)，，获得重组质粒转化至大肠杆菌E.coli DH5α(大肠杆菌E.coli DH5α购自Takara公司，产品目录号为D9057)中。通过蓝白筛选挑取阳性克隆，提取阳性克隆的质粒DNA，经PCR扩增和双酶切的方法双重验证获得的重组质粒，结果表明该重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pCX01。将重组质粒pCX01转入表达宿主大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自Takara公司，产品目录号为D9126)中，进行抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提纯重组质粒pCX01，进行测序验证，测序结果表明，获得的重组质粒为在表达载体pET30a的KpnI和EcoRI位点间插入了序列表中序列1中第1-1194位的核苷酸序列。将筛选得到的转酯酶基因的基因工程菌株命名为E.coli BL21(DE3)·pCX01。同时将空载体pET30a转化表达宿主E.coli BL2(DE3)，获得转空载体阴性对照菌株E.coliBL21(DE3)·pET30a。

2、酯酶基因的诱导表达

将步骤1获得的基因工程菌E.coli BL21(DE3)·pCX01及转空载体阴性对照菌株E.coli BL21(DE3)·pET30a接种于LB培养基，于37℃培养至OD_600nm约为0.6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)进行诱导，继续培养10小时。同时设不加IPTG诱导的基因工程菌E.coli BL21(DE3)·pCX01作为对照。离心收集菌体，超声波破碎菌体，离心收集上清，采用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，结果如图3所示，图3中M为蛋白分子量标准；1为基因工程菌E.coli BL21(DE3)·pCX01经诱导表达的产物；2为转空载体阴性对照菌株E.coli BL21(DE3)·pET30a经诱导表达的产物；3为基因工程菌E.coli BL21(DE3)·pCX01未经诱导表达的产物。从图3中可见，基因工程菌E.coliBL21(DE3)·pCX01经诱导表达后产生了表观分子量约为44kDa的蛋白，与预期的酯酶大小一致；而转空载体阴性对照菌株E.coli BL21(DE3)·pET30a经诱导后以及基因工程菌E.coli BL21(DE3)·pCX01未经诱导均未产生此蛋白。

3、酯酶的纯化

采用Invitrogen公司的His标签蛋白纯化试剂盒Proband Purification system进行酯酶蛋白的纯化，取步骤2诱导表达后的基因工程菌E.coli BL21(DE3)·pCX01菌液50ml至离心管中，于5000g 25℃离心30min，收集菌体。加入15ml Tris-HCl(50mM pH 8.0)，重悬菌体。于5000g，25℃离心30min，收集菌体，加入8ml 1×Native binding buffer(pH8.0)，涡旋混匀后，加入8mg(20000U/mg)溶菌酶，上下颠倒数次混匀。于冰上，超声波破碎仪高强度破碎6次，每次10s，中间间隔10s。将细胞破碎物于4℃15000g离心30min，收集上清。按照说明书方法填充Ni柱，将8ml裂解液加至纯化柱。结合50分钟，期间在杂交炉中缓慢摇动，以防止树脂沉降。自然沉降10min，吸去上清。加入8ml1×Native wash buffer重悬，自然沉降，吸去上清。重复此步骤再三次。将注子固定于垂直架上，打开底盖，用8ml1×Native elutionbuffer洗脱柱子，收集成1ml的小份，SDS-PAGE电泳检测每管中的蛋白含量，选取含量最高的进行透析脱盐，透析液为50mM Tris-HCl(10％v/v甘油)。透析过夜后，分装成50uL的小管，液氮速冻，保存至超低温冰箱中。

4、功能验证

平板定性检测酯酶水解活性：

(1)粗酶液活性检测

将步骤2中基因工程菌E.coli BL21(DE3)·pCX01和转空载体对照菌株E.coliBL21(DE3)·pET30a经IPTG诱导表达后，再将菌体超声波破碎，收集裂解液，将裂解液分别点接于发色底物平板(含有0.01％苯酚红、1％乳化三丁酸甘油酯、10mmol/LCaCl₂和2％琼脂粉，用0.1N NaOH将pH调至7.3-7.4)上，于37℃保温10min，由于酯酶可以将平板中的三丁酸甘油酯水解，产生脂肪酸，脂肪酸将原本pH为7.3-7.4的发色底物pH降低，从而进入指示剂苯酚红的显色范围(pH6.6-8.0，颜色黄-红)，所以在红色的发色底物平板上会产生黄色斑点。如图4所示，滴加基因工程菌E.coliBL21(DE3)·pCX01裂解液的位置出现黄色斑点(图4中A)，而滴加对照菌E.coliBL21(DE3)·pET30a裂解液的位置则没有出现黄色斑点(图4中B)。此结果说明，基因工程菌E.coli BL21(DE3)·pCX01经IPTG诱导表达后的产物有酯酶水解活性，而转空载体对照菌株E.coli BL21(DE3)·pET30a经IPTG诱导表达后的产物没有酯酶水解活性。

(2)纯化酶活性检测

将步骤3中经过纯化的酯酶及经100℃加热处理10min的纯化酯酶各5μL点至发色底物平板上，37℃保温10min，纯化的酯酶在发色底物平板上有显色反应(图5中A)，而经过高温失活处理的纯化的酯酶则在发色底物平板上没有显色反应(图5中B)。

实施例2 酯酶Est 01的酶学特性研究

一、酯酶活性定量测定

1、酯酶蛋白含量测定

采用Brandford法对实施例1步骤3中经过纯化的酯酶蛋白含量进行测定定量，按照天根生化科技有限公司Brandford蛋白定量试剂盒所述的方法，首先以牛血清蛋白(BSA)标样的浓度(见表1)对595nm波长处吸光值OD595制作蛋白标准曲线(图6)，得出牛血清蛋白(BSA)浓度-OD595吸光值标准曲线方程为：y＝0.2175x+0.0051(R²＝0.9991)；然后取酶液5μL，加入PBS补足体积为75μL，加入1.425mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5min。于测定595nm波长处光吸收值OD595。三次重复测定结果分别为：0.021、0.023、0.020，取平均值0.021，根据蛋白标准曲线可计算出，5μL酶液含酶蛋白量为0.11μg。

表1 牛血清蛋白(BSA)标样的不同浓度下的OD595吸光值

BSA(μg/mL)	OD595
		0.33	0.076
0.67	0.151
		1.00	0.220
1.33	0.303
		1.67	0.364
2.00	0.439

2、酯酶活性定量测定

运用对硝基苯酚(p-NP)游离释放法对实施例1步骤3中经过纯化的酯酶进行酶活定量检测。将1个酶活单位(U)定义为：在一定反应条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯酚(p-NP)所需的酶量。

酶活测定的方法：1ml反应体系中含50mM Tris-HCl，pH8.0，0.5mM对硝基苯丁酸酯(反应底物)，5μl经过纯化的酯酶液，在一定温度下，反应10min后，加入1mL0.5M三氯乙酸终止反应，室温放置5min，加入1mL NaOH恢复至初始pH值。以不加酶的反应液作为空白对照，测定405nm波长处吸光值。以不同对硝基苯酚(p-NP)浓度(见表2)对OD405做标准曲线(如图7)，得出硝基苯酚(p-NP)-OD405吸光值标准曲线方程为：y＝0.016x+0.0028(R²＝0.9993)；根据该标准曲线方程即可计算出酯酶的活性及比活性。

表2 不同对硝基苯酚(p-NP)浓度下OD405吸光值

p-NP(μM)	OD405
		0	0
10	0.172
		30	0.461
50	0.835
		70	1.120
90	1.428
		120	1.934

实验设三次重复，结果取平均值。

酶活测定结果如下：三次测定结果吸光度值分别为0.156、0.175、0.160，平均值为0.164，通过标准曲线(图7)计算，对应比酶活为27.3U/mg。

二、酶学特性研究

1、最适酶促反应温度的测定：

以对硝基苯丁酸酯(C4)为底物，在pH值为8.0的条件下测定10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃等不同温度下的酯酶活性，测定方法同以上酯酶活性定量测定方法。测定结果如表3和图8。

表3 最适酶促反应温度测定结果

温度	重复1	重复2	重复3	平均值	比酶活(U/mg)
						10℃	0.079	0.080	0.087	0.082	13.5
20℃	0.167	0.172	0.181	0.173	29.0
						30℃	0.115	0.118	0.109	0.114	18.9
40℃	0.092	0.068	0.073	0.078	12.8
						50℃	0.022	0.030	0.027	0.026	3.9
60℃	0.012	0.009	0.011	0.011	1.3

表3和图8结果表明，酯酶Est 01的最适酶促反应温度为20℃，在此温度下的比酶活为29.0(U/mg)。

2、最适酶促反应pH值的测定

以对硝基苯丁酸酯(C4)为底物，在20℃温度下测定pH4.0-7.0(采用50mM磷酸盐缓冲液)及pH8.0-10.0(采用50mM Tris-HCl缓冲液)等不同pH值条件下的酯酶活性，测定方法同以上酯酶活性定量测定方法。测定结果如表4和图9。

表4 最适酶促反应pH值测定结果

注：^aND，没有检测到酯酶活性.

表4和图9结果表明，酯酶Est 01在pH为8.0时具有最大酶活力，在pH为9.0时，其酶活仍然有90％，在pH≤7.0时，其酶活急剧下降，在pH为4.0时，酶失去活性。因此，酯酶Est 01的最适酶促反应pH值为8.0，在此pH下的酶比活为29.1(U/mg)。

3、最适底物的测定

在温度为20℃、pH值为8.0的条件下，分别以对硝基苯乙酸酯(C2)、对硝基苯丁酸酯(C4)、对硝基苯辛酸酯(C8)、对硝基苯癸酸酯(C10)、对硝基苯月桂酸酯(C12)、对硝基苯豆蔻酸酯(C14)和对硝基苯棕榈酸酯(C16)作为底物，测定酯酶的活性，测定方法同以上酶活测定方法。测定结果如表5。

表5 底物特异性测定结果

底物	重复1	重复2	重复3	平均值	比酶活(U/mg)
						C2	0.059	0.055	0.063	0.059	9.8
C4	0.156	0.175	0.160	0.164	27.3
						C8	0.076	0.096	0.061	0.078	13.0
C10	0.006	0.008	0.007	0.007	0.7
						C12	ND^a	ND	ND	ND	ND
C14	ND	ND	ND	ND	ND
						C16	ND	ND	ND	ND	ND

注：^aND，没有检测到酯酶活性.

表5 结果表明，酯酶Est 01的最适底物为对硝基苯丁酸酯。最适底物的比酶活为27.3(U/mg)。

Claims

1.一种蛋白质，是由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为序列表中序列1所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述的编码基因插入载体pET30a的多克隆位点得到的重组载体。

6.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求4或5所述的重组载体转入宿主菌E.coli BL21(DE3)得到的重组菌。

7.扩增权利要求2或3所述编码基因全长的引物对；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

8.权利要求1所述蛋白质、权利要求2或3所述编码基因、权利要求4或5所述重组载体和/或权利要求4或6所述的重组菌在水解短链脂肪酸脂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述水解的温度为10℃-60℃或10℃-40℃或10℃-30℃或20℃-40℃；所述水解的pH值为5.0-10.0或7.0-10.0或8.0-10.0或8.0-9.0。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述短链脂肪酸脂为对硝基苯丁酸酯、对硝基苯乙酸酯、对硝基苯辛酸酯、对硝基苯癸酸酯和/或三丁酸甘油酯。