CN1218110A - 新的酯酶和产生光活性苯并二氢吡喃化合物的方法 - Google Patents

新的酯酶和产生光活性苯并二氢吡喃化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1218110A
CN1218110A CN98117243A CN98117243A CN1218110A CN 1218110 A CN1218110 A CN 1218110A CN 98117243 A CN98117243 A CN 98117243A CN 98117243 A CN98117243 A CN 98117243A CN 1218110 A CN1218110 A CN 1218110A
Authority
CN
China
Prior art keywords
esterase
ester
chroman
microorganism
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN98117243A
Other languages
English (en)
Inventor
及川利洋
福原信裕
松叶泰子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsui Chemicals Inc
Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsui Chemical Industry Co Ltd filed Critical Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Publication of CN1218110A publication Critical patent/CN1218110A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

通过处理式(Ⅰ)的(3R)－和(3S)－苯并二氢吡喃－3－乙酸酯混合物可以获得光活性苯并二氢吡喃－3－乙酸和光活性苯并二氢吡喃－3－乙酸酯。所说的处理是利用具有旋光异构体选择水解活性的酯酶或具有所说水解酶的微生物或它们的酶制剂进行的。一种来源于假诺卡氏菌属细菌的新的酯酶也可用作所说的酯酶。其中R1和R2如说明书中所述。

Description

新的酯酶和产生光活性苯并 二氢吡喃化合物的方法
本发明涉及一种新的作为酯水解催化剂是有用的酯酶，分离所说的酯酶的方法，利用所说的酯酶动力学拆分酯化合物(R)-型和(S)-型混合物的方法，以及利用所说的酯酶产生作为药用物质有用的光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯的方法。
此外，本发明涉及产生光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯的方法，其中，利用一种具有旋光选择性水解活性的酯水解酶或具有所说的水解酶的微生物，或它们的酶制剂处理由式(Ⅰ)描述的(3R)-和(3S)-苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的混合物。
近年来，已经进行了在有机合成中应用酶的许多尝试。尤其是，使用对各种具有高度底物专一性的酯酶旋光选择性地水解各种酯化合物，由此选择性地获得光活性化合物，对于从原手性酯化合物产生手性化合物来说，具有有高度的工业效率。
来自猪肝的酯酶一般用于上述目的，但是它的高成本与有限的可利用性妨碍了工业用途。已尝试了用来自微生物的酯酶替代来自猪的酯酶。由于来自不同有机体的酶在它们的底物专一性，选择性和酶的反应速率上有明显的不同，其变化取决于应用酶的化合物。
在欧洲专利出版物，EP0709370和EP0760364中公开的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸酯是一种有用的抗血小板中间体。然而，对于6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸酯，没有酯酶显示高度的旋光选择性，以及没有报道有效地水解它们的酯酶。
本发明的一个目的是发现一种酯酶，对于产生光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯(作为药物中间体是有用的)来说，它作为催化剂具有旋光选择性并且是有用的。
本发明的另一个目的是提供简单而有效地产生光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯的方法。
作为寻找简单而有效地产生光活性苯并二氢吡哺-3-乙酸和其酯的方法的广泛研究的结果，本发明发明人发现通过利用一种具有旋光选择性水解活性的酯水解酶或具有所说的水解酶的微生物，或它们的酶制剂处理(3R)-和(3S)-苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的混合物可以获得光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯。此外，本发明发明人发现一种新的采用各种纯化技术从假诺卡氏菌属微生物获得的酯酶，它具有旋光选择性水解活性并且显示出极好的热和pH稳定性，由此达到了本发明的目的。
也就是说，本发明涉及一种在假诺卡氏菌属微生物中发现的新的酯酶，其作为酯水解催化剂来说是有用的；涉及分离所说的酯酶的方法，涉及利用所说的酯酶动力学拆分酯化合物的(R)-型和(S)-型混合物的方法，以及涉及利用所说的酯酶产生作为药用物质有用的光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯的方法。
此外，本发明涉及产生光活性的苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯的方法，其中用具有旋光选择性水解活性的酯酶或具有所说的水解酶的微生物或它们的酶制剂处理式(Ⅰ)表示的(3R)-和(3S)-苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的混合物：
Figure A9811724300061
[其中R1是一个具有1-5个碳原子的直链或支链烷基，并且R2是一个氢原子或一个取代的或未取代的氨基]。
本发明更详细地解释如下：
(1)携带酶的微生物和培养该微生物的方法：
所说的新的目标酯酶包含在嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardiathermophila)FERM-BP-6275的细胞中。根据任何已知方法可以培养这些细胞。作为一般微生物的营养培养基的任何已知培养基都可以利用。必要时结合使用有机营养源如肉提取物、酵母提取物、麦芽抽提物、蛋白胨以及NZ胺；碳源如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉以及有机酸；氮源如硫酸铵、尿素以及氯化铵；无机营养源如磷酸盐、镁、钾以及铁和维生素。在培养基的pH在6和9之间，温度在30℃到60℃之间(优选地在45℃到55℃之间)的条件下好氧培养细胞。培养进行1-7天，直到目标酯酶含量达到它的最大值。
(2)酶的纯化：
可以利用常规酶纯化方法纯化该酶。通过离心从全培养物中获得细胞，并且利用超声处理，FRENCHPRESSURE CELL PRESS,DYNO-MILL或类似的方法机械地破碎这些细胞。通过离心除去固体(如细胞碎片)以便获得粗制的酶溶液。然后通过硫酸铵或其它盐盐析、凝胶过滤、离子交换层析、疏水层析、结晶或类似的方法纯化该酶。一个例子将在实施例1中加以描述。
(3)酶活性的测量：
将包含10μmo1外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲基酯，0.1mmol磷酸钾缓冲液(pH7.2)和适当量的酯酶的反应混合物(1ml)在55℃下反应30分钟。在进行反应之后，用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)-30％乙腈溶液稀释一部分反应混合物，同时通过高效液相层析法定量测定6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯和6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸。利用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)-30％乙腈作为流动相在inertsil ODS-2柱上(GL Science产品)以0.7ml/分钟的流速进行洗脱。在254nm处测量吸光度。其次，添加等体积的氯仿至余下的反应溶液中，以便抽提余下的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯。然后在真空中蒸馏除去氯仿，并且将最终的残渣溶解在乙醇中，用已烷/乙醇溶液(3/2,V/V)进一步稀释。由此定量测定在溶液中制备的(3S)-6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯和(3R)-6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯以确定光学纯度。在CHIRALCEL 0D-H光学拆分柱(DAICEL化学工业有限公司产品)上利用已烷/乙醇溶液(3/2，体积比)作为流动相以0.5m1/分钟的流速进行洗脱。在254 nm处测定吸光度。
每分钟水解1μmol 6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯的酶量定义为一个单位。
(4)酶的均一性：
利用tris-甘氨酸缓冲液(自然227,680,1970)在10-20％凝胶上，通过Laemmli法进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。在考马斯亮蓝染色之后，得到均相蛋白质带。通过与已知标准蛋白质比较估计出这种蛋白质的分子量是50000±2000。
(5)酶的性质：
本发明的酯酶显示下列性质：
(1)酶活性
该酶在酯化合物水解成具有羧基的化合物和醇化合物时，以及酯化合物和醇化合物之间发生酯交换反应时充当催化剂。
(2)底物特异性
该酶主要水解6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的(R)型。
对于直链脂肪酸和对硝基苯的酯，在脂肪酸中碳原子的数量越少，水解活性越强。
(3)分子量：
该酶的分子量是50000±2000(SDS-PAGE)
(4)最适pH
发生水解的最适pH是pH7-10。
(5)最适温度
在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)中发生水解的最适温度是55℃到60℃之间。
(6)温度稳定性
pH7.2下温度低于60℃时90％水解活性可以保持30分钟。
(7)pH稳定性
该酶在pH5-10范围内保持稳定。
(8)抑制剂
在用不同抑制剂在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)中30℃下处理30分钟时，用硫酸铜(1mM)该酶失去30％的活性，用苯甲基磺酰氟(0.1mM)失去85％，用二异丙基氟磷酸酯(0.5mM)失去15％。用月桂基硫酸钠(5mM)或脱氧胆酸钠(5mM)没有观察到该酶活性的降低。在下文的实施例中将进一步加以描述。
正如上面提到的，本发明的酶是一种对6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸酯起作用的立体特异性酯酶，并且具有极好热稳定性和pH稳定性。
在上述来自嗜热假诺卡氏菌FERM-BP-6275的酯酶存在下，可以立体特异性地水解式(Ⅰ)的化合物。
本发明也包括利用由微生物提供的酯水解酶进行光学拆分。含有用于本发明的酯酶或酯水解酶的微生物可以是主要水解(3R)-和(3S)-苯并二氢吡喃-3-乙酸酯混合物中任何一种光活性化合物的各种微生物。这样的微生物例子包括假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、黄杆菌属(Flavobacterium)和高温放线菌属(Thermoactinomyces)的微生物。这样的微生物优选的例子是那些包括嗜热假诺卡氏菌FERM-BP-6275、海床黄杆菌(Flavobacteriumokeanokoites)FERM-BP-6276、糖高温放线菌(Thermoactinomyces sacchari)ATCC-27375、海床黄杆菌IFO 15880的微生物。菌株FERM-BP-6275与FERM-BP-6276按照布达佩斯条约于1998年2月27日保藏在国立工业科学技术机构的生物科学和人体技术研究所(国际贸易和工业部，1-3,Higashi 1 Chome,Tsukuba-shi,Tbaraki-ken,305-8566，日本)。具有ATTC号的菌株保藏在ATTC(美国典型培养物保藏中心，121301 ParkLawn Drive,Rockville，马里兰20852，美国)，并且公众可以从该中心获得。具有IFO号的菌株也是公众可以从大阪发酵研究所(17-85,Juso-honmachi,2-chome,Yodogawa-ku，大阪，532日本)获得的。
特别地，对这些微生物没有特别的限制，只要它们具有本发明的必要的能力。例如，所使用的微生物的例子包括受紫外照射或利用变异剂所获得的突变菌株，或由基因工程处理获得的微生物。
特别地，对微生物培养物或它们的制剂没有特别的限制，只要它们具有本发明的必要的能力。微生物培养物的例子包括培养液和微生物细胞。来自培养物的制剂的例子包括洗涤的细胞，干细胞，培养上清液，破碎细胞(如细胞碎片)，细胞自消化物，细胞提取物以及利用常规方法纯化的或部分纯化的酶制剂。此外，这些微生物培养物和它们的制剂使用时可以固定化；固定化方法包括用聚丙烯酰胺，藻酸和角叉菜胶处理，或在一种适当的载体上利用已知方法(如共价结合法和吸附法)进行固定化。
一般地，用于这一领域培养微生物的任何培养基都可以利用。例如，必要时结合使用有机营养源如肉提取物、酵母提取物、麦芽抽提物、蛋白胨以及NZ胺；碳源如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉以及有机酸；氮源如硫酸铵、尿素以及氯化铵；无机营养源如磷酸盐、镁、钾以及铁和维生素。温度在20℃到60℃之间和pH在6到9之间进行好氧培养。然而，对海床黄杆菌FERM BP-6276来说，优选的是在28℃到37℃之间的温度下进行培养。对嗜热假诺卡氏菌FERM-SP-6275和糖高温放线菌ATCC-27375来说，优选的是在45℃到55℃的温度之间进行培养。培养1-7天直到目标酯酶含量达到它的最大值为止。
从由上述方法培养微生物获得的液体中通过如离心和过滤方法制备活培养细胞与培养物上清液。通过用生理盐水溶液洗涤从活细胞中制备洗涤细胞。通过冷冻干燥或丙酮干燥活细胞或洗涤细胞制备干细胞。利用各种物理化学方法(如超声波破碎、弗氏压碎、渗透压、冰冻-熔化、使用裂解酶或用表面活性剂和有机溶剂处理)制备破碎细胞。例如，利用常规方法(如硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、或疏水层析)通过分级分离从破碎细胞或培养上清液中获得纯化或部分纯化的细胞。
式(Ⅰ)的R1基团的例子包括具有1-5个碳原子的直链和支链烷基，优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基，更优选的是甲基或乙基。
当R2是氨基时，取代基团的例子包括乙酰基、叔丁氧羰基或苄氧羰基。
反应介质(对反应不具有任何副作用)或其混合物可以用于旋光异构体选择性水解。该介质可以是利用水或水与水混溶性溶剂的混合物的均相系统，或利用水和非水混溶性溶剂的混合物的两相系统。
水混溶性溶剂的例子包括具有1-4碳原子的直链和支链的烷基醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜以及四氢呋喃。水混溶性溶剂在水中可以以0.1和20.0％(V/V)范围的量进行使用。
非水混溶性溶剂的例子包括有机溶剂如甲苯和二甲苯。非水混溶性有机溶剂的量在水中在1.0-40.0％(V/V)的范围内。
要添加至反应溶剂的外消旋苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的浓度一般是0.01-50％(V/V)，优选的是0.01-20％(V/V)。
在室温下或通过加热进行反应，优选的温度是15℃到70℃之间，更优选的是20℃到60℃。
反应溶液的pH变化取决于水解酶或微生物来源的类型。然而，进行反应的pH一般在3到11之间。在反应溶液的pH随着水解进行发生变化时，优选的是将pH控制在最适pH。
同时，通过添加表面活性剂或其类似物到该反应溶液中可以提高底物和酶之间的反应性。
在旋光选择性水解之后，通过在使用水或水与水混溶性溶剂的混合物的均相系统中，用非水混溶性溶剂抽提光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸的酯，或者通过在使用水与非水混溶性溶剂的混合物或水和水混溶性溶剂与非水混溶性溶剂的混合物的两相系统中，分离有机溶剂层和水层来进行光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸酯和光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸的分离。取决于预期的用途，在有机溶剂层中产生的光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸酯可以在溶液中使用，或在除去溶剂之后用作合成中间体。利用一种适当的溶剂通过结晶可以获得更高光学纯度的光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸。利用一种已知方法(如过滤)除去细胞组分之后，通过一种已知方法(浓缩结晶)获得水层中的光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸。
实施例
本发明由下列实施例更详细地解释。然而，应该明白，这些实施例将不作为限制本发明范围的限定性实施例。
实施例1：培养包含酯酶的微生物的方法
将包含0.1％酵母提取物，0.1％肉提取物(Ehrlich),0.2％NZ胺(类型1)，0.5％氯化钠，0.05％磷酸二氢钾，0.1％磷酸氢二钾，0.01％硫酸镁和1.0％可溶性淀粉(pH7.4)的灭菌培养基(1L)接种上5％在相同培养基上进行预培养的嗜热假诺卡氏菌FERM BP-6275的培养物。在52℃下培养96小时后，所形成的培养物通过离心获得10g湿细胞。
实施例2：酯酶的纯化
将实施例1中获得的细胞悬浮在100 ml 0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.2)(下文称作缓冲液)中，通过超声波处理进行分散，并且利用弗氏压碎器破碎。通过离心(15000×g,20分钟)除去细胞碎片以便获得无细胞抽提物。将硫酸铵添加到无细胞抽提物中达到60％，同时通过离心获得为沉淀的活性组分。将这种沉淀溶解在100ml缓冲液中，用Ultrogel ACA44(Pharmacia产品)作为流动相对溶液进行凝胶过滤。将收集的活性组分加入到DEAE TOYOPEARL650M(TOSOH产品)柱上，并且用包含0.8M硫酸铵的缓冲液和采用线型浓度梯度的缓冲液进行洗脱。利用超滤浓缩所形成的活性组分，并且在缓冲液中进行透析。这样就均相纯化了酯酶。表1总结了纯化方法。
                                          表1
           方法  总活性(总单位)   总蛋白(mg) 比活性(单位/mg)
 1．无细胞液体提取物     677     185     3.7
 2．硫酸铵沉淀(＜60％)     425     125     3.4
 3．凝胶过滤(Ultrogel ACA44组分范围MW:10000-100000)     358     25     14.6
 4．DEAE TOYOPEARL 650S     262     10     26.2
 5．苯TOYOPEARL 650M     143     2     71.5
实施例3：外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的旋光选择性水解
外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯或外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯利用实施例2中均相纯化的酯酶在下列条件下进行水解。
包含0.1mmol磷酸钾缓冲液(pH7.2),10μmol外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯以及适当量酯酶的反应溶液(1ml)在55℃下反应30分钟。在进行反应之后，一部分反应溶液用l0mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)-30％乙腈溶液稀释，并通过高效液相层析定量测定6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯和6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸。利用10mM磷酸钠缓冲液(PH6.0)-30％乙腈溶液作为流动相以0.7ml/分钟的流速在inertsilODS-2柱(GL Science产品)上进行洗脱。在254nm处测定吸光度。其次，将等体积的氯仿添加至余下的反应溶液中以抽提余下的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯。在真空中蒸馏除去氯仿，所形成的残渣溶解在乙醇中，并且用己烷/乙醇溶液(3/2,V/V)进一步稀释。此时定量测定在溶液中制备的(3S)-6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯和(3R)-6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯以确定其光学纯度。利用已烷/乙醇(3∶2,体积比)作为流动相以0.5ml/分钟的流速在Chiral Cell OD-Ⅱ光学拆分柱(Daicel产品)上进行洗脱。在254nm处测定吸光度。
利用6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯替代6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯重复上述方法，同时，以上述相同的方式确定在反应溶液中(R)6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸的量和在已烷/乙醇溶液中(S)6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯与(R)6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯的量。
结果在表2中显示。表2外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的旋光选择性水解
外消旋底物 6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸(μmol) 6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸酯(μmol)   光学纯度(％ee)
6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯     6.0     4.0     S99
6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯     6.2     3.8     S99
实施例4：利用直链脂肪酸酯的水解和作为底物
将适当量的酶溶液添加至2.5ml包含1mM各种对硝基苯酯的0.2M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。将所形成的反应溶液在45℃下温育8分钟。通过添加lml甲醇终止反应，同时在400nm测定增加的吸光度。在参照样品中，利用缓冲液替代酶溶液。从吸光度的变化计算出对硝基苯酯的相对活性。结果在表3中显示。表3对硝基苯酯的相对活性(以对硝基苯乙酸酯的100％活性为基础)
底物     相对活性(％)
对硝基苯乙酸酯     100
对硝基苯己酸酯     12
对硝基苯月桂酸酯     0.6
实施例5：酶反应的最适pH
利用实施例2中均相纯化的酯酶研究最适pH。包含10μmol外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯，0.1mmol提供下述各种pH范围的缓冲液和0.1单位酯酶的反应混合物(1.0ml)在55℃下温育30分钟。在进行反应之后，添加等体积的氯仿以抽提余下的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯。然后，在真空中蒸馏除去氯仿，同时所形成的残渣溶解在乙醇中，并且用已烷/乙醇溶液(3/2,V/V)进一步稀释。通过高效液相层析定量测定(3S)-6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯和(3R)-6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯。通过减少6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯的量定量测定酶活性。
所利用的缓冲液是pH5.0-7.2的磷酸钾缓冲液，pH8.0-9.5的tris-HCl缓冲液和pH10.0的CAPS缓冲液(优质缓冲液)。如表4中的结果显示的，最适pH在8.0-10.0范围内。实施例6：酶的pH稳定性
利用实施例2中均相纯化的酯酶研究pH稳定性。在如实施例5的特定pH下，将0.5单位的酯酶添加至0.1M缓冲液中，同时溶液在30℃下进行30分钟，在之后利用0.1单位酶测量余下的活性。相对活性以没有进行pH处理的参照样品的100％酯酶活性为基础。表4中的结果显示，pH在5.0-10.0范围内在活性方面只是发生很小的变化。表4最适pH和pH稳定性
    pH     最适pH#(实施例5)     pH稳定性*(实施例6)
    5.0         28          97
    6.0         65          98
    6.5         80          100
    7.2         90          100
    8.0         93          100
    8.5         93          100
    9.5         94          100
    10.0         100          99
#：相对活性以pH10获得的100％活性为基础。*：相对活性以在特定pH下保持30分钟后在pH7.2下没有进行酶反应所获得的100％酯酶活性为基础。
实施例7：酶反应的最适温度
除了反应温度是30、40、50、55、60和70℃以及利用的缓冲液是磷酸钾缓冲液(pH7.2)外，以实施例5中描述的相同方式进行反应，结果显示活性最高在60℃。相对活性以60℃获得的100％活性为基础(表5)。
实施例8：酶的温度稳定性
利用实施例2中均相纯化的酯酶研究温度稳定性。将0.1单位的酯酶添加至0.1mmol磷酸钾缓冲液(PH7.2)中以得到总体积为0.95ml。该混合物在一种特定温度(即，30、40、50、55、60以及70℃)下保持30分钟。对此而言，添加0.05 ml 0.2M外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯盐酸盐，同时反应在55℃下进行30分钟，在之后测量余下的活性。相对活性以没有进行热处理所获得的100％酯酶活性为基础。表5中的结果显示，温度高达60℃时，保持超过90％的活性。表5最适温度和温度稳定性
温度(℃) 最适温度#(实施例7) 温度稳定性*(实施例8)
    30     24     100
    40     43     100
    50     69     100
    55     75     100
    60     100     90
    70     35     0
#：相对活性以60℃获得的100％活性为基础。*：相对活性以在特定温度保持30分钟后在55℃没有进行酶反应所获得的100％酯酶活性为基础。
实施例9：抑制剂的影响
研究各种抑制剂对实施例2中均相纯化的酯酶影响。将0.1单位的酯酶，0.1mmol磷酸钾缓冲液(pH7.2)以及一种特异性抑制剂混合成总体积为0.95ml，并将混合物在30℃下保持30分钟。对此而言，添加0.05 ml 0.2M外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯盐酸盐，同时反应在55℃下进行30分钟，在之后测量余下的活性。相对活性以没有抑制剂所获得的100％酯酶活性为基础。结果在表6中显示。在金属中，Cu2+是抑制性的。在其它中，苯基甲基磺酰氟(PMSF)，蛋白酶抑制剂和二异丙基氟磷酸(DFP)是抑制性的。在酶活性上用表面活性剂(如月桂基硫酸钠(5mM)或脱氧胆酸钠(5mM)(表6)没有观察到任何明显的降低。表6抑制剂的影响
    抑制剂     相对活性
      无     100
   FeSO4 1mM     92
   CoCl2 1mM     102
   MnSO4 1mM     99
   NiCl2 1mM     92
   CuSO4 1mM     21
   CaCl2 1mM     96
   ZnCl2 1mM     101
   EDTA  5mM     103
   PMSF 0.1mM     84
   DFP  0.5mM     6
   DTT  0.1mM     102
   SDS   5mM     99
    脱氧胆酸钠     102
实施例10：微生物的外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯的旋光选择性水解
在表7中显示的条件下在琼脂斜面培养基上分别培养不同的微生物。将一铂环细胞培养物悬浮在1ml包含2.5mg外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯盐酸盐和0.1mmol磷酸钾(pH7.2)的反应溶液的中。将反应溶液在30℃下反应16小时之后，用相同体积的氯仿抽提未反应的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯。然后，在真空中通过蒸馏除去氯仿，将所形成的残渣溶解在乙醇溶液中，并且用己烷/乙醇溶液(3/2,V/V)进一步稀释。分别定量测定(3S)-6-氨苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯和(3R)-6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯。在0.5 ml/分钟的流速下利用已烷/乙醇(3∶2，体积比)作为流动相在Chiral CellOD-Ⅱ光学拆分柱(Daicel的产品)上进行洗脱。在254nm处测量吸光度。结果显示在表7中。表7由微生物进行的外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯的选择性水解
微生物菌株 培养条件 S-酯含量(mg/ml) R-酯含量(mg/ml)
海床黄杆菌IFO 15880     A     0.98     0.00
糖高温放线菌     B     1.20     0.73
培养条件A：酵母提取物            0.5％Bactotryptone         1.0％氯化钠                1.0％琼脂                  1.5％pH:7.3；培养温度：    30℃培养条件B：酵母提取物            0.1％肉提取物              0.1％NZ胺                  0.2％麦芽糖                1.0％琼脂                  1.5％pH:7.3；培养温度：    45℃
实施例11：嗜热假诺卡氏菌的外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯的旋光选择性水解
将包含0.1％酵母提取物、0.1％肉提取物(Ehrlich)、0.2％NZ胺(类型1)、0.5％氯化钠、0.05％磷酸二氢钾、0.1％磷酸氢二钾、0.01％硫酸镁和1.0％可溶性淀粉的10ml灭菌培养基(pH7.4)接种到5％在相同培养基上进行预培养的嗜热假诺卡氏菌FERM BP-6275的培养物。在52℃下培养72 小时。离心获得的湿细胞添加至50ml包含1g外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯的反应溶液(pH8.0，用氢氧化钾调节)中。在55℃进行3小时的水解反应(用2％氢氧化钾溶液保持pH为8.0)。反应之后，添加20ml对甲苯，并抽提未反应的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯。大多数余下的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯提取到对甲苯层，同时水解的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸出现在水层。通过浓缩对甲苯层获得纯度超过99％的(S)6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸甲酯(产率：40％)。
实施例12：嗜热假诺卡氏菌的外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯的旋光选择性水解
将包含0.1％酵母提取物、0.1％肉提取物(Ehrlich)、0.2％NZ胺(类型1)、0.5％氯化钠、0.05％磷酸二氢钾、0.1％磷酸氢二钾、0.01％硫酸镁和1.0％可溶性淀粉的10ml灭菌培养基(pH7.4)接种到5％在相同培养基上进行预培养的嗜热假诺卡氏菌FERM BP-6275的培养物。在52℃下培养72小时。离心获得的湿细胞添加至50ml包含1g外消旋6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯盐酸盐的反应溶液(pH8.0，用氢氧化钾调节)中。在55℃进行6小时的水解反应(用2％氢氧化钾溶液保持pH为8.0)。反应之后，添加20ml对甲苯，并抽提未反应的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯。大多数余下的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯提取到对甲苯层，同时水解的6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸剩留在水层。通过浓缩对甲苯层获得纯度超过99％的(S)6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸乙酯(产率：35％)。
本发明发明人已发现一种新的酯酶，它具有极好的热和pH稳定性，可以在正常压力和正常温度下催化极小量酯的水解，并且具有一种对有用药物中间体苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯的旋光选择性水解活性。这种酯酶可以用于简单而有效地产生作为药物中间体是有用的光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸和其酯。此外，通过利用具有旋光选择性水解活性的酯酶或具有所说的水解酶的微生物，或它们的酶制剂处理，可以容易而有效地由(3R)-和(3S)-苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的混合物产生光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸和光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸酯。

Claims (17)

1．一种新的酯酶，该酯酶具有下列物理化学性质；
(1)酶活性
该酶在水解酯化合物成为羧基和醇中以及在酯化合物与醇之间的酯交换反应中充当催化剂；
(2)底物特异性
该酶主要水解6-氨基苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的(R)型；
对于直链脂肪酸和对-硝基苯酚的酯，脂肪酸中碳原子的数量越少，水解活性越强；
(3)分子量
该酶的分子量是50000±2000(SDS-PAGE)；
(4)最适pH
水解最适发生在pH7-10；
(5)最适温度
水解最适发生在55℃到60℃；
(6)温度稳定性
在pH7.2，温度在60℃以下，90％的水解活性可以保持30分钟；
(7)pH稳定性
该酶在pH5-10的范围内稳定；
(8)抑制剂
30℃下在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)中用不同的抑制剂处理30分钟时，用硫酸铜(1mM)该酶失去30％的活性，用苯甲基磺酰氟(0.1mM)失去85％，用二异丙基氟磷酸(0.5mM)失去15％。用月桂基硫酸钠(5mM)或脱氧胆酸钠(5mM)没有观察到该酶活性的降低。
2．一种产生权利要求1的酯酶的方法，其中培养产生权利要求1的酯酶的假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的微生物，并且从最终的培养物中分离出所说的酯酶。
3．如权利要求2所要求的方法，其中所说的假诺卡氏菌属的微生物是嗜热假诺卡氏菌(Pseudonocardia thermophila)FERM-BP-6275。
4．一种用于光学拆分(R)-酯化合物和(S)-酯化合物的混合物的方法，该方法包括以下步骤
(a)在反应介质中，将权利要求1描述的酯酶与(R)-酯化合物和(S)-酯化合物的混合物接触，以便通过立体有择水解(R)-酯化合物和(S)-酯化合物之一，得到一种光学活性酸化合物；
(b)从反应介质中回收光活性酸化合物或没有水解和保持的光活性酯。
5．如权利要求4所要求的方法，其中所说的酯酶是选自下组的一种形式：分离的和纯化的酶、粗制酶制剂、具有酯酶的微生物细胞、所说微生物的培养物上清液、所说微生物的细胞碎片、所说微生物细胞的抽提物、以及固定化酯酶或具有所说酯酶的微生物的细胞。
6．如权利要求4或5所要求的方法，其中所说的酯化合物是式(Ⅰ)的苯并二氢吡喃化合物：
Figure A9811724300031
其中R1是一个具有1-5个碳原子的直链或支链烷基，并且R2是一个氢原子或一个取代的或未取代的氨基。
7．一种用于产生光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸或光活性酯的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在反应介质中，将式(Ⅰ)的(3R)-和(3S)-苯并二氢吡喃-3-乙酸酯的混合物与一种具有旋光选择性的水解活性的酯水解酶接触，以获得一种光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸化合物：
Figure A9811724300032
其中R1是一个具有1-5个碳原子的直链或支链烷基，并且R2是一个氢原子或一个取代的或未取代的氨基，并且
(b)从反应介质中回收光活性苯并二氢吡喃-3-乙酸化合物或没有水解和保持的活性的光活性酯。
8．如权利要求7所要求的方法，其中酯水解酶是选自下组的一种形式：分离的和纯化的酶、粗制酶制剂、具有酯酶的微生物细胞、所说微生物的培养物上清液、所说微生物的细胞碎片、所说微生物细胞的抽提物、以及固定化酯酶或具有所说酯酶的微生物细胞。
9．如权利要求8所要求的方法，其中所说微生物是选自下组的微生物：假诺卡氏菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)和高温放线菌属(Thermoactinomyces)。
10．如权利要求9所要求的方法，其中所说微生物是选自下组的微生物：嗜热假诺卡氏菌FERM-BP-6276，海床黄杆菌(Flavobacterium okeanokoites)FERM-BP-6276和糖高温放线菌(Thermoactinomyces sacchari)ATCC-27375。
11．如权利要求4所要求的方法，其中所说的反应介质包含水和非混溶性有机溶剂的两相系统。
12．如权利要求7所要求的方法，其中所说的反应介质包含水和非混溶性有机溶剂的两相系统。
13．如权利要求11或12所要求的方法，其中所说的非混溶性有机溶剂是芳香族糖类。
14．如权利要求11或12所要求的方法，其中所说的非混溶性有机溶剂是甲苯或二甲苯。
15．如权利要求11或12所要求的方法，其中在水中添加的非混溶性有机溶剂的量是1.0-40.0％(V/V)。
16．如权利要求6或7所要求的方法，其中R2是氨基。
17．如权利要求6或7所要求的方法，其中R1是甲基或乙基。
CN98117243A 1997-07-18 1998-07-18 新的酯酶和产生光活性苯并二氢吡喃化合物的方法 Pending CN1218110A (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP193949/97 1997-07-18
JP19394997 1997-07-18
JP21975897 1997-08-01
JP219758/97 1997-08-01
JP319995/97 1997-11-20
JP31999597 1997-11-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1218110A true CN1218110A (zh) 1999-06-02

Family

ID=27326840

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN98117243A Pending CN1218110A (zh) 1997-07-18 1998-07-18 新的酯酶和产生光活性苯并二氢吡喃化合物的方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US6060290A (zh)
EP (1) EP0892044B1 (zh)
KR (1) KR100300443B1 (zh)
CN (1) CN1218110A (zh)
DE (1) DE69828338T2 (zh)
HU (1) HUP9801621A3 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101979528A (zh) * 2010-10-21 2011-02-23 北京农业生物技术研究中心 一种酯酶及其编码基因与应用
CN101688208B (zh) * 2007-07-04 2016-10-12 DPx控股有限公司 酯酶的制备

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0892044B1 (en) * 1997-07-18 2004-12-29 Mitsui Chemicals, Inc. Esterase and its use for the production of optically active chroman compounds
KR20030012964A (ko) * 2001-08-06 2003-02-14 주식회사 제노포커스 광학활성 α-치환 헤테로시클릭카르복실산 에스테르의제조방법
JP2009540848A (ja) 2006-06-27 2009-11-26 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア エステラーゼ活性を有するタンパク質
EP2245146B1 (en) 2007-12-20 2015-04-01 Basf Se New calb muteins and their use
EP3572523A1 (en) * 2018-05-25 2019-11-27 Bayer Aktiengesellschaft Novel carboxyesterhydrolases

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4430089A1 (de) * 1994-08-25 1996-02-29 Bayer Ag Verfahren zur enzymatischen Herstellung von enantiomerenreinen Chroman-2-carbonsäuren und deren Derivaten
US5658796A (en) * 1995-06-07 1997-08-19 Seprachem, Inc. Optical resolution of alkyl chroman-2-carboxylates
TW363051B (en) * 1995-08-31 1999-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals Substituted amidine derivatives and platelet aggregation inhibitor containing the same
EP0892044B1 (en) * 1997-07-18 2004-12-29 Mitsui Chemicals, Inc. Esterase and its use for the production of optically active chroman compounds

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101688208B (zh) * 2007-07-04 2016-10-12 DPx控股有限公司 酯酶的制备
CN101979528A (zh) * 2010-10-21 2011-02-23 北京农业生物技术研究中心 一种酯酶及其编码基因与应用
CN101979528B (zh) * 2010-10-21 2012-05-30 北京农业生物技术研究中心 一种酯酶及其编码基因与应用

Also Published As

Publication number Publication date
US6303349B1 (en) 2001-10-16
KR100300443B1 (ko) 2001-09-06
DE69828338T2 (de) 2005-06-02
DE69828338D1 (de) 2005-02-03
KR19990013989A (ko) 1999-02-25
EP0892044A2 (en) 1999-01-20
US6060290A (en) 2000-05-09
EP0892044B1 (en) 2004-12-29
HU9801621D0 (en) 1998-09-28
EP0892044A3 (en) 2001-05-02
HUP9801621A3 (en) 2001-08-28
HUP9801621A2 (hu) 1999-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0737751A2 (en) Method for producing optically active ester of gamma-substituted-beta-hydroxybutyric acid
CN101535467B (zh) 左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法
CN1218110A (zh) 新的酯酶和产生光活性苯并二氢吡喃化合物的方法
US5155030A (en) Process for preparing optically active (R)-(-)-3-halo-1,2-propanediol from an epihalohydrin by a strain of corynebacterium or microbacterium
WO2007026860A1 (ja) 光学活性α－ヒドロキシカルボン酸の製造方法
JP4042454B2 (ja) 光学活性３−メチルグルタル酸モノエステルの製造方法
JP4765358B2 (ja) 光学活性なｎ−保護−プロパルギルグリシンの製造方法
JP2005117905A (ja) 光学活性１−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法
US7125692B2 (en) Process for producing monomer
JP2840723B2 (ja) ４‐ハロ‐３‐ヒドロキシブチロニトリルの製造法
JP3866357B2 (ja) 熱安定性耐溶媒性エステル分解酵素
KR100260837B1 (ko) 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법
JP2983695B2 (ja) ４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸の製造法
EP0745681A2 (en) Optical resolution of chlorohydrin with microorganism
JPH0632634B2 (ja) 光学活性カルボン酸エステルの製造法
JPH1080298A (ja) ２−ハロ−２−フルオロシクロプロパンカルボン酸の光学活性体の製造方法
JP3088205B2 (ja) 光学活性１，３−ブタンジオールの製法
EP0570593A1 (en) Process for producing optically active norborneol
JP3917723B2 (ja) ラクトン加水分解酵素およびその製造法
JPH11206398A (ja) 光学活性クロマン−３−酢酸類及びそのエステルの製造法
JP3893721B2 (ja) 光学活性化合物の製造方法
JP2946055B2 (ja) 光学活性（ｓ）‐（＋）‐３‐ハロ‐１，２―プロパンジオールの製造法
US20060194295A1 (en) Novel, esterase, fungus capable of producing the same and method for producing the same
JPS6363396A (ja) ｄ−２−（６−メトキシ−２−ナフチル）プロピオン酸の製造方法
JPH0636756B2 (ja) 光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication