CN106244505B

CN106244505B - 吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其产脂肪酶的方法

Info

Publication number: CN106244505B
Application number: CN201610880263.5A
Authority: CN
Inventors: 郦金龙; 李秀婷; 朱运平; 滕超; 熊科; 申卫家
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2016-10-09
Filing date: 2016-10-09
Publication date: 2019-08-27
Anticipated expiration: 2036-10-09
Also published as: CN106244505A

Abstract

本发明涉及吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其产脂肪酶的方法，属于环境微生物应用领域。本发明的咯伯克霍尔德氏菌B1213的用途为产脂肪酶；咯伯克霍尔德氏菌B1213培养液，优化后的脂肪酶活为180‑250U/mL；所述咯伯克霍尔德氏菌B1213保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。本发明采用咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶的方法，对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养即可。与本发明之前细菌、真菌产脂肪酶的方法相比，本发明产脂肪酶的方法，在菌种来源上具有新意，所产脂肪酶活性高，生产周期短，操作简单。

Description

吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其产脂肪酶的方法

技术领域

本发明涉及吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其产脂肪酶的方法，属于环境微生物应用领域。

背景技术

脂肪酶( EC 3.1.1.3) 又称三酰甘油酰基水解酶。在传统酶学中, 脂肪酶是一类水解长链脂肪酸甘油酯生成游离脂肪酸和甘油的界面酶。1984 年，Zaks 和 Klibanov在有机溶剂体系中,用脂肪酶成功地催化合成了一系列有机化合物^[1]。该研究揭开了非水相酶学的研究序幕, 并迅速发展为应用酶学研究中最为活跃、发展最为迅速的领域。脂肪酶作为非水相酶学中最为重要的一类酶，具有良好的酯化、转酯、醇解和胺解等特性^[2]。作为重要的工业用酶, 广泛应用于食品、饲料、制革、洗涤、油酯化工等传统工业领域。现在脂肪酶被广泛地应用于生物柴油制备、手型药物拆分等应用前景广阔的领域。脂肪酶在食品工业上的应用最早且最为广泛，例如脂肪酶水解生成的短链脂肪酸可用于增加食品本身的风味、香味和质构。在面类食品的生产中，将脂肪酶加入面粉中进行发酵，发现不仅面团的弹性明显提高，而且做成产品的感官品质也得到了增强。脂肪酶在乳制品中的作用非常重要，水解后的乳脂增加了新的风味物质如甲酯酮类，风味酯类等，而且产生的脂肪酸更能赋予乳制品的独有风味。

脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中，而微生物脂肪酶种类最多。微生物脂肪酶广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性和底物特异性，因此微生物产脂肪酶是大规模生产脂肪酶的主要途径。

目前，已知大约有2%的微生物产脂肪酶，至少包括 65个属的微生物，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其它真菌23个属，且不同微生物来源的脂肪酶其组成成分、理化特性各不相同。细菌脂肪酶在大规模商业化生产中扮演着重要角色。细菌脂肪酶大多数是胞外酶易于液体深层发酵，生产比较容易。细菌脂肪酶大多数是碱性脂肪酶，且在pH 4~11、温度 30℃~60℃间具有良好的稳定性。吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia），其应用主要在促进植物生长和植物病害的生物防治；目前还未有关于利用吡咯伯克霍尔德氏菌产脂肪酶的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够产脂肪酶的新菌株；及该菌株的应用和采用该菌株产脂肪酶的方法。

技术方案

本发明从土壤中筛选并分离出了一株新的菌株；是杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢。经鉴定，该菌株是一种吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）；命名为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213；保藏于中国普通微生物菌种保藏中心；保藏编号为CGMCC12806；保藏时间为2016年7月21日。

本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213能够产脂肪酶，所产脂肪酶呈弱碱性。

采用本发明的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶的其中一种方法为：对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养。

另外，实验证明，在橄榄油存在的情况下，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶的能力明显提高。橄榄油作为诱导剂，在不添加橄榄油的情况下，产脂肪酶的量非常少。

上述方法，优选的，在改良基础培养基存在的条件下，对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养；所述改良基础培养基，由基础培养基和橄榄油按照100:1的体积比组成，121℃灭菌15min；所述基础培养基，每1L中含有的成分为：蔗糖0-12g、蛋白胨5-35g、硫酸铵1.0g、三水合磷酸钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、蒸馏水余量，pH7.0。其中，基础培养基中蔗糖含量、蛋白胨含量的变化，均会对脂肪酶产量（体现为培养液的酶活）产生影响；优选的，蔗糖含量为1-7g/L；所述蛋白胨为胰蛋白胨胰蛋白胨含量20-25g/L。

具体的，将吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液接种于改良基础培养基，在150-200rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。

上述方法，优选的，培养条件为转速180rpm，温度35℃。其他条件相同情况下，在此培养条件下，所获得培养液中脂肪酶的酶活更高；优化后酶活为180-250U/mL。

上述方法，所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液是由吡咯伯克霍尔德氏菌B1213培养获得的。在获得吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的条件下，本领域技术人员通过常规操作即可以获得吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液。

本发明中，对于某个成分的含量的百分比，如果没有特别说明，均指重量百分比（w/w）。

本发明所用专业术语说明：rpm是转速单位，1 rpm是指每分钟旋转一转。

有益效果：

（1）首次分离培养出能够高产脂肪酶的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213；

（2）吡咯伯克霍尔德氏菌B1213培养液，优化后的脂肪酶活为180-250U/mL；

（3）与本发明之前细菌、真菌产脂肪酶相比，在菌种来源上具有新意；所产脂肪酶活性高，生产周期短，操作简单。

保藏信息：

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2016年7月21日；

保藏编号：CGMCCNo.12806；

分类命名：吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）。

附图说明

图1为本发明中所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的显微镜下形态特征；图1中，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为杆状的革兰氏阴性菌，且不能形成芽孢；

图2为菌株B1213在罗丹明B平板上生成的显色圈；图2中：在菌体周围产生了红色的颜色圈，证明B1213菌分解橄榄油产生了脂肪酸；

图3为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的16SrDNA序列系统发育分析；

图4为吡咯伯克霍尔德氏菌B1213的recA序列系统发育树分析；

图5 蔗糖添加量对B1213产脂肪酶的影响；

图6胰蛋白胨添加量对B1213产脂肪酶的影响；

图7 所产脂肪酶的硫酸铵分级沉淀曲线。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常用方法。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1菌株B1213的鉴定

菌株B1213分离自土壤，其形态如图1所示，属于杆状的革兰氏阴性菌，不能形成芽孢。提取其基因组DNA，并利用16s rDNA和BCR1引物对于该基因组DNA进行聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，并利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,简称NCBI)数据库进行菌株比对。

(1)16S rDNA 序列分析：

16s rDNA正向引物27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,如SEQ ID NO.1所示；

16s rDNA反向引物1492R：5'-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3'，如SEQ ID NO.2所示；

扩增所得16S rDNA序列如SEQ ID NO：3所示，序列全长为1411bp。将该扩增所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图3。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出菌株“B1213”与模式菌株Burkholderia stabilis LMG 28156、同源性达99.7％。

(2)recA基因序列分析

BCR1基因正向引物：5'-TgA CCg CCg AgA AgA gCA A-3' ，如SEQ ID NO.4所示；

BCR2基因反向引物：5'-CTC TTC TTC gTC CAT CgC CTC-3'，如SEQ ID NO.5所示；

扩增所得recA基因序列如SEQ ID NO：6所示，序列全长为974bp。将该扩增所得recA基因序列与GenBank数据库中的相关菌株的基因序列进行比较，用用MEGA4.1软件进行序列比对，采用临位连接法构建系统发育树，经1000次随机抽样，计算Bootstrap值，所构建的系统发育树如图4。图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。从NCBI上可以查出出菌株“B1213”与模式菌株Burkholderia pyrrocinia DSM10685T(CP011503)同源性达97.9％。

因此可以判定B1213为一种全新的吡咯伯克霍尔德氏菌。经过鉴定确认其所属菌种后，吡咯伯克霍尔德氏菌B1213于2016年7月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；此生物材料已经存活试验测试并通过该试验。

实施例2吡咯伯克霍尔德氏菌B1213液体摇瓶培养液制备

（1）斜面培养：吡咯伯克霍尔德氏菌B1213接种于斜面培养基上，在30℃下培养48小时，得斜面菌株。所用斜面培养基，每1L中含有的成分为：葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、琼脂 18.0g、蒸馏水余量，pH为中性，115℃ 灭菌20 min。

（2）取斜面菌株接种到已灭菌的种子培养基中，在180 rpm、35℃的条件下恒温震荡培养24h，得到种子培养液。所述种子培养基，每1L中含有的成分为：蛋白胨20.0g、酵母粉5.0g、三水合磷酸钾2.0g、七水合硫酸镁0.5g、橄榄油10.0mL、蒸馏水余量，pH7.0，121℃灭菌25min。

（3）将种子培养液以2mL的接种量、以无菌操作加入含有80mL改良基础培养基的摇瓶中，在180 rpm、30℃的条件下恒温震荡培养72h；得含脂肪酶培养液。所述基础培养基，每1L中含有的成分为：蔗糖5.0g、蛋白胨20.0g、硫酸铵1.0g、三水合磷酸钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、蒸馏水余量，pH7.0。所述改良基础培养基，由基础培养基和橄榄油按照100:1的体积比组成，121℃灭菌15min。橄榄油是作为诱导剂添加的，在不添加橄榄油的情况下，产脂肪酶的量非常少。

（4）在步骤3中，随着培养的进行，菌体数量不断增加，酶活不断升高，当B1213处于稳定期中期时脂肪酶的酶活不再升高、达到相对稳定状态时，培养完成；此时的酶活为最终酶活。

实施例3 脂肪酶酶活测定

（1）检测酶解液中对硝基苯酚浓度C；将 p-NPP（对硝基苯棕榈酸酯）溶于的异丙醇，得浓度为16.5mmol/L的 p-NPP溶液；然后将p-NPP溶液和浓度为0.2mmol/L的 Tris-Hcl缓冲液（含有0.4%TritonX-100，0.1%Arabic gum，0.4%和0.1%为质量浓度）按照100µL ：2.8mL比例混合；然后在37℃的水浴锅预热5min；最后加入100µL酶液，反应10min，放在冰上终止反应，获得酶解液；检测酶解液中对硝基苯酚浓度C。其中，对硝基苯酚浓度的检测方法可以采用现有的任意一种已知方法，测试方法的选择，不影响脂肪酶酶活测定结果。

（2）计算含脂肪酶培养液的脂肪酶酶活：一个酶活力单位定义为：每分钟释放1µmol 对硝基苯酚所需的酶量，用U表示。经计算，实施例2含脂肪酶培养液中脂肪酶的酶活为70.72U/mL。

实施例4 吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶优化1

将实施例2步骤（3）中所用改良基础培养基中蔗糖的含量改为0-11g，在180 rpm、35℃的条件下恒温震荡培养72h获得含脂肪酶培养液。采用实施例3的方法步骤检测、计算含脂肪酶培养液中脂肪酶的酶活。本实施例中不同蔗糖添加量的条件下，含脂肪酶培养液的脂肪酶活如图5所示。

实施例5 吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶优化2

将实施例2步骤（3）中所用改良基础培养基中的蔗糖含量改为1g/L、大豆蛋白胨改为胰蛋白胨、胰蛋白胨的含量改为5-35g/L，发酵条件为摇床转速180 rpm、35℃的条件下恒温震荡培养72h获得含脂肪酶培养液。采用实施例3的方法步骤检测、计算含脂肪酶培养液中脂肪酶的酶活。本实施例中不同胰蛋白胨添加量的条件下，B1213产脂肪酶活如图6所示。

实施例6吡咯伯克霍尔德氏菌B1213所产脂肪酶的分离、纯化

（1）取实施例2获得的含脂肪酶培养液，经离心机离心（8000r/min），获得上清液；

（2）上清液进行硫酸铵分级沉淀，所得沉淀再经透析袋透析，透析12h，所得产物即为脂肪酶；该脂肪酶呈弱碱性。上清液100mL进行硫酸铵分级沉淀后所得滤液的相对酶活如图7所示。

<110>北京工商大学

<120>吡咯伯克霍尔德氏菌的应用及其产脂肪酶的方法

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ACGGTTACCT TGTTACGACT T 21

<210>3

<211>1411

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

ACATGCAGTC GAACGGCAGC ACGGGTGCTT GCACCTGGTG GCGAGTGGCG AACGGGTGAG 60

TAATACATCG GAACATGTCC TGTAGTGGGG GATAGCCCGG CGAAAGCCGG ATTAATACCG 120

CATACGATCT ACGGATGAAA GCGGGGGACC TTCGGGCCTC GCGCTATAGG GTTGGCCGAT 180

GGCTGATTAG CTAGTTGGTG GGGTAAAGGC CTACCAAGGC GACGATCAGT AGCTGGTCTG 240

AGAGGACGAC CAGCCACACT GGGACTGAGA CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG 300

TGGGGAATTT TGGACAATGG GCGAAAGCCT GATCCAGCAA TGCCGCGTGT GTGAAGAAGG 360

CCTTCGGGTT GTAAAGCACT TTTGTCCGGA AAGAAATCCT TGGCTCTAAT ACAGTCGGGG 420

GATGACGGTA CCGGAAGAAT AAGCACCGGC TAACTACGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACG 480

TAGGGTGCGA GCGTTAATCG GAATTACTGG GCGTAAAGCG TGCGCAGGCG GTTTGCTAAG 540

ACCGATGTGA AATCCCCGGG CTCAACCTGG GAACTGCATT GGTGACTGGC AGGCTAGAGT 600

ATGGCAGAGG GGGGTAGAAT TCCACGTGTA GCAGTGAAAT GCGTAGAGAT GTGGAGGAAT 660

ACCGATGGCG AAGGCAGCCC CCTGGGCCAA TACTGACGCT CATGCACGAA AGCGTGGGGA 720

GCAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCCCTAAAC GATGTCAACT AGTTGTTGGG 780

GATTCATTTC CTTAGTAACG TAGCTAACGC GTGAAGTTGA CCGCCTGGGG AGTACGGTCG 840

CAAGATTAAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG ACCCGCACAA GCGGTGGATG ATGTGGATTA 900

ATTCGATGCA ACGCGAAAAA CCTTACCTAC CCTTGACATG GTCGGAATCC CGCTGAGAGG 960

TGGGAGTGCT CGAAAGAGAA CCGATACACA GGTGCTGCAT GGCTGTCGTC AGCTCGTGTC 1020

GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCTT GTCCTTAGTT GCTACGCAAG 1080

AGCACTCTAA GGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC GTCAAGTCCT 1140

CATGGCCCTT ATGGGTAGGG CTTCACACGT CATACAATGG TCGGAACAGA GGGTTGCCAA 1200

CCCGCGAGGG GGAGCTAATC CCAGAAAACC GATCGTAGTC CGGATTGCAC TCTGCAACTC 1260

GAGTGCATGA AGCTGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC 1320

CCGGGTCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGGGAGTGG GTTTTACCAG AAGTGGCTAG 1380

TCTAACCGCA AGGAGGACGG TCACCACGGT A 1411

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

TgACCgCCgA gAAgAgCAA 19

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CTCTTCTTCg TCCATCgCCT C 21

<210>6

<211>974

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

TCATGCGCAT GGGCGACGGC GAGGCGGCCG AAGACATCCA GGTCGTCTCC ACGGGTTCGC 60

TGGGGCTCGA CATCGCGCTT GGCGTCGGCG GCTGCCGCGC GGCCGGGTGG TCGAGATCTA 120

CGGCCCGGAA TCGTCCGGTA AAACCACGCT CACGCTGCAG GTCATCGCCG AACTGCAGAA 180

GATCGGCGGC ACGGCCGCGT TCATCGACGC CGAACACGCG CTCGACGTTC AATATGCGTC 240

GAAGCTCGGC GTGAACGTGC CGGAACTGCT GATCTCGCAG CCGGACACCG GCGAACAGGC 300

ACTGGAAATC ACCGATGCGC TGGTGCGCTC GGGCTCGGTC GACATGATCG TCATCGACTC 360

GGTCGCGGCG CTCGTGCCGA AGGCCGAAAT CGAAGGCGAG ATGGGCGATT CGCTGCCGGG 420

CCTGCAGGCT CGCCTGATGT CGCAGGCGCT GCGCAAGCTG ACCGGCACGA TCAAGCGCAC 480

GAACTGCCTG GTGATCTTCA TCAACCAGAT TCGCATGAAG ATCGGCGTGA TGTTCGGCAA 540

CCCGGAAACC ACGACGGGCG GCAACGCGCT GAAGTTCTAT GCGTCGGTGC GTCTCGATAT 600

CCGCCGGATC GGCTCGATCA AGAAGAACGA CGAGGTGATC GGCAACGAAA CCCGCGTGAA 660

GGTCGTCAAG AACAAGGTGT CGCCGCCGTT CCGCGAAGCG ATCTTCGACA TCCTGTATGG 720

CGAGGGCATT TCGCGTCAGG GCGAGATCAT CGATCTCGGC GTGCAGGCAA AGATCGTCGA 780

CAAGGCGGGC GCCTGGTACA GCTACAACGG CGAGAAGATC GGCCAGGGCA AGGACAACGC 840

GCGTGAATTC CTGCGCGAGA ATCCGGAAAT CGCACGCGAG ATCGAAAACC GCATCCGCGA 900

ATCGCTCGGC GTCGTCGCCA AGGCGCTGGC GGCCGCACTC GCGCAGATCG AGAAGCAGTT 960

CGGCAAAGGG TCGA 974

Claims

1.吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）B1213的一种用途，用于产脂肪酶；所述吡咯伯克霍尔德氏菌B1213保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号为CGMCCNo.12806；保藏时间为2016年7月21日。

2.根据权利要求1中所述的吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产脂肪酶的方法，其特征在于，在改良基础培养基存在的条件下，对吡咯伯克霍尔德氏菌B1213进行培养；所述改良基础培养基，由基础培养基和橄榄油按照100:1的体积比组成，121℃灭菌15min；所述基础培养基，每1L中含有的成分为：蔗糖0-12g、蛋白胨5-35g、硫酸铵1.0g、三水合磷酸钾1.0g、七水合硫酸镁0.5g、蒸馏水余量，pH7.0。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基础培养基蔗糖含量为1-7g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基础培养基中的蛋白胨为胰蛋白胨，胰蛋白胨含量20-25g/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将吡咯伯克霍尔德氏菌B1213种子液接种于改良基础培养基，在150-200 rpm、30-35℃的条件下恒温震荡培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，培养条件为转速180rpm，温度35℃。