DE4430089A1 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von enantiomerenreinen Chroman-2-carbonsäuren und deren Derivaten - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen Herstellung von enantiomerenreinen Chroman-2-carbonsäuren und deren Derivaten

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DE4430089A1
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von enantiomerenreinen Chroman-2-carbonsäuren und deren Derivaten.
Ein enzymatisches Verfahren zur Racematspaltung von 7-Hydroxy-chroman-2- carbonsäurethylester mit einer speziellen, aus Pseudomonas isolierten S-Ester- spezifischen Lipase ist in der Literatur beschrieben. Mit diesem enzymatischen Verfahren wird R-Chroman-2-carbonsäureethylester mit einer Ausbeute von 86% und einer optischen Reinheit von ca. 97-99,6% e.e. sowie S-Chroman-2- carbonsäure mit einem e.e. von ca. 83% e.e.erzeugt (P.Kalaritis, R.W. Regenye, J.J. Patridge und D. Coffen, J.Org. Chem., 55 (1990) 812-815, s. auch USP 5037747).
Die Europäische Patentanmeldung 448254 offenbart die enantioselektive Racemat­ spaltung von racemischen Chroman-2-carbonsäurestern mit einer aus Pseudomonas fluorescens isolierten für die S-Ester-Spaltung spezifischen Lipase. Die gewünschte R-Säure wird auf chemischen Wege aus dem R-Ester hergestellt.
Ebenfalls in der Literatur beschrieben ist die proteolytische Spaltung von 3,4- Dihydroisocumarin-3-carboxymethylestern mit proteolytischen Enzymen (T.N. Pattabiraman und W.B. Lawson, Biochem. J., 126 (1972) 659-665), die jedoch nur zu einer sehr mäßigen optischen Reinheit des Produktes führt.
Alle in der Literatur bisher beschriebenen Verfahren haben den Nachteil, daß sie meßtechnisch für die Arzneimittel-Synthese nicht einsetzbar sind. Entweder führen die enzymatischen Spaltungen zu Chroman-2-carbonsäure mit zu geringer optischer Reinheit oder es muß ein sehr teures Enzym, wie die von Pseudomonas fluorescens gebildete Lipase, eingesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Chroman-2-carbonsäuren und deren Derivaten der allgemeinen Formel (I)
in welcher
A, D und E gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, Halogen, Cyano, Azido, Nitro, Difluormethyl, Trifluor­ methyl, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, Hydroxy oder Carboxy stehen, oder
für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkenyl, Acyl oder Alkoxy­ caronyl mit jeweils bis zu 8 Kohlenstoffatomen stehen, oder für eine Gruppe der Formel -NR²R³, -NR⁴-L-R⁵ oder -OR⁶ stehen, worin
R², R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl bedeuten,
L die -CO- oder -SO₂-Gruppe bedeutet,
R⁵ geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoff­ atomen oder Benzyl bedeutet, oder Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, das gegebenenfalls durch Halogen, Hydroxy, Nitro, Cyano, Trifluormethyl, Trifluor­ methoxy oder durch geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R⁶ geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkenyl mit jeweils bis zu 8 Kohlenstoffatomen bedeutet, die gegebenenfalls durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Phenyl substituiert sind oder
A eine der oben aufgeführten Bedeutungen hat und
D und E gemeinsam einen 5- bis 7-gliedrigen gesättigten, partiell ungesättigten oder aromatischen Carbocyclus oder Heterocyclus mit bis zu 2 Heteroatomen aus der Reihe S, N oder O ausbilden, wobei diese gegebenenfalls bis zu 2 Carbonylfunktionen im Ring besitzen können und die gegebenenfalls bis zu 2-fach gleich oder verschieden durch geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Halogen, Cyano, Nitro oder spiroartig durch einen Rest der Formel
substituiert sind,
worin
m eine Zahl 1 oder 2 bedeutet,
R¹ für Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen steht, und
* für das chirale Zentrum mit R- oder S-Konfiguration steht,
dadurch gekennzeichnet, daß man die racemischen Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
in welcher
A, D, E und R¹ die oben angegebenen Bedeutungen haben,
durch Einwirkung stereoselektiv spaltender trägergebundener und/oder freier Enzymen mit esterolytischer Aktivität, gegebenenfalls auch unter kombinierter Spaltung mit S- und anschließend R-stereoselektiven Enzymen, in Wasser oder einem zweiphasigen Medium, bestehend aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemittel, spaltet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch folgendes Formelschema beispielhaft erläutert werden:
Überraschenderweise erhält man bei der Durchführung des erfindungs­ gemäßen Verfahrens die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) auf elegante Weise mit optisch hochreiner R- und/oder S-Konfiguration und gleichzeitig mit sehr guten, im industriellen Maßstab nutzbaren, Ausbeuten.
Im Gegensatz zum oben aufgeführten Stand der Technik zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren durch viele Vorteile aus. Es zeigt, daß sehr viele, teilweise auch lange bekannte Enzyme mit esterolytischer Aktivität racemische Chroman-2-carbonsäureester sowohl mit R- als auch mit S- Stereoselektivität spalten können.
Außerdem zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß durch eine kombinierte Spaltung mit S-und anschließend R-stereoselektiven Enzymen die optische Reinheit von Chroman-2-carbonsäuren stark gesteigert werden kann.
Darüberhinaus wurde gefunden, daß 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureester schnell und stereoselektiv spaltbar sind, wobei die Spaltungsgeschwindigkeit von Chroman-2-carbonsäureester im Vergleich zu den 8-Methoxy-chroman-2- carbonsäureestern von Enzym zu Enzym variiert werden kann.
Außerdem wird bei Veränderung der Alkohol-Komponente (Verlängerung der Kohlenstoff-Kette vom Methyl- zum -2-butylester) des racemischen Chroman- 2-carbonsäureesters die optische Reinheit des erhaltenen R-Esters von ca. 82% e.e. auf ca. 97-98% e.e. drastisch verbessert.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt, insbesondere auch im Hinblick auf den Kostenfaktor, darin, daß kein technischer Aufwand notwendig ist und billige Enzyme, ohne Verlust von optischer Reinheit, oder Ausbeute eingesetzt werden können.
Nach einer enzymatischen stereoselektiven Spaltung der racemischen Ester werden Ester und Säure nach üblichen chemischen Methoden z. B. durch durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln getrennt und die nicht gewünschten Komponenten z. B. nach üblicher chemischer Racemisierung (z. B. mit Natriumalkoholat) dem Prozeß wieder zugeführt.
Entsprechend erfolgt die Aufarbeitung in einem zweiphasigem System aus wäßriger und organischer Phase.
Zu der Gruppe von R-stereoselektiv spaltenden Enzymen gehören Proteasen (wie z. B. Chymotrypsin, Trypsin, Subtilisin, Pronase, Proteinase, Proteinase K, Savinase, Esperase und Lipasen). Die Spaltung erfolgt bei diesem Enzymtyp, wenn z. B. R-Chroman-2-carbonsäure gewonnen werden soll, ausgehend von einem entsprechenden Ester z. B. dem Methylester mit einer für die Arzneimittel-Synthese nicht ausreichenden Stereoselektivität (82-92% e.e.), so daß vor dem Ende der enzymatischen Spaltung abgebrochen werden muß und der restliche S-Chroman-2-carbonsäureester mit einem S- stereoselektivem Enzym gespalten werden muß.
Die Stereoselektivität der R-stereoselektiven Enzyme kann allerdings durch den Einsatz bestimmter Estertypen wie z. B. des Chroman-2-carbonsäure- isobutylesters stark verbessert werden (97-98% e.e.).
Zu den R-stereoselektiven Enzymen zählen auch Serin- und Sulfhydryl- Proteasen, wie z. B. das Subtilisin, das aus Bacillus subtilis oder aus Bacillus licheniformis isoliert wird, sowie das aus Rinder- oder Schweinepankreas isolierte Chymotrypsin (EC 3.4.21.1) oder TLCK-Chymotrypsin sowie Trypsin (EC 3.4.21.4).
Die aus Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis isolierten proteolytischen Enzyme sowie Chymotrypsin werden als technische Enzyme unter den Firmennamen Maxatase (Hersteller: Gist-Brocades N.V., Delft/Niederlande), Optimase (Hersteller: Solvay-Enzyme, Hannover) und Alcalase (Hersteller: Novo Industri A/S, Kopenhagen/Dänemark) sowie Chymotrypsin S 800 (Hersteller: Novo Industri A/S, Kopenhagen/ Dänemark).
Chroman-2-carbonsäureester werden auch durch die bakteriellen Enzyme wie z. B. die Pronase, die aus Streptomyces griseus isoliert wird und die Proteinase K aus Tritirachium album limber sowie durch die den biologischen Waschmitteln zugesetzten Proteasen Savinase, Esperase und Durazym der Firma Novo Industri A/S stereoselektiv hydrolysiert.
Die S-stereoselektiven Enzyme, vornehmlich von den Mikroorganismen Candida lipolytica, Aspergillus niger, Geotrichum candidum und Aspergillus oryzae gebildete und nach den bekannten Methoden der Enzymchemie gereinigte Lipasen, erzeugen überwiegend in einem Spaltungsschritt einen optisch sehr reinen R-Chroman-2-carbonsäureester (e.e. < 97%), der entweder in dieser Form für chemische Synthesen eingesetzt wird oder chemisch sowie enzymatisch hydrolysiert werden kann.
Im Falle der nachfolgenden enzymatischen Hydrolyse mit einem R- stereoselektivem Enzym, z. B. mit Chymotrypsin, wird ein optisch sehr reiner R-Chroman-2-carbonsäureester mit einem e.e.-Wert < 99% erhalten.
Für den enzymatischen Spaltungsprozeß sind somit auch aus Mucor javanicus, Penicillium roquefortii oder Rhizopus delemar isolierte Lipasen mit geringerer Stereoselektivität einsetzbar.
Die Spaltungsgeschwindigkeit, nicht jedoch die Stereoselektivität der S- stereoselektiven Lipasen bezüglich Chroman-2-carbonsäureestern ist von Lipase zu Lipase unterschiedlich und muß empirisch ermittelt werden.
Zu den Enzymen mit S-Stereoselektivität gehören die Protease Resinase und die Lipasen (EC 3.1.), die aus Candida lipolytica (Lipase L der Firma Amano, Japan) Aspergillus niger (Lipase A6 der Firma Amano, Japan), Aspergillus oryzae (Lipase 2212 F der Firma Röhm, Darmstadt) oder aus Geotrichum candidum (Lipase GC der Firma Amano, Japan) isoliert werden. Die aus Geotrichum candidum isolierte Lipase (EC 3.1.1.3) wird in Gegenwart von Lipiden fermentiert (M.Iwai, Y.Tsujika, Y.Okamoto und J.Fukumoto, Agr. Biol. Chem., 37 (1973) und als Enzym bis zur Homogentität gereinigt (Y.Tsujika, M.Iwai und Y.Tomonaga, Agr. Biol.chem., 37 (1973)1459-1464).
Die Kristallisation des Enzyms sowie einige Eigenschaften des reinen Enzyms sind ebenfalls beschrieben (Y.Hata, Y.Matsumura, N.Tanaka, M.Kakudo, A.Sugahara, M.Iwai und Y.Tsujisaka, J. Biochem., 86 (1979)1821-1827).
Die aus Geotrichum candidum isolierte Lipase hat ein Molekulargewicht von ca. 55.000 Daltons und unterscheidet sich damit eindeutig von der in der EP- Patentanmeldung 448254 A 2 verwendeten aus Pseudomonas fluorescens isolierten Lipase, die ein Molekulargewicht von ca. 25.000 Daltons hat. (H.C.Hedrich, F.Spener, U.Menge, H.-J.Hecht und R.D.Schmid, Enzyme Microb. Technol., 13 (1991) 840-847).
Die Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Lipase-Isoenzymen aus Aspergillus niger wurde in der Literatur ebenfalls beschrieben (M.Höfelmann, J.Hartmann, A.Zink und P.Schreiber, Journal of Food Science, 50 (1985) 1721-1731).
Die nicht benötigte S- bzw. R-Chroman-2-carbonsäure wird nach Veresterung und Racemisierung dem Spaltungsprozeß wieder zugeführt.
Lipasen und Proteasen werden z. B. zum Einsatz in der Nahrungsmittel­ industrie in großen Mengen preiswert hergestellt.
Die freien Enzyme werden bezogen auf die racemischen Chroman-2- carbonsäurester gewichtsmäßig im Verhältnis von 0,1-20 Gew.% eingesetzt, wobei bei dem geringeren Enzymeinsatz nur die Spaltungsgeschwindigkeit reduziert ist, so daß entsprechende Spaltungsansätze länger dauern. Die Stereoselektivität der Spaltung ist jedoch unabhängig vom Verhältnis Enzym zum racemischen Chroman-2-carbonsäureester.
Die enzymatische Spaltung kann in einem wäßrigen Spaltungssystem durch Einsatz eines Rotor-Stator-Mischers (z. B.Ultraturrax der Firma Jahnke und Kunkel bzw. eines Leitstrahlmischers der Firma Ystral) stark beschleunigt werden, da sich Chroman-2-carbonsäureester in wäßrigen Systemen nur begrenzt lösen und Lipasen an der Grenzschicht Wasser-Chroman-2- carbonsäureester ihre enzymatische Aktivität entfalten (K-E. Jäger und S. Wohlfahrt, BioEngeneering 2/93, 39-45).
Wird die Tröpfchengröße des Chroman-2-carbonsäureesters in Wasser verkleinert, so steigt deren Oberfläche und damit die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion.
Die Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung von Chroman-2- carbonsäureestern in einem zweiphasigen System aus Wasser und organischem Lösungsmittel hängt ebenfalls von dem Stoffaustausch zwischen organischer und wäßriger Phase und damit von der Rührgeschwindigkeit ab. Die vorher beschriebenen Enzyme können in einer Suspension aus Chroman- 2-carbonsäureester und Wasser eingesetzt werden, wobei bestimmte Nachteile zu beobachten sind. Dazu gehören außer einer schwierigen Wiedergewinnung der eingesetzten Enzyme eine mögliche Kontamination des erhaltenen Chroman-2-carbonsäureesters durch die eingesetzten Enzyme bzw. durch Begleitstoffe aus den eingesetzten Enzymen.
Enzyme können durch eine kovalente Bindung über einen zur enzymatischen Katalyse nicht essentiellen Aminosäurerest, z. B. über einen Lysinrest, an einen polymeren Träger gekuppelt werden.
Im Falle einer Kupplung von Lipasen an polymere Träger gibt es aufgrund des hydrophoben Charakters der Lipasen auch die zusätzliche Möglichkeit, Lipasen adsorptiv sehr fest an hydrophobe Trägermaterialien zu binden, ohne daß die Lipasen während der enzymatischen Reaktion von Träger abgelöst werden. Die Fixierung der Lipasen auf dem Träger kann z. B. durch eine Quervernetzung des Lipase-Proteins mit bifunktionellen Reagentien verbessert werden, so daß dadurch die Lebensdauer des Biokatalysators verlängert wird.
In der wissenschaftlichen und Patent-Literatur gibt es zahlreiche Methoden zur Herstellung trägergebundener Biokatalysatoren.
Zur kovalenten Bindung von Enzymen an polymere Träger kann z. B. auf die Patente DE-OS 22 15 539 und 2215687 verwiesen werden.
Gleiches gilt für die Herstellung aktivierter Träger zur Enzymbindung nach z. B. GB-PS 1302706, N.L. Smith und H.M. Lehnhoff, Arch. Biochem., 61 (1974) 392-415, T.h. Finlay et. al., Arch. Biochem., 87 (1978) 77-90, DE-OS 26 19 521 bzw. DE-OS 26 19 451.
Als Enzymträger kommen auch makroporöse, mit Divinylbenzol querver­ netzte Polymere in Kugelform in Frage, die unterschiedlich derivatisiert sind. Das Harz Lewatit R-258-K trägt Benzylamin-Gruppen, die mit Glutardialdehyd aktiviert werden müssen. Die beiden Harztypen Lewatit R 260-K und Lewatit R-259-K haben ein chemisch ähnliches Grundgerüst, sind aber durch Glycidester-Gruppen aktiviert und binden bei einem leicht alkalischen pH-Wert Enzyme kovalent über deren Aminogruppen.
Lipasen können auch adsorptiv an hydrophobe Träger gebunden werden, wobei die Gegenwart von Salzen die Bindung des Enzyms an den polymeren Träger fördert. (W.Warmuth, E.Wenzig und A.Mersmann, Bioforum 9/92, 282-283 sowie A.Mustranta, P.Forsell und K.Poutanen, Enzyme Microb. Technol., 15 (1993)133-139 und UK-Patent 1577933).
Voraussetzung zur Eignung eines Enzymträgers für das erfindungsgemäße Verfahren ist ein vorheriger Test zur eventuellen Adsorption der Ausgangs- und Endprodukte. Geeignete Träger dürfen die Ausgangs- und Endprodukte nur in ganz geringem Umfang adsorbieren.
Der polymere Enzymträger kann bei Einsatz im Batch-Verfahren leicht durch Sedimentation oder Filtration von der Reaktionslösung abgetrennt und mehrfach eingesetzt werden. Der Enzymträger kann ferner in Säulen gefüllt und von einer Pufferlösung durchströmt zur enzymatischen Spaltung eingesetzt werden.
Wird die stereoselektive enzymatische Spaltung in einem rein wäßrigen System durchgeführt, so werden die Chroman-2-carbonsäureester, die in Wasser nur in geringem Umfang löslich sind (Chroman-2-carbonsäuremethyl- bzw.-isobutylester zu ca. 0,05%), als Suspensionen aus Chroman-2- carbonsäureestern und Wasser zur Spaltung eingesetzt. Diese Suspensionen können je nach eingesetztem Estertyp bis zu ca. 50 Vol% an Ester enthalten.
Die enzymatische Umsetzung der Chroman-2-carbonsäureester mit Lipasen erfolgt an der Wasser-Ester-Grenzschicht (Z.S.Derwenda und A.M. Sharp, TIBS, 18 (1993) 20-25).
Chroman-2-carbonsäure ist als Salz bei dem in Frage kommenden pH-Bereich der enzymatischen Spaltung sehr gut in Wasser löslich (<200 g/l).
Werden die Ester in organischen nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln gelöst und in einem zweiphasigen Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel zur Spaltung eingesetzt, so wird als organische Phase Methylenchlorid, Chloroform, Toluol, Benzol, Essigsäureethylester, Petrolether, Hexan, Heptan, Methylisobutylketon oder Isobutanol verwendet.
Der Lösungsmittels-Anteil kann bezogen auf das Gesamtvolumen bis auf maximal 75 bis 80 Vol % steigen, wobei der Wasseranteil für die enzymatische Spaltung als Reaktionspartner und zum Lösen des bei der Spaltung entstehenden Salzes der Chroman-2-carbonsäure benötigt wird.
Zur enzymatischen Spaltung können Chroman-2-carbonsäure- bzw. 8- Methoxy-chroman-2-carbonsäureester mit längerkettigen, verzweigten oder mit Heteroatomen substituierten Alkoholkomponenten eingesetzt werden.
Für die technische Anwendung werden einfache Ester der Chroman-2- carbonsäure wie z. B. der Methylester eingesetzt; jedoch ist der Einsatz z. B. von Isobutylestern dann interessant, wenn höhere optische Reinheiten der Chroman-2-carbonsäure benötigt werden.
Die enzymatische Spaltung erfolgt in einem Temperaturbereich von ca. 20°C bis ca. 70°C je nach der Temperatur-Stabilität des zur Spaltung eingesetzten Enzyms. Bevorzugt ist der Bereich zwischen 20°C und 40°C.
Die stereoselektive enzymatische Reaktion verläuft in einem pH-Bereich zwischen pH 5-10 wobei der pH-Wert durch Zugabe einer starken anorganischen oder organischen Base konstant gehalten wird.
Beispielhaft können als Basen Ammoniak, Natronlauge, Trimethylamin, Ethanolamin, Pyridin, Diisopropylamin oder Dimethylamin in verschiedenen Konzentrationen eingesetzt werden.
Bevorzugt sind Ammoniak und Natronlauge.
Bevorzugt werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren optisch hochreine Verbindungen der allgemeinen Formel (I) hergestellt,
in welcher
A, D und E gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Cyano, Trifluormethyl, Difluormethoxy, Trifluormethoxy oder Hydroxy stehen, oder für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkenyl, Acyl oder Alkoxy­ caronyl mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen stehen, oder für eine Gruppe der Formel -NR²R³, -NR⁴-L-R⁵ oder -OR⁶ stehen, worin
R², R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeuten,
L die -CO- oder -SO₂-Gruppe bedeutet,
R⁵ geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen oder Benzyl bedeutet, oder Phenyl bedeutet, das gegebenenfalls durch Fluor, Chlor, Brom, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, Hydroxy oder durch geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit jeweils bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
R⁶ geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkenyl mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, die gegebenenfalls durch Cyclopropyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Phenyl substituiert sind oder
A eine der oben aufgeführten Bedeutungen hat und
D und E gemeinsam einen Rest der Formel
bilden und
R¹ für Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen steht.
Besonders bevorzugt werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren optisch hochreine Verbindungen der allgemeinen Formel (I) hergestellt, in welcher
A, D und E gleich oder verschieden sind und für Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy oder Hydroxy stehen, oder für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkenyl, Acyl oder Alkoxy­ caronyl mit jeweils bis zu 4 Kohlenstoffatomen stehen, oder für eine Gruppe der Formel -NR²R³ oder -OR⁶ stehen, worin
R² und R³ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen bedeuten,
R⁶ geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkenyl mit jeweils bis zu 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, die gegebenenfalls durch Cyclopropyl oder Phenyl substituiert sind und
R¹ für Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen steht.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) sind an sich bekannt [vgl. EP 0352 613, EP 539 803, EP 540 914, EP 546 388 oder EP 546 389].
Experimenteller Teil Abkürzungen
Chroman-2-carbonsäure = CCS
8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure = 8 MCCS.
HPLC-Systeme
Die Drehwerte von Chroman-2-carbonsäure bzw. die Drehwerte ihrer Ester ergeben sehr kleine Meßwerte und sind daher zur Bestimmung der optischen Reinheit von beiden Verbindungen nur begrenzt brauchbar.
Zuverlässig kann die optische Reinheit der erhaltenen Säuren und Ester durch Chromatographie auf einer chiralen HPLC-Säule bestimmt werden.
Chromatographische Trennung von Chroman-2-carbonsäure und/oder -estern bzw. 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure bzw. -estern und Bestimmung der optischen Reinheit vorstehender Verbindungen
HPLC-Säule: Chiracel OD (Daicel), 250 mm × 4 mm (Fa. Baker) Fluß: 1-2 ml/Min.
Für isokratische Chromatographie Laufmittel 1 : 1 mischen
Temperatur: 25 °C
Detektionswellenlänge: 230 nm
Konzentration: ca. 1 g/Ltr.
Laufmittel:
A: 7 g Natriumperchlorat auf 1 Ltr. Wasser, mit Perchlorsäure auf 2,0 einstellen
B: Acetonitril.
Retentionszeiten
S-(+)-CCS|2,5 Min.
R-(-)-CCS 3,7 Min.
S-(+)-CCS-methylester 4,3 Min.
R-(-)-CCS-methylester 7,4 Min.
S-(+)-CCS-ethylester 5,3 Min.
R-(-)-CCS-ethylester 8,2 Min.
S-(+)-CCS-propylester 7,0 Min.
R-(-)-CCS-propylester 9,9 Min.
S-(+)-CCS-n-butylester 10,0 Min.
R-(-)-CCS-n-butylester 15,3 Min.
S-(+)CCS-isobutylester 9,0 Min.
R-(-)-CCS-isobutylester 11,5 Min.
S-(+)-8-MCCS 2,1 Min.
R-(-)-8-MCCS 2,8 Min.
S-(+)-8-MCCS-n-butylester 8,4 Min.
R-(-)-8-MCCS-n-butylester 11,8 Min.
S-(+)-8-MCCS-isobutylester 7,8 Min.
R-(-)-8-MCCS-isobutylester 9,5 Min.
Der Verlauf der enzymatischen Spaltung bzw. deren Ende kann entweder durch die zur Neutralisation der gebildeten Chroman-2-carbonsäure benötigten Alkali-Menge oder besser durch die vorstehend beschriebene HLPC auf einer chiralen Phase verfolgt und hiermit der Zeitpunkt für die Aufarbeitung der chiralen enzymatischen Spaltungsprodukte festgelegt werden.
Herstellungsbeispiele I. Herstellung der racemischen Chroman-2-carbonsäurester bzw. der 8- Methoxy-chroman-2-carbonsäureester Beispiel 1 Herstellung von racemischem Chroman-2-carbonsäuremethylester
356 g Chroman-2-carbonsäure wurden in 2 Ltr. Methanol unter Zusatz von 10 ml konzentrierter Schwefelsäure 4 Stunden auf Siedetemperatur erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde am Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand mit 200 ml Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde der Rückstand noch dreimal mit je 300 ml halbgesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung extrahiert. Es wurde mit Wasser nachgewaschen und der Rückstand einer fraktionierten Vakuumdestillation unterworfen. Bei 35 mbar destillierte der Hauptlauf bei 165°C.
Ausbeute: 272 g (66%).
Beispiel 2 Herstellung von racemischem Chroman-2-carbonsäure-2-butylester
250 g Chroman-2-carbonsäure wurden in 1 Ltr. 2-Butanol unter Zusatz von 45 ml konzentrierter Schwefelsäure drei Stunden auf Rückfluß erhitzt. Danach wurden 400 ml 2-Butanol abdestilliert. Die verbleibende Lösung wurde noch 1,5 Stunden bei Siedetemperatur gehalten. Nach Abkühlung auf Raumtem­ peratur wurde mit 250 ml Wasser ausgeschüttelt und anschließend 3 × mit je 100 ml halbgesättigter und mit 100 ml gesättigter Natriumhydrogen-carbonat- Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer vom Lösungs­ mittel befreit.
Ausbeute: 251 g (76,4%).
Beispiel 3 Herstellung von racemischem 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureethylester
8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureethylester wurde in Analogie zu M. Shiratsuchi et.al., Chem Pharm.Bull, 35 632 ff (1987) durch Umsetzung von 1-Hydroxy-2-methoxyacetophenon mit Oxalsäurediethylester gefolgt von einer Hydrierung in saurem Milieu mit 10% Palladium-Kohle in Form eines schwach gelben Öls erhalten.
Beispiel 4 Herstellung von 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureisobutylester
15 g (0,072 Mol) 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure (die Herstellung von 8- Methoxy-chroman-2-carbonsäure (CAS Reg. Nr. 144980-41-6) ist in EP 352613, Beispiel 93 A beschrieben) in 75 ml Isobutanol werden mit 3 ml Schwefelsäure versetzt und über Nacht zum Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen auf 0°C wird mit 40 ml Wasser versetzt und mit 13,5 g festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Nach Einengen im Hochvakuum wird mit Toluol aufgenommen und mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach Filtration über Kieselgel K 60 (Elutionsmittel: Toluol/Essigester 100 : 0 bis 10 : 1) erhält man 15,1 g (80%) 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureisobutyl­ ester als Öl.
II. Stereoselektive enzymatische Spaltungen von racemischen Chroman-2- carbonsäurestern bzw. 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureestern Beispiel 5 Spaltung von racemischem Chroman-2-carbonsäuremethylester mit Chymotrypsin
28,03 kg racemischer Chroman-2-carbonsäuremethylester hergestellt nach Beispiel 1 werden in 225 Ltr. Wasser emulgiert und und mit 850 g Chymotrypsin S 800 oral grade (Novo, Dänemark) bei einem pH-Wert von 7,0 und einer Temperatur von 37°C in 19,5 Stunden gespalten.
Nach einem Verbrauch von 70,0 Ltr. 1 N NaOH wird die enzymatische Spaltungslösung durch Zufügen von 3 × 110 kg Methylisobutylketon unter Rühren extrahiert.
Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgezogen und 14 kg S-(+)-Chroman-2- carbonsäuremethylester (49,9% d.Th.) mit einem e.e.-Wert von 65,4% verbleiben als Rückstand.
Nach Einstellen der wäßrigen Phase mit Säuren auf eine pH-Wert von ca. 1 wird die R-(-)-Chroman-2-carbonsäure durch eine gleiche Menge an Lösungsmittel wie vorher extrahiert.
Es werden 11,70 kg (48,7% d.Th.) R-Chroman-2-carbonsäure mit einem e.e.- Wert von 86,4% erhalten.
Beispiel 6 Spaltung von racemischem Chroman-2-carbonsäure-S-(+)-2-butylester mit Chymotrypsin
12 g Ester werden in 100 ml Wasser suspendiert und 1,0 g Chymotrypsin oral grade S 800, Novo, Dänemark) zur Spaltung zugesetzt. Der pH-Wert wurde mit 15,8 ml 1 N NaOH bei 7,0 gehalten.
Die Temperatur betrug 22°C, die Spaltungszeit betrug 141 Stunden.
Bei pH 7 wurde nach Beendigung der Spaltung der S-(-)-Chroman-2- carbonsäure-S-(+)-2-butylester 3 × mal mit je 100 ml Ethylacetat extrahiert und zur Trockene eingedampft.
Ausbeute: 7,64 g (80,6% e.e.).
Zur Gewinnung der R-Chroman-2-carbonsäure wurde die restliche Lösung mit 1 N HCl auf eine pH-Wert von 2 eingestellt und 3 × mal mit je 100 ml Ethylacetat extrahiert und ebenfalls zur Trockene eingedampft.
Ausbeute: 2,99 g (65,4% d.Th.)
e.e.-Wert. 97-98%
Beispiel 7 Spaltung von racemischem Chroman-2-carbonsäure-R-(-)-2-butylester mit Chymotrypsin
12 g Ester werden wie in Beispiel 5 beschrieben mit 1 g Chymotrypsin gespalten.
Die entsprechenden Daten sind:
Temperatur: 22°C
Zeit: 68 Stunden
Verbrauch an 1 N NaOH: 26,4 ml (100% d.Th.)
Ausbeute an S-Chroman-2-carbonsäure-R-(-)-2-butylester: 3,2 g
Ausbeute an R-Chroman-2-carbonsäure: 3,2 g (82,5% d.Th.)
e.e.-Wert: 92%.
Beispiel 8 Spaltung von racemischem Chromancarbonsäuremethylester mit immobilisiertem Chymotrypsin in einem zweiphasigen System aus Wasser und Methylisobutylketon
1 g Chymotrypsin werden in 200 ml Wasser gelöst, 10 g Eupergit C (Oxiran- Acylharz-Perlen, Röhm, Darmstadt, Deutschland) zugefügt und bei Raumtemperatur für ca. 24 Stunden gerührt. Es werden 83880 ATEE- Einheiten an den Träger gebunden.
6 g Chroman-2-carbonsäuremethylester werden in 120 ml Wasser suspendiert, 60 ml Methylisobutylketon und das oben hergestellte Chymotrypsin-Eupergit C-Harz zugesetzt und die Suspension 28 Stunden bei Raumtemperatur und konstantem pH-Wert von 7,0 gespalten.
Die organische und die wäßrige Phase wurden getrennt und die wäßrige Phase mit dreimal je 100 ml Methylisobutylketon extrahiert. Nach Abdampfen des organischen Lösungsmittels werden 2,6 g R-Chroman- 2-carbonsäure (e.e.: 82%) erhalten.
Vergleichbare Ergebnisse werden mit einem an Lewatit R 260 K kovalent gebundenem Chymotrypsin erzielt.
Beispiel 9 Spaltung von Chroman-2-carbonsäuremethylester mit immobilisierter Lipase aus Candida lipolytica
Wie in den vorherigen Beispielen werden 10 g racemischer Chroman-2- carbonsäure-methylester in Wasser emulgiert und mit ca. 10 g an Avicel gebundener Lipase aus Candida lipolytica (EP 22492) gespalten. Es werden nach Lösungsmittel-Extraktion 4,0 g R-Chroman-2- carbonsäuremethylester mit einem e.e.-Wert von 99% erhalten.
Beispiel 10 Spaltung von Chroman-2-carbonsäureisobutylester mit Lipase aus Candida lipolytica
20 g Chroman-2-carbonsäureisobutylester werden in Wasser emulgiert und wie vorher beschrieben mit 2 g Lipase aus Candida lipolytica für 13 Stunden gespalten.
Nach Lösungsmittel-Extraktion und Abdampfen werden 7,0 g R-Chroman-2- carbonsäureisobutylester mit einem e.e.-Wert von 99,4% erhalten.
Beispiel 11 Spaltung von Chroman-2-carbonsäureisobutylester mit Lipase aus Candida lipolytica in technischen Maßstab
51 kg R,S-Chroman-2-carbonsaure-isobutylester wurden in einem 1250 Ltr. Rührwerkskessel in 400 kg Wasser emulgiert. Die Emulsion wurde auf 25°C temperiert. Unter Rühren wurden 5 kg Lipase L (aus Candida lipolytica, Amano Pharmaceuticals, Japan) am Start zugegeben, gefolgt von je 0,5 kg nach 3 und 5 Stunden wobei der pH-Wert der Emulsion mit 5 N NaOH im Bereich 6,0 bis 6,3 gehalten.
Nach einer Spaltungszeit von ca. 13 Stunden waren 22,7 Ltr. 5 N NaOH (113,5 mol = 104,4% der Th.) verbraucht und der S-Chroman-2- carbonsäureisobutylester-Peak war auf ca. < 2% des Ausgangswertes abgesunken, so daß die Spaltung beendet und die Aufarbeitung begonnen wurde.
Zur Extraktion von R-Chroman-2-carbonsäureisobutylester wurden 585 Ltr. Methyliso-butylketon zugegeben und 30 Minuten lang gerührt. Die Emulsion wurde zur Phasentrennung mit ca. 500 Ltr./h (Sihi-Pumpe) in einen Westfalia Extraktor TA 35-01506 gepumpt.
Die organische Phase wird in einem 1000 Ltr. Container aufgefangen. Die wäßrige Phase wird mit frischem Methylisobutylketon über den Mischer ZmA 4006 in einen zweiten Extraktor TA 35-01-506 gefahren und die organischen Phasen anschließend vereinigt. Es wurden insgesamt 1006 Ltr. organische Phase erhalten, die bei 50°C in einer Blasendestillation auf ca. 155 Ltr. vorkonzentriert wurden. Das restliche Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer RTV 50 bei 50°C im Vakuum abgedampft. Es wurden 22,3 kg R-Chroman-2-carbonsäureisobutylester als rötliches Öl erhalten. Die optische Reinheit des Esters wurde durch HPLC-Analyse nach saurer Hydrolyse auf der Stufe der R-Chroman-2-carbonsäure zu 99% e.e. bestimmt.
Zur Aufarbeitung der S-Chroman-2-carbonsäure wurde die wäßrige Phase (150 Ltr.) mit 37 Ltr. 37%iger Salzsäure auf pH 1 eingestellt und mit drei Portionen Methylisobutylketon (1000 Ltr., 550 Ltr. und nocheinmal 150 Ltr.) in 2 Extraktoren TA 35-01-506 und einem Mischer ZmA 4006 extrahiert. Ca. 1850 Ltr. wäßrige Phase wurden verworfen. Ca. 1700 Ltr. der Methylisobutylketon-Phase wurden zweistufig, am Ende bis zur Trockene, destilliert.
Ausbeute an S-Chroman-2-carbonsäure: 21,85 kg (e.e.-Wert 69,3%).
Beispiel 12 Spaltung von racemischem Chroman-2-carbonsäuremethylester mit Lipase aus Aspergillus oryzae mit nachgeschalteter Spaltung mittels Chymotrypsin
5 g racemischer Chroman-2-carbonsäuremethylester werden wie vorher beschrieben mit ca. 1 g Lipase aus Aspergillus oryzae gespalten und der R- Chroman-2-carbonsänremethylester durch Lösungsmittel-Extraktion isoliert. Der R-Chroman-2-carbonsäuremethylester wird in einer zweiten Spaltungsstufe mit ca. 0,7 g des R-stereoselektiv spaltenden Enzyms Chymotrypsin hydrolysiert, so daß nach Lösungsmittel-Extraktion ca. 2,3 g R- Chroman-2-carbonsäure sehr hoher optischer Reinheit erhalten werden (e.e. < 99,5%).
Beispiel 13 Spaltung von Chroman-2-carbonsäuremethylester mit Lipase aus Geotrichum candidum
Wie in Beispiel 10 beschrieben werden 20 g racemischer Chroman-2- carbonsäuremethylester mit 2 g Lipase aus Geotrichum candidum (Lipase GC der Firma Amano, Japan) gespalten.
Nach Ausarbeitung werden 8,4 g R-Chroman-2-carbonsäuremethylester mit einem e.e.-Wert von 93% erhalten.
Beispiel 14 Spaltung von Chroman-2-carbonsäuremethylester mit trägerbundener Lipase aus Candida lipolytica
Wie in Beispiel 10 beschrieben werden 20 g racemischer Chroman-2- carbonsäuremethylester mit 15g trägergebundener Lipase L hergestellt nach der Vorschrift aus dem Patent UK 1577933 gespalten. Nach Aufarbeitung werden 9,4 g R-Chroman-2-carbonsäuremethylester mit einem e.e.-Wert von 99% erhalten.
Beispiel 15 Spaltung von 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureethylester mit Lipase aus Candida lipolytica
10 g 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureethylester werden wie vorher beschrieben mit 2 g Lipase aus Candida lipolytica (Lipase L der Firma Amano, Japan) gespalten und der entsprechende R-8-Methoxy-chroman-2- carbonsäureethylester erhalten.
Es werden 4,1 g R-8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureethylester mit einem e.e.-Wert < 99% erhalten.
Beispiel 16 Spaltung von racemischem 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure-n-butylester mit Lipase aus Candida lipolytica
2,5 g racemischer 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure-n-butylester werden in 50 ml Wasser emulgiert und bei 25°C unter Rühren bei einem konstanten pH- Wert von 6 mit 1 g Lipase aus Candida lipolytica (Lipase L, Amano, Japan) über 8-10 Stunden gespalten. Bei einem Verbrauch von ca. 5 ml 1 NaOH und nach HPLC-Analyse wird die enzymatische Spaltung abgebrochen, das Enzym abzentrifugiert und die Lösung mit je 3 × 100 ml Methylisobutylketon extrahiert, die Phasen in einer Zentrifuge getrennt und der Extrakt zur Trockene eingedampft.
Ausbeute an R-(-)-8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure-n-butylester:
0,66 g (52,8% d.Th.)
e.e.-Wert (nach HPLC): ca. 100%
(apha) 589 nm: 34,30 (c= 1, Methanol).
Die S-(+)-8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure kann bei einem sauren pH-Wert in gleicher Weise wie oben beschrieben isoliert werden.
Beispiel 17 Spaltung von racemischem 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureisobutylester mit Lipase aus Candida lipolytica
Die Spaltung wird wie in Beispiel 16 beschrieben durchgeführt und der R-(-)- 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureisobutylester aufgearbeitet und isoliert. Die nach HPLC bestimmte optische Reinheit des R-Esters beträgt bei einer Ausbeute von ca. 70%, 100% e.e.
Beispiel 18 Spaltung von racemischem 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure-n-butylester mit Lipase aus Aspergillus niger (Lipase A 6 der Firma Amano Japan)
Die Spaltung wird wie in Beispiel 16 beschrieben durchgeführt und der R-(-)- 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäure-n-butylester aufgearbeitet und isoliert. Die nach HPLC bestimmte optische Reinheit beträgt bei einer Ausbeute von ca. 80%, 100% e.e.
Beispiel 19 Spaltung von racemischen 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureisobutylester mit Lipase aus Aspergillus niger (Lipase A 6 der Firma Amano Japans
Die Spaltung wird wie in Beispiel 16 beschrieben durchgeführt und der R-(-)- 8-Methoxy-chroman-2-carbonsäureisobutylester aufgearbeitet und isoliert. Die nach HPLC bestimmte optische Reinheit beträgt bei einer Ausbeute von ca. 60% 100% e.e.
III. Racemisierung: von Chroman-2-carbonsäureestern bzw. Chroman-2- carbonsäure Beispiel 20 Racemisierung von angereichertem S-(+)-Chroman-2-carbonsäuremethylester
192 g (1 Mol) gereinigter Chroman-2-carbonsäuremethylester aus einer enzymatischen Spaltung (78% S-(+)-Ester, 22% R-(-)-Ester) wurden in 500 ml absolutem Methanol gelöst. Um eine Verseifung zu vermeiden, wurde auf Wasserausschluß geachtet. Nach Zugabe von 10,8 g (0,2 Mol) Natriummethylat wurde eine Stunde auf Rückfluß erhitzt. Dann wurde auf 20°C abgekühlt und mit 13,2 g (0,22 Mol) Eisessig versetzt. Am Rotationsverdampfer wurde das Methanol entfernt. Der Rückstand wurde analog der Estersynthese im Vakuum destilliert.
Ausbeute: 165 g (86%, Enantiomerenverhältnis: 1 : 1)
Beispiel 21 Racemisierung von angereicherter S-(+)-Chroman-2-carbonsäure
Wird im Falle einer S-stereoselektiven enzymatischen Spaltung mit einer Lipase zur Extraktion der angereichten S-Chroman-2-carbonsäure Isobutanol eingesetzt, so kann die Racemisierung und Veresterung zum racemischen Chroman-2-carbonsäureisobutylester durch Erhitzen der Isobutanol-Phase erfolgen. Das überschüssige Isobutanol wird abdestilliert.

Claims (1)

  1. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Chroman- 2-carbonsäuren und deren Derivaten der allgemeinen Formel (I) in welcher
    A, D und E gleich oder verschieden sind und
    für Wasserstoff, Halogen, Cyano, Azido, Nitro, Difluormethyl, Trifluormethyl, Difluormethoxy, Trifluormethoxy, Hydroxy oder Carboxy stehen, oder
    für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkenyl, Acyl oder Alkoxy­ caronyl mit jeweils bis zu 8 Kohlenstoffatomen stehen, oder für eine Gruppe der Formel -NR²R³, -NR⁴-L-R⁵ oder -OR⁶ stehen, worin
    R², R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder Benzyl bedeuten,
    L die -CO- oder -SO₂-Gruppe bedeutet,
    R⁵ geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoff­ atomen oder Benzyl bedeutet, oder Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, das gegebenen­ falls durch Halogen, Hydroxy, Nitro, Cyano, Trifluormethyl, Trifluormethoxy oder durch geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist,
    R⁶ geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkenyl mit jeweils bis zu 8 Kohlenstoffatomen bedeutet, die gegebenenfalls durch Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Phenyl substituiert sind oder
    A eine der oben aufgeführten Bedeutungen hat und
    D und E gemeinsam einen 5- bis 7-gliedrigen gesättigten, partiell ungesättigten oder aromatischen Carbocyclus oder Heterocyclus mit bis zu 2 Heteroatomen aus der Reihe S, N oder O ausbilden, wobei diese gegebenenfalls bis zu 2 Carbonylfunktionen im Ring besitzen können und die gegebenenfalls bis zu 2-fach gleich oder verschieden durch geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxy mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Halogen, Cyano, Nitro oder spiroartig durch einen Rest der Formel substituiert sind,
    worin
    m eine Zahl 1 oder 2 bedeutet,
    R¹ für Wasserstoff oder geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen steht, und
    * für das chirale Zentrum mit R- oder S-Konfiguration steht,
    dadurch gekennzeichnet, daß man
    die racemischen Verbindungen der allgemeinen Formel (II) in welcher
    A, D, E und R¹ die oben angegebenen Bedeutungen haben, durch Einwirkung stereoselektiv spaltender trägergebundener und/oder freier Enzymen mit esterolytischer Aktivität, gegebenenfalls auch unter kombinierter Spaltung mit S- und anschließend R-stereoselektiven Enzymen, in Wasser oder einem zweiphasigen Medium, bestehend aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösemittel, spaltet.
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