CN101535467B - 左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法 - Google Patents

左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株左旋内酯专一性水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法。所说的酶产生菌为镰孢菌Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002，保藏号为CGMCC 1494。以该霉菌的菌丝体、粗酶提取物或它们的固定化衍生物为生物催化剂，对一系列外消旋的手性内酯进行对映选择性水解拆分，制备获得了多种光学活性的(+)-羟基酸和(+)-内酯，后者可化学水解为(-)-羟基酸。其中，(+)-α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁酸，即俗称的D-(+)-泛解酸，经过简单的酸化处理，即可制备获得在饲料和日化工业上非常有用的手性中间体D-(-)-泛解酸内酯。

Description

左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法
技术领域
本发明涉及一株高选择性左旋内酯水解酶产生菌以及利用该菌株制备手性羟基酸或相应内酯的技术方法。
技术背景
羟基酸，例如乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和葡萄糖酸等，是一类非常重要的有机酸，在生物体内具有独特的生理功能，而在食品/饲料工业上又是一类非常有用的功能添加剂。这种情形与氨基酸十分相似，二者在一定条件下也可以相互转化。一些非天然的羟基酸，特别是具有光学活性的手性羟基酸，还可以作为“结构砌块”用于各种天然产物和药物分子的化学合成。
除单纯的α-羟基酸之外，β-羟基酸、γ-羟基酸和羟基在末端的ω-羟基酸均可以在酸性条件下脱水闭环形成四元环、五元环或多元环的内酯化合物，分别称为β-内酯、γ-内酯或ω-内酯。β-内酯和γ-内酯通常具有水果香味，而某些大环ω-内酯具有麝香香味，它们在食品和化妆品工业中有重要应用价值。另外，某些昆虫激素和植物生长调节剂也是内酯化合物。内酯不但可以水解为相应的羟基酸，而且可以容易地与其它的醇/胺等亲核试剂缩合形成多种羟基酯/羟基酰胺等衍生物，因此在精细化工和制药工业具有广泛用途。
在各种内酯化合物中，γ-内酯由于具有稳定的五元环结构，因此比较常见和有用。在α/β-位被单取代或多取代的γ-内酯，其结构存在于许多天然产物中，包含这种结构的化合物往往具有多种生物活性(例如细胞毒性和抗真菌活性)，因此该类化合物有可能被筛选为新的抗肿瘤或抗菌药物。这类化合物分子中一般含有不对称的手性碳原子，它们的生物活性往往是与它们的光学活性联系在一起的。合成光学活性的内酯化合物，并对其生物活性和构效关系进行研究是一项具有重要意义的工作，有助于人们发现新型药物。
通过传统的化学方法合成光学纯手性内酯需要经过复杂的步骤并使用特殊的催化剂，通常产率不高，存在污染和毒性问题等种种缺点，而生物催化合成法具有绿色化学的优点，方法简单、条件温和、反应较快，日益获得广泛的关注。
例如，α-羟基-γ-丁内酯是一种有用的光学活性物质。富士药品工业的坂本惠司等(JP9308497)使用一种镰孢霉菌Fusarium oxysporum催化α-羟基-γ-丁内酯的选择性开环水解，得到(S)-(+)-α-羟基-γ-丁内酯和(R)-(+)-α-羟基-γ-丁酸，后者经过酸化内酯化，得到光学纯度96％的(R)-(-)-α-羟基-γ-丁内酯，收率达40％。
又如，β-羟基-γ-丁内酯是非常重要的手性结构砌块，(S)-β-羟基-γ-丁内酯是降血脂药物阿伐他汀，神经介质L-(-)-肉碱，HIV蛋白酶抑制剂氨普那韦(Amprenavir)，治疗皮肤病药羟基二十碳四烯酸，抗癌药Aplysistatint等药物的关键中间体。将(S)-(-)-β-羟基-γ-丁内酯还原可得(S)-(-)-β-羟基四氢呋喃，后者是艾滋病治疗药物的一种重要中间体；将(-)-β-羟基-γ-丁内酯转化为(-)-5-羟甲基-1，3-唑啉-2-酮可得最新一代的抗菌药物。此外，从(-)-β-羟基-γ-丁内酯出发还可以合成很多重要的天然化合物，而(R)-(+)-β-羟基-γ-丁内酯也是一种非常重要的有机合成中间体。目前主要由化学法合成得到(-)-β-羟基-γ-丁内酯。Henrot(Synth Commun，1986，16(2)：183～190)以(-)-苹果酸为原料，经甲酯化生成(-)-苹果酸二甲酯，再经还原和酯交换后生成(-)-β-羟基-γ-丁内酯。Tanaka(Synthesis，1987，6：570～573)以D-异抗坏血酸为原料，经六步反应合成了(-)-β-羟基-γ-丁内酯。Suzuki等(Enzym.Microb.Technol.，1999，24：13-20)使用Pseudomonas sp.以及Enterobacter sp.等微生物的脱氯酶选择性地对外消旋4-氯-3-羟基丁酸酯的(-)-对映体进行脱氯反应，得到(-)-β-羟基-γ-丁内酯和剩余的(+)-4-氯-3-羟基丁酸酯。
再如，(-)-α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁内酯，俗称D-(-)-泛解酸内酯，是制备D-泛酸钙和D-泛醇的重要合成中间体。D-泛酸钙(又称维生素B5)是重要的维生素之一，广泛用于医药、饲料和食品行业中。
Figure GPA00000642113400021
等(Enzyme MicrobTechnol，1988，10：689～690)使用脂肪酶对O-乙酰泛解酸内酯进行拆分，Adam等(Synthesis，1988，5：373～375)则使用腈水解酶制备了(-)-泛解酸内酯，也有人(Appl.Microbiol，1974，27(1)：130～134；Enzyme Microb Technol，1987，9(7)：411～416；Agric Biol Chem，1987，51：289～290；Agric Biol Chem，1987，51：3011～3016；Tetrahedron：Asymmetry，1994，5(8)：1419～1423)尝试利用氧化还原酶通过不对称氧化还原反应制备(-)-泛解酸内酯；1994年日本京都大学Shimizu等(Appl.Microbiol.Biotechnol，1995，44：333～338)使用Fusariumoxysporum AKU3702催化拆分消旋泛解酸内酯；2002年我国江南大学孙志浩等人(Process Biochem，2002，38：545～549)使用Fusarium moniliforme SW-902酶法拆分泛解酸内酯，均得到光学纯度较高的D-(-)-泛解酸内酯。
尽管在现有的手性羟基酸合成技术中，无论是化学拆分法还是现有的生物法都已取得一定进展，但仍然存在底物浓度比较低，产物光学纯度不够高，催化剂活力不够强等或这或那的缺点，影响了这些方法在工业上的应用效果。并且，目前找到的适合生物法产生手性羟基酸的菌株大多只能针对单一或少数的底物，应用不广泛。
发明内容
本发明人经过长期的研究和反复的筛选试验，意外地筛选到一株可产生左旋内酯水解酶的镰孢菌，该菌株对底物的耐受性很强，可催化多种底物内酯的对映选择性水解，生成相应的手性羟基酸，并且其催化能力强，产物光学纯度高。因此，本发明解决的技术问题是公开一株左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法，以克服现有技术的缺陷。
在本发明的第一方面，提供一株产左旋内酯水解酶的镰孢菌Fusariumproliferatum Nirenberg ECU2002，保藏号为CGMCC 1494。
在另一优选例中，所述的菌含有一DNA，所述的DNA具有SEQ ID NO：1中第86-1206位所示的核苷酸序列。该DNA编码一种左旋内酯水解酶。
在另一优选例中，所述的DNA具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供一种采用所述的镰孢菌Fusarium proliferatumNirenberg ECU2002制备手性羟基酸的方法，包括如下步骤：
(1)培养所述的镰孢菌Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002，获得培养物；
(2)将步骤(1)的培养物或其提取物与外消旋手性内酯底物(即(±)-内酯底物)接触，从而水解(-)-内酯，生成(+)-羟基酸。
在另一优选例中，
在步骤(1)中，将所说的镰孢菌Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002在包含碳、氮、磷及无机盐的培养基中进行发酵，获得培养物；
在步骤(2)中，将步骤(1)获得的培养物或其提取物作为催化剂，催化内酯底物的对映选择性水解，分离去除未被水解的(+)-内酯，获得由(-)-内酯水解生成的(+)-羟基酸；
所说的内酯底物包括(但不限于)：β-丁内酯，α-羟基-γ-丁内酯，α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁内酯，α-乙酰基-γ-丁内酯，β-羟基-γ-丁内酯，正丁基苯酞等。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述培养物的提取物选自：
将所述的培养物进行离心或过滤后获得的菌丝体；
将所述的培养物去除菌体后获得的发酵上清液；
将菌丝体破碎，抽提得到的无细胞提取液；或
固定化的细胞或固定化的细胞提取物。
在另一优选例中，所说的培养基的组成和浓度如下：甘油10～50g/L，蛋白胨1～20g/L，酵母膏1～20g/L，硝酸铵1～10g/L，无机盐：NaCl 0.1～2g/L；MgSO4·7H2O 0.1～2g/L；FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/L；ZnSO4·7H2O 0.01～0.05g/L；CuSO4·5H2O 0.001～0.01g/L；
在另一优选例中，发酵条件为：
pH 5～9，温度25～35℃，基于发酵培养基体积的接种量按照体积比为1～10％，发酵时间12～48h。
在另一优选例中，内酯底物的浓度按照重量体积比为1～75％，基于底物内酯重量的催化剂使用量为0.25～1.5克细胞/克内酯或者0.25～10单位酶/克内酯，反应温度为25～40℃，pH 6.0～8.0，反应时间为0.1～40h。
在另一优选例中，所述的内酯底物为(±)-α-羟基-γ-丁内酯。
在另一优选例中，所述的内酯底物为(±)-泛解酸内酯。
在另一优选例中，催化剂为下列形式中的任意一种：
(1)将镰孢菌ECU2002进行液体或固体培养后通过离心或过滤收集到的菌丝体；
(2)去除菌体后所剩余的发酵上清液；
(3)采用研磨或匀浆等方法将菌丝体破碎，再用水或缓冲液抽提所得的无细胞提取液；
(4)固定化细胞或固定化酶。
在另一优选例中，在步骤(2)之后，还包括步骤：将(+)-羟基酸在酸性条件下脱水闭环，从而获得(-)-内酯。
更优选的，所述的酸性条件是pH 1～4。
在本发明的第三方面，提供所述的镰孢菌的用途，其特征在于，用于产生左旋内酯水解酶催化剂，从而用于制备手性羟基酸或者手性内酯。
本发明提到的左旋内酯酶产生菌--镰孢菌(又称镰孢霉菌)Fusariumproliferatum Nirenberg ECU2002，是最近从土壤中新分离到的一株专一性(-)-内酯水解酶产生菌，该菌株已于2005年10月17日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 1494。
本发明菌株的分离筛选方法简述如下：
采集了不同环境条件下400份土壤样品，分别使用γ-丁内酯，DL-泛解酸内酯，DL-泛解酸钠，D-泛酸钙，D-(-)-泛解酸内酯，L-(+)-泛解酸内酯，或D-泛解酸钠等为唯一碳源进行富集培养，筛选(-)-内酯水解酶产生菌。
(1)将土样置于试管中，加入2mL富集培养基A(g/L)(底物1.0，NaNO34.0，KH2PO44.0，MgSO40.1，KCl 0.5，ZnSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O 0.05)，在30℃，200r/min富集培养1天，保留有明显微生物生长迹象的试管，每管取0.2mL富集培养液，加入装有1.8mL已灭菌的富集培养基B(g/L)(底物5.0，NaNO34.0，KH2PO44.0，MgSO40.1，KCl 0.5，ZnSO4·7H2O 0.1，CuSO4·5H2O0.05)，在30℃，200r/min培养1～2天，每管取0.1mL富集培养液涂布于加有溴酚蓝指示剂的平板培养基C(g/L)(底物5.0，甘油10，酵母膏7.5，蛋白胨7.5，琼脂20)上，30℃培养2～3天。有水解活性的菌株在平板培养基C上产生水解圈，菌落周围的培养基由蓝色变为黄色，经进一步分离纯化获得单菌落。
(2)将单菌落接种到100mL丰富培养基D(甘油10，酵母膏7.5，蛋白胨7.5)，30℃，160r/min培养2～3天。经过抽滤或者离心得到湿菌体，加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)和1％(w/v)的底物α-羟基-γ-丁内酯，在30℃，160r/min反应12h。加入乙酸乙酯萃取剩余底物，将剩余水相中的产物内酯化后用乙酸乙酯萃取，取样分析水解产物羟基酸和剩余底物内酯的光学纯度。
(3)通过反复筛选，分离得到一株产专一性(-)-内酯水解酶的镰孢菌株(Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002)。
所说的镰孢菌(Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002)具有如下微生物学特征：
在固体培养基上培养三天，产生大量粉红色基内菌丝，其气生菌丝呈白色绒毛状，有黄色色素产生，其菌落直径约为25mm；在液体培养基中为丝状体，初期有较多小型分生孢子，大小为6～15μm×3～4μm，后期有褐色色素产生。分生孢子梗分枝，孢子梗长约25μm，聚生或散生，小分生孢子以链状着生于散生或聚生的孢子梗上，在低倍显微镜下观察，在孢子梗上，分生孢子链呈“V”型。没有观察到大型分生孢子，也无厚垣孢子，可在温度10～60℃，pH 4.0～9.0和NaCl浓度0～7％(w/v)的环境中生存。
该菌株经德国DSMZ公司鉴定为Fusarium proliferatum Nirenberg类群。与以前文献(Appl.Microbiol.Biotechnol，1995，44：333～338；Process Biochem，2002，38：545～549)报道的Fusarium moniliforme SW-902和Fusariumoxysporum AKU3702有明显的不同，其主要不同之处在于：本发明的Fusariumproliferatum ECU2002为粉红色真菌，初期有较多小型分生孢子，产酶发酵时间较短为1～2天，而文献报道的Fusarium moniliforme SW-902和Fusariumoxysporum AKU3702为白色真菌，其孢子呈珠状较大，Fusarium moniliformeSW-902产酶发酵时间为2～3天，Fusarium oxysporum AKU3702产酶发酵时间较长为5～7天，而Fusarium oxysporum AKU3702更是一种植物致病菌。此外，本发明的Fusarium proliferatum ECU2002能水解多种内酯底物生成相应的手性羟基酸，并且对底物的浓度耐受性很强，如催化D-(-)-泛解酸内酯水解时底物浓度可高达75％w/v(文献报道的底物浓度一般为10～30％，w/v)，经过重结晶后，产物(-)-内酯的光学纯度超过99％ee。
本发明的镰孢菌(Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002)可以用于制备手性羟基酸，包括如下步骤：
(1)将所说的镰孢菌(Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002)在包含碳、氮、磷及其它无机盐的培养基中进行发酵，获得培养物；
所说的培养基的组成和浓度(g/L)如下：
甘油10～50，蛋白胨1～20，酵母膏1～20，硝酸铵1～10，无机盐：NaCl0.1～2；MgSO4·7H2O 0.1～2；FeSO4·7H2O 0.01～0.05；ZnSO4·7H2O 0.01～0.05；CuSO4·5H2O 0.001～0.01；pH 5～9，温度25～35℃，基于培养基体积的接种量为1～10％v/v，培养时间12～48小时；
(2)将催化剂与需要拆分的底物手性内酯化合物接触，进行对映选择性催化水解反应，然后从反应产物中收集未水解的(+)-内酯和由(-)-内酯水解生成的(+)-羟基酸；
底物内酯的浓度为1～75％(w/v)，基于底物内酯重量的催化剂使用量为0.25～1.5克细胞/克内酯或者0.25～10单位酶/克内酯，反应温度为25～40℃，pH 6.0～8.0，反应时间为0.1～40h；
选用γ-丁内酯作为内酯水解酶活力测定的底物，采用如下方法测定内酯水解酶的活力：
在10mL含有2％(w/v)γ-丁内酯的水相反应体系中，加入待测的催化剂，在30℃、磁力搅拌条件下滴加0.1M的NaOH，维持反应液pH为7.0，测定消耗100μl NaOH溶液所需的时间。酶活单位(U)的定义为：在上述条件下，1min催化1μmolγ-丁内酯水解为对应的羟基酸所需的酶量。
所说的催化剂是下列形式中的任意一种：
(1)将镰孢霉菌ECU2002进行液体或固体培养后，通过离心或过滤收集到的菌丝体(含有大部分(-)-内酯酶)；
(2)去除菌体后所剩余的发酵上清液(含有小部分分泌到胞外的游离(-)-内酯酶)；
(3)采用研磨或匀浆等方法将菌丝体破碎，再用水或缓冲液抽提所得的无细胞提取液；
(4)采用适当的方法，例如凝胶包埋、戊二醛交联或载体吸附等，处理上述含有活性酶组分的物料所得到的固定化细胞或固定化酶；
所说的内酯底物包括但不限于：β-丁内酯，α-羟基-γ-丁内酯，α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁内酯(俗称泛解酸内酯)，α-乙酰基-γ-丁内酯，β-羟基-γ-丁内酯，正丁基苯酞等。
优选的底物内酯为(±)-α-羟基-γ-丁内酯。
优选的底物内酯为(±)-泛解酸内酯。
本发明的菌株产酶稳定，立体选择性好，可以直接用发酵获得的菌丝体作为酶源，水解拆分外消旋内酯得到高光学纯度的手性羟基酸和剩余内酯。
使用本发明的拆分工艺，能简单方便地获得各种类型的高光学纯度手性羟基酸，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药工业的需要，以下通过具体实施例对本发明的技术内容作进一步的描述。
附图说明
图1为固定化细胞催化10％(w/v)α-羟基-γ-丁内酯的多批次水解拆分反应结果。
图2为固定化细胞催化20％(w/v)泛解酸内酯的多批次水解拆分反应结果。
图3为固定化酶催化35％(w/v)泛解酸内酯的多批次水解拆分反应结果。
图4为固定化酶催化拆分75％(w/v)泛解酸内酯的反应进程。
具体实施方式
实施例1镰孢霉菌Fusarium proliferatum ECU2002的发酵培养
斜面及平板培养基(g/L)：甘油30，酵母膏7.5，蛋白胨7.5，琼脂20。在121℃灭菌15分钟，灭菌后冷却、制成平板、接种，30℃培养2天。发酵培养基(g/L)：甘油30；蛋白胨10；酵母膏10；NH4NO33；无机盐(g/L)(NaCl1；MgSO4·7H2O 1；FeSO4·7H2O 0.02；ZnSO4·7H2O 0.03；CuSO4·5H2O 0.005)；pH7.5。121℃灭菌15分钟，灭菌后冷却、接种，接种量2％，在30℃，转速160r/min的条件下进行发酵，培养2天菌体干重达到18g/L，产酶可达90U/L以上，比活力为5U/g。
实施例2细胞碎片的固定化
1)取50g镰孢菌Fusarium proliferatum ECU2002细胞，加入5g石英砂研磨1h进行细胞破壁，12,000rpm离心15min，上清液为无细胞抽提液，沉淀为细胞碎片。
2)取细胞碎片5g，加入不同的载体，将细胞碎片固定化后测活，并于4℃贮存1周后测定其残余活力(结果见表1)。
3)以戊二醛交联固定化的细胞碎片为酶源，(±)-泛解酸内酯为底物，反应体积20mL，底物浓度为2M，投入固定化细胞碎片10g，反应温度为30℃，滴加3M氨水维持反应液pH恒定在7.0，反应24h后，转化率为34.4％，产物(-)-泛解酸内酯的光学纯度为94.6％。
表1不同载体固定细胞碎片的催化活力
Figure GPA00000642113400081
Figure GPA00000642113400091
实施例3～13Fusarium proliferatum ECU2002固定化细胞对一系列内酯化合物的水解活力
以下列表2中一系列内酯为底物，底物浓度为100mM，反应体积10mL，投入0.2g固定化细胞(以15mM戊二醛在30℃交联3h所得的细胞)，在30℃、磁力搅拌下反应0.1～0.5h后测定活力。表2列出了不同内酯水解时，固定化细胞所表现出来的相对活力。以γ-丁内酯的活力为100％，固定化细胞对结构比较复杂的内酯(比如说正丁基苯酞)的水解效果不是很明显，酶的活力仅为25％。固定化细胞对α-取代内酯表现了很高的活力，当底物为α-羟基-γ-丁内酯时，活力最大，为γ-丁内酯活力的54倍之多。以(±)-泛解酸内酯和(-)-泛解酸内酯为例，固定化细胞活力分别为γ-丁内酯活力的14.7和21倍。
表2.固定化细胞对一系列内酯化合物的催化活性
Figure GPA00000642113400092
Figure GPA00000642113400101
实施例14～17以Fusarium proliferatum ECU2002粗酶提取物拆分手性内酯
以ECU2002粗酶提取物为酶源，(±)-β-丁内酯、(±)-α-羟基-γ-丁内酯、(±)-β-羟基-γ-丁内酯和(±)-泛解酸内酯为底物，反应体积20mL，底物浓度为100mM，投入粗酶13U，反应温度为30℃，反应时间为0.2～12h，滴加NaOH维持反应液pH恒定在7.0，通过碱消耗量计算转化率。通过实验发现(±)-泛解酸内酯作为底物时，选择性水解(-)-内酯底物生成(+)-羟基酸，2h转化率即高达38.2％，而(+)-羟基酸在酸性条件下pH＝1，90℃加热0.5h时转化为(-)-内酯产物(-)-泛解酸内酯的光学纯度最高达到98.2％ee。而(±)-α-羟基-γ-丁内酯，结果与(±)-泛解酸内酯相似，但是它的反应时间大大缩短，转化率达到44.2％，产生的(+)-羟基酸在酸性条件下pH＝1，90℃加热0.5h时转化的产物(-)-α-羟基-γ-丁内酯的光学纯度96.3％ee时，仅需0.2h，反应初速度也最快，达52.6μM/min，此时酶的对映选择率(E值)为27.6。
表3内酯酶的粗提取物对几种手性内酯化合物的催化拆分效果
Figure GPA00000642113400111
实施例18固定化细胞催化(±)-α-羟基-γ-丁内酯的多批次水解反应(浓度10％w/v)
在底物(±)-α-羟基-γ-丁内酯浓度为1M(10％w/v)的20mL反应体系中，加入戊二醛交联固定化的细胞0.1g，在30℃、160rpm的条件下反应10h，加入氨水调节控制反应的pH在6.8～7.5。重复操作10次。结果如图1所示，在10批次水解反应后，固定化酶的活力仅下降了10％，酶的半衰期达36个批次，在第10次水解反应时，反应的转化率仍然能够维持在40％左右。此时产生的(+)-羟基酸在酸性条件下(pH＝3)，80℃加热4h时全部转化为(-)-α-羟基-γ-丁内酯。产物(-)-α-羟基-γ-丁内酯的光学纯度保持在93-96％ee之间。上述结果表明此固定化细胞在对α-羟基-γ-丁内酯进行水解拆分反应时，具有良好的对映选择性和优异的操作稳定性。
实施例19固定化细胞催化泛解酸内酯的多批次水解反应(浓度20％w/v)
在底物(±)-泛解酸内酯浓度为1.5M(20％w/v)的50mL反应体系中，加入戊二醛交联固定化的细胞15g，在30℃、160rpm的条件下反应10h，加入氨水调节控制反应的pH在6.5～7.0。重复操作30次，以游离细胞为对照。结果如图2所示，固定化催化剂可反复回用30次以上，可进行多次酶促水解反应，而且均达到了令人满意的拆分效果，具有潜在的工业应用价值。
实施例20固定化酶催化泛解酸内酯的多批次水解反应(浓度为35％w/v)
1)固定化酶的制备：在冰浴中，向细胞粗提液中缓慢加入二分之一体积的冷丙酮，缓慢搅拌0.5h后加入20mM戊二醛交联4h，于4℃、14,000rpm离心15min，并以生理盐水洗涤2次。2)在底物(±)-泛解酸内酯浓度为2.7M(35％w/v)的20mL反应体系中，加入60U固定化酶，在30℃，120rpm的条件下反应6h，加入氨水(3M)调节控制反应的pH在6.5～7.0，重复操作10次。结果如图3所示，在10次水解反应后，固定化酶的活力下降了33％，酶的半衰期大约为17个批次，产物的光学纯度保持95％ee以上。在第10次水解反应时，反应的转化率仍然能够维持在30％左右，产物经过10次反应后累积至大约30g。上述结果表明了此固定化内酯酶具有良好的对映选择性和很好的操作稳定性。
实施例21用固定化酶催化拆分高浓度(75％w/v)的(±)-泛解酸内酯
在20mL的反应体系中，加入底物浓度为5.7M(75％w/v)的(±)-泛解酸内酯，并投入40.0U的固定化酶，在160rpm，30℃反应，滴加氨水(3M)控制反应pH在7.2。反应进程如图4所示，反应进行36h后，转化率为36.8％，此时产生的(+)-羟基酸在酸性条件下(pH＝2)，80℃加热1h时转化为(-)-内酯。产物(-)-泛解酸内酯的光学纯度仍然＞90％ee。经过重结晶后产物的光学纯度可达到＞99％ee。
实施例22内酯水解酶基因的克隆
1.取镰孢霉菌丝体0.5克，液氮速冻并研磨成粉末，快速将粉末移入1.5mlDEPC水处理过的EP管中，按总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，取适量的总RNA样品，测定OD260、OD280、OD230的吸光度，计算总RNA的浓度并估计纯度。同时进行RNA电泳确定总RNA的完整性。
2.从操作1得到的总RNA中分离提取mRNA，参照生工公司的mRNA分离试剂盒说明书进行操作。
3.利用生工逆转录试剂盒，以2中分离得到的mRNA为模板，合成cDNA第一链，参照生工公司cDNA合成试剂盒说明书进行操作。
4.根据mRNA的结构及编码左旋内酯水解酶cDNA基因的同源序列分析，设计以下引物：
引物1(SEQ ID NO：3)：GGAACATATGCCTTCTTCCATTTCTGT(画线部分为Nde I酶切位点)
引物2(SEQ ID NO：4)：GGACCATATGGCTAAGCTTCCTTCTACG
引物3(SEQ ID NO：5)：AAGGGGATCCCTAATCATAGAGCTTGGGAC(画线部分为BamHI酶切位点)
分别利用引物1、3和引物2、3，以总cDNA第一链为模板，扩增左旋内酯水解酶cDNA基因，PCR反应参数为94℃30s，57℃30s，72℃80s，重复30个循环后72℃继续延伸10min。用0.7％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。PCR产物约25μl，用0.7％的琼脂糖电泳回收目的片段。利用DNA胶回收试剂盒进行回收，方法见DNA胶回收试剂盒说明书。
将回收的目的片段同载体pMD18-T(TaKaRa)进行连接，具体方法按pMD18-T载体试剂盒说明书进行，构建重组质粒pMD18-T-12(引物1和引物3)和pMD18-T-14(引物2和引物3)。然后按文献的方法将重组质粒电转化到E.coli JM109宿主菌中。
将转化后的菌液接种到3ml含50μg/ml氨苄青酶素(Amp)的LB培养基中，37℃培养过夜。碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Nde I和BamHI双酶切质粒用0.7％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，筛选阳性克隆菌，测序验证。
采用引物1和引物3进行PCR，获得的PCR产物序列如SEQ ID NO：1所示；利用引物2和引物3进行PCR，获得的PCR产物序列如SEQ ID NO：2所示。
将获得的上述序列在NCBI上进行核苷酸序列BLAST分析，结果发现，与目前已知的基因序列均不同。
菌株保藏
本发明的镰孢菌Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002已于2005年10月17日保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国，北京)，编号为CGMCC 1494。
  申请人或代理人档案号074483PCWO   国际申请号
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
Figure GPA00000642113400151
PCT/RO/134表(1992年7月)

Claims (7)

1.采用保藏号为CGMCC 1494的镰孢菌Fusarium proliferatum NirenbergECU2002制备手性羟基酸的方法，包括如下步骤：
(1)培养所述的镰孢菌Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002，获得培养物；
(2)将步骤(1)的培养物或其提取物与外消旋手性内酯底物接触，从而水解(-)-内酯，生成(+)-羟基酸，其中所述提取物为细胞碎片，所述外消旋手性内酯底物选自：β-丁内酯，α-羟基-γ-丁内酯，β-羟基-γ-丁内酯，α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁内酯，或α-乙酰基-γ-丁内酯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
在步骤(1)中，将所说的镰孢菌Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002在包含碳、氮、磷及无机盐的培养基中进行发酵，获得培养物；
在步骤(2)中，将步骤(1)获得的培养物或其提取物作为催化剂，催化内酯底物的对映选择性水解，分离除去未被水解的剩余(+)-内酯，获得由(-)-内酯水解生成的(+)-羟基酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的培养基的组成和浓度如下：甘油10～50g/L，蛋白胨1～20g/L，酵母膏1～20g/L，硝酸铵1～10g/L，无机盐：NaCl 0.1～2g/L；MgSO4·7H2O 0.1～2g/L；FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/L；ZnSO4·7H2O 0.01～0.05g/L；CuSO4·5H2O 0.001～0.01g/L；
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵条件为：
pH 5～9，温度25～35℃，基于发酵培养基体积的接种量按照体积比为1～10％，发酵时间12～48h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，内酯底物的浓度按照重量体积比为1～75％，基于底物内酯重量的催化剂使用量为0.25～1.5克细胞/克内酯或者0.25～10单位酶/克内酯，反应温度为25～40℃，pH 6.0～8.0，反应时间为0.1～40h。
6.一种制备(-)-内酯的方法，所述方法包括在权利要求2所述的方法的步骤(2)之后，将(+)-羟基酸在酸性条件下脱水闭环，从而获得(-)-内酯。
7.保藏号为CGMCC 1494的镰孢菌Fusarium proliferatum Nirenberg ECU2002的用途，其特征在于，用于产生左旋内酯水解酶。
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