CN104673817B - 一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法，属于酶工程及分子生物学应用领域；该脂肪酶Tm1350基因来源于极端嗜热菌，本发明将该基因构建到原核表达载体pET‑28a中，获得重组质粒pET‑28a‑Tm1350，转入宿主细胞E.coli BL 21，诱导重组脂肪酶的表达，然后纯化并鉴定其酶学性质；通过构建高拷贝数的穿梭表达载体pHS‑CotB‑Tm1350，转入枯草芽孢杆菌菌株DB403中，诱导重组孢子产生，随衣壳蛋白CotB的组装，该酶共表达在孢子表面。本发明首次通过孢子表面技术对脂肪酶固定化，该脂肪酶具有很好的热稳定性，耐碱性，甲醇激活性及耐甲醇性，具有很大的工业化应用潜能，如生物柴油的制备；该酶展示在孢子表面，不仅稳定性更好，而且通过简单离心或过滤就可回收利用，具有很好的应用前景。

Description

一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法

技术领域

本发明涉及一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法，属于酶工程及分子生物学应用领域。

背景技术

脂肪酶是一类能够催化酯键水解及合成的丝氨酸水解酶类，广泛存在于动物、植物、微生物中。然而微生物脂肪酶具有动、植物不可比拟的特点：具有种类来源丰富，生产成本低，pH和温度稳定性范围广，底物特异性广等，其广泛运用于食品、油、脂肪、手性化合物、皮革、化妆品、生物柴油等工业生产。然而现在绝大部分工业酶是来自于嗜温微生物中，不适合恶劣的工业生产程序，例如在有机试剂，高温等环境中。

酶的生物催化热稳定性允许酶催化反应在高温环境下进行，这高温环境下进行生物催化反应具有明显的优势：1.较高的扩散率；2.增加脂质和其他疏水性底物在水环境中的溶解度；3.减少基质的粘度；4.增加反应物的溶解度；5.高温环境下更高的反应效率；6.降低微生物污染的风险。在有机溶剂中，脂肪酶催化转酯作用是一种新型工业化应用，例如，生产类可可脂，母乳替代品“Betapol”，和生物柴油等等，其中一种非常有效的生物柴油生产方法是在无溶剂系统中利用脂肪酶催化废油脂与甲醇的转酯反应，然而甲醇对酶具有毒害作用，容易使酶失活，为此脂肪酶在有机溶剂中的活性及稳定性是其在工业生物催化领域中重要的性质。

为了考虑生物催化的应用，研究并发现新酶及其生物学性质是非常重要的，而来源极端微生物中的酶具有很高的内在热稳定性和化学稳定性，为此来源极端微生物中的酶的生产及酶学性质的研究引起学者的广泛研究。目前，一些极端嗜热菌的基因组已经被完全测序，如海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8），甲烷嗜热菌（Methanopyruskandleri AV19），敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)等等，其中一些羧酸水解酶已经被分离和定性，显示出高的热稳定性及不同化学稳定性，为工业生物催化提供了重要的酶来源。

虽然热稳定性脂肪酶在工业催化中具有很大的应用前景，由于工业化生产中追求的是低成本，高效益，所以游离的脂肪酶不适合工业化生产要求，为此发明了酶的固定化技术和细胞表面展示技术。酶的固定化技术是将酶吸附或者共价结合在固体材料上面，或者将酶截留在有机或无机聚合物上，其一个非常重要的途径去提高酶的稳定性，循环利用性等等，然而其中带有一些不可忽视的缺点：酶固定化程序中成本高并且耗时长，回收利用时酶活力的丧失等。营养细胞表面展示是通过基因操作技术使外源蛋白与膜或者细胞壁上运载蛋白共表达，从而实现了外源蛋白在细胞表面的定位，此技术使不仅外源蛋白保持相对独立的空间结构和生物活性，同时也利于酶的回收利用。但是外源蛋白展示在细胞表面需要进行跨膜转运，所以多聚体或大分子量蛋白很难展示在细胞表面，同时营养体细胞在恶劣环境下容易破裂，不易回收利用。

枯草芽孢杆菌孢子为内生，在初始孢子化时，前孢子体借助母细胞表达的衣壳蛋白组装成成熟孢子体，然后使母细胞破裂，释放成熟孢子，经过简单的离心就可以获得孢子体。而且孢子具有独特的抗逆性，能很好的抵抗高温、强酸、强碱等不良环境的影响而长期保持孢子状态。根据孢子的特性，近年来，新兴起了一门表面展示技术即枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术，其是基于细胞表面展示技术的原理，外源蛋白随着衣壳蛋白共表，然后组装成孢子最外层的衣壳，从而实现了外源蛋白不需经过跨膜转运就能实现在孢子表面的定位，该技术能很好的解决上述所呈现问题。

起初，枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术是用于口服疫苗及免疫原性的研究，Racele isticato等*(Isticato R, Cangiano G, Tran HT, Ciabattini A, MedagliniD, Oggioni MR, De Felice M, Pozzi G, Ricca E (2001) Surface display ofrecombinant proteins on bacillus subtilis spores. J Bacteriol 183: 6294-6301.)最先以CotB为锚定蛋白将破伤风毒素碳末端（TTFC）的459个氨基酸片段展示在孢子表面，并且将该孢子饲喂小鼠后，在小鼠血清内检测到抗TTFC 的IgG，说明了通过口服孢子表面展示的抗原在生物体能具有很好的免疫效果。为此学者对孢子表面技术深入的研究并发现了其他的一些衣壳运载蛋白，如CotC, CotG, CotX, CotE 和 OxdD，但是主要还是用于免疫原性的研究。

近年来，将酶展示在孢子表面作为酶的固定化是研究的新热点，因为展示在孢子表面的酶具有很好的稳定性及回收利用性。而大部分的表面展示目的蛋白是通过构建一个重组整合质粒将目的基因通过基因重组原理整合到枯草芽孢杆菌染色体DNA上，通过蓝白班相同的原理，挑选产生淀粉酶失活的突变菌株。王楠等构建了一整合质粒，用CotC作为锚定蛋白将家蚕的乙醇脱氢酶展示在孢子表面，且具有很高的活力。但是这中孢子表面展示的方法具有一些缺点：操作复杂，转化成功率低，蛋白表达量低等等，而穿梭表达载体的运用很好的解决这问题，曲媛媛等(Qu YY, Wang JW, Zhang ZJ, Shi SN, Li DX, Shen WL,Shen E, Zhou JT (2014) Catalytic transformation of hodas using an efficientmeta-cleavage product hydrolase-spore surface display system. J Mol Catal B-Enzym 102: 204-210.)通过构建穿梭表达载体，用CotG作为锚定蛋白将一水解酶展示在孢子表面，与纯化的游离酶和固定化在SBA-15介孔材料上的酶相比，其表现出更好的酶活力和回循环利用率。而Hinc, K 等(Hinc K, Isticato R, Dembek M, Karczewska J,Iwanicki A, Peszynska-Sularz G, De Felice M, Obuchowski M, Ricca E (2010)Expression and display of urea of helicobacter acinonychis on the surface ofbacillus subtilis spores. Microb Cell Fact 9.)分别以CotB，CotC，CotG为锚定蛋白将脲酶亚基UreA在孢子表面，发现虽然CotC，CotG展示的UreA的量比CotB的大一些，但是其UreA 不是展示在孢子的最外层，而CotB展示的UreA是暴露在孢子的表面，所以CotB相比较而言是最佳的锚定蛋白去表面展示外源蛋白。

热稳定性脂肪酶展示在耐热的孢子表面既能够共同耐受恶劣环境，拥有更好的稳定性，而且还能通过简单的离心或过滤回收，具有很好的循环利用率。为此该发明具有更广泛的应用前景。

发明内容

为了克服酶在恶劣环境中不稳定甚至失活以及酶催化在工业化生产过程中的成本问题，本发明将一种新的来自于极端嗜热菌（Thermotoga maritima MSB8）的脂肪酶基因构建到原核表达载体中，并转入原核表达宿主细胞，诱导重组脂肪酶的表达，然后纯化并鉴定其酶学性质；利用分子克隆技术构建一高拷贝数的穿梭表达载体，以CotB为锚定蛋白将脂肪酶固定在孢子表面。

实现本发明的技术路线如下：

本发明提供一种新的来源于极端嗜热菌海栖热袍菌（Thermotoga maritimaMSB8）脂肪酶基因（脂肪酶Tm1350基因），具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其基因编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。以海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8）基因组DNA为模板，PCR获得该脂肪酶基因片段。

本发明提供一种脂肪酶Tm1350基因的应用，该基因通过原核表达诱导重组脂肪酶的表达，具体操作包括以下步骤：

1）构建含有脂肪酶核苷酸序列的原核表达载体；

2）获得含有重组原核表达载体的宿主细胞；

3）获得重组脂肪酶。

所述构建的原核表达载体为pET-28a-Tm1350；

所述原核表达的宿主细胞为E.coli BL 21（pET-28a-Tm1350）。

其中获得脂肪酶Tm1350基因制备的重组脂肪酶，具体方法为，将重组宿主细胞E.coli BL 21（pET-28a-Tm1350）用IPTG进行诱导培养，超声破碎诱导表达后的菌体，离心分离上清和沉淀，通过SDS-聚丙烯酰胺胶检测上清和沉淀，发现表达的重组脂肪酶为包涵体蛋白，通过尿素溶解，Ni-NTA纯化及尿素梯度复性，获得纯的高活性脂肪酶。

纯化后的脂肪酶具有底物广泛性，很好的热稳定性，耐碱性，甲醇激活性及耐甲醇性。

本发明还提供一种脂肪酶Tm1350基因的固定化方法，即是将脂肪酶Tm1350基因展示在枯草芽孢杆菌孢子表面从而对其固定化的方法，包括以下步骤：

（1）构建一个以CotB为锚定蛋白的高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pHS-CotB；

（2）将脂肪酶Tm1350基因与步骤（1）中的穿梭表达载体相连，得到重组表达载体pHS-cotB-Tm1350；

（3）将重组载体pHS-cotB-Tm1350转入宿主菌株枯草芽孢杆菌中，得到孢子表面展示脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌。

本发明还提供一种孢子表面展示热稳定性脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌DB403（pHS-cotB-Tm1350）。

所述的穿梭表达载体pHS-CotB，其特征在于：含有大肠杆菌复制起点，氯霉素抗性基因，枯草芽孢杆菌复制、转录起始位点以及CotB基因的调控表达序列和结构蛋白序列。

所述的孢子表面展示热稳定性脂肪酶的枯草芽孢杆菌为DB403菌株。

一种通过把脂肪酶Tm1350展示在枯草芽孢杆菌表面从而对其进行固定化，得到的重组芽孢，具体操作如下：

将培养于LB固体平板上的重组枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中，37℃，220r/min过夜培养，以1%的接种量转接到DSM培养基中，37℃，220 r/min培养36h, 然后在4℃、8000 rpm下离心15min，收集沉淀。沉淀用10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）重新悬浮，向其中加入终浓度为1 mg/mL的溶菌酶，在低功率下超声5-20min后，在37℃水浴作用5-20min低速离心收集孢子，然后用1M NaCl，1M KCl和10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）各洗涤1-2遍，最后重悬浮于10mM Tris-HCl缓冲液。

得到的重组芽孢是枯草芽孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌的芽孢，

芽孢表面展示有脂肪酶Tm1350基因。

通过把脂肪Tm1350基因展示在枯草芽孢杆菌表面从而对其进行固定化，展示在孢子表面的热稳定脂肪酶具有更好的热稳定性，耐强碱性以及具有很好的循环利用率。

本发明的亮点和有益效果：

（1）本发明利用了一个新的来源于极端嗜热菌海栖热袍菌（Thermotoga maritimaMSB8）脂肪酶基因，并能够在原核细胞中应用，其表现出高的稳定性。

（2）本发明提供的重组脂肪酶具有广泛的底物特异性，而且具有甲醇激活性及耐甲醇性，在生物柴油中具有很大的应用前景。

（3）本发明构建一个以CotB为锚定蛋白的高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，并且在CotB与目的蛋白之间加上了六个氨基酸（Gly- Gly- Gly- Gly- Gly-Ser）的柔性linker,其能使目的蛋白固定在孢子表面，并且目的蛋白完全暴露在孢子外面，减少了衣壳蛋白对外源蛋白的空间位阻，有助于目的蛋白的正确折叠。

（4）本发明首次以CotB为锚定蛋白将脂肪酶展示在枯草芽孢杆菌孢子表面，通过该技术对酶的固定化，使脂肪酶的稳定性和耐受性大大提高，并且只需要简单的离心或过滤，就可以循化利用孢子展示的脂肪酶。

附图说明

图1：pET-28a-Tm1350 被双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，pET-28a质粒大小5358bp,Tm1350 基因片段大小780 bp。

图2：SDS-PAGE检测蛋白的表达；泳道1：BL21(pET-28a)全菌蛋白；泳道2：BL21(pET-28a-Tm350)全菌蛋白；泳道3：纯化表达重组蛋白；泳道4：BL21(pET-28a-Tm350)全菌破碎上清；泳道4：BL21(pET-28a-Tm350)全菌破碎包涵体沉淀。

图3：SDS-PAGE检测NI-NAT亲和层析纯化蛋白图；泳道1-9分别为：BL21(pET-28a)全菌蛋白；包涵体蛋白上样液；过柱流出液；LE buffer 洗涤液；10 mM 咪唑洗脱液；20 mM咪唑洗脱液；50 mM 咪唑洗脱液；100 mM 咪唑洗脱液；200 mM 咪唑洗脱液.

图4：重组脂肪酶Tm1350的底物特异性。

图5：纯化重组脂肪酶Tm1350在pH7.5条件下的最适温度（图A）及60℃，70℃，80℃下的耐受性（图B）。

图6：纯化重组脂肪酶Tm1350在70℃条件下的最适pH （图A）及pH 7 ,8 ,9 ,10条件下的耐受性（图B）。

图7：酶在甲醇存在情况下的耐受性。

图8：质粒phs（图A）和重组质粒pHS-CotB-Tm1350（图B）的物理图谱。

图9：重组质粒pHS-CotB （图A）及pHS-CotB-Tm1350 （图B）的双酶切图；A：限制性内切酶Xma I 和 Spe I双酶切pHS-CotB质粒；B: 限制性内切酶Spe I和Xba I双酶切pHS-CotB-Tm1350质粒。

图10:Western blotting检测融合蛋白的表达；A:检测多克隆抗体的存在及特异性，泳道1：BL21(pET-28a)诱导表达全菌蛋白；泳道2：BL21(pET-28a-Tm350)诱导表达全菌蛋白。B：检测CotB-Tm1350融合蛋白的表达，泳道1：DB403孢子；泳道2：DB403（pHS-CotB-Tm1350）孢子。

图11：孢子表面脂肪酶表达的检测。

图12：重组孢子上的脂肪酶Tm1350在pH8条件下的最适温度（图A）及60℃，70℃，80℃下的耐受性（图B）。

图13：重组孢子上的脂肪酶Tm135在70℃条件下的最适pH（图A）及pH 8 ,9 ,10条件下的耐受性（图B）。

图14：重组孢子上的脂肪酶Tm1350在循环利用时的相对酶活力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的内容进一步具体的阐述说明，但以下实施例仅是阐述性的，不用于限制本发明的范围。

实施例1：脂肪酶基因片段的获得

根据NCBI上检索到的Thermotoga maritima MSB8脂肪酶Tm1350基因序列（GenBank accession no. NP_229151.1）及原核表达质粒 pET-28a 上的多克隆位点（MCS）设计 PCR 引物。运用生物学软件 primer 5.0 对扩增脂肪酶基因引物进行分析，设计上游引物 Tm1350-up和下游引物Tm1350-down,

Tm1350-up(BamHI):CGCGGATCCATGAGAATGAACATCCAGAAACACG，

Tm1350-down(XhoI):CCGCTCGAGTTATTTCCCTCCGAGTTTTTCGAGAC，

PCR 反应体系（50 µL）：PrimeSTAR ® HS DNA Polymerase 0.5 µL， 5×PrimeSTAR Buffer 10 µL，dNTP Mixture 4 µL，海栖热袍菌基因组 0.5 µL，Tm350 -up（10µM）1 µL，Tm350-down（10 µM）1 µL，dd H2O33 µL。PCR 程序：1）94 ℃预变性 3 min；2）30个循环：98 ℃ 10 s，58℃ 10 s，72 ℃ 1 min；3）72 ℃ 10 min。

PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶，用凝胶回收试剂盒（omega gel extractionkit）纯化回收，具体操作步骤参照说明书。

实施例2：脂肪酶Tm1350基因的DNA重组，表达及纯化

（1）DNA重组：限制性内切酶Bam HI 和 Xho I 分别对实施例1中的PCR产物和pET-28a(购自novagen)质粒双酶切，然后用T4连接酶连接酶切产物，将过夜连接的酶连产物转化E.coli DH5α(购自GeneCopoeia)感受态细胞，挑选阳性转化子培养，提取质粒，用双酶切和测序方法测定到脂肪酶Tm1350基因正确的构建入表达载体中，测序成功的重组质粒即为pET-28a-Tm1350。

图1为pET-28a-Tm1350 被双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，pET-28a质粒大小5358bp，Tm1350 基因片段大小780 bp。

将测序成功的重组质粒转入E.coli BL21(购自GeneCopoeia)，挑选阳性转化子培养，提取质粒，用双酶切方法检测。将验证的阳性转化子挑入LB 液体培养基中扩大培养后，加入终浓度为15%的甘油，-80℃保存并命名为E.coliBL21（pET-28a-Tm350）。

（2）表达：将过夜培养的BL21（pET-28a-Tm350）菌液按1%的量接入100 mL 含有 50µg/mL Kan+的LB 液体培养基中，37 ℃、220 rpm 培养 2.5 h左右至 OD 600 为 0.6，向培养基中加入终浓度为 0.1 mM的 IPTG，相同条件下诱导培养4h。诱导后的菌液，在 4 ℃、8000 rpm下离心15min，倒弃上清液，用PBS buffer洗涤细胞沉淀，再次离心，向总的细胞沉淀中加入 6 mL预冷的细胞裂解液，充分悬浮菌体。冰浴条件下超声间歇破碎菌体细胞，超声条件为：超声功率 200 W，破碎 10 s，间歇 10 s，总时间 20 min。破碎后的液体 4 ℃、8000 rpm 离心 20 min，收集上清液，沉淀用PBS Buffer洗涤两次，用与之前上清相同体积的PBS buffer悬浮沉淀。分别取 25 µL 的上清和沉淀与2×SDS-PAGE上样缓冲液等体积混合，在沸水浴中处理 10 min。冷却离心后取 10 µL 进行 SDS-PAGE。以相同条件下IPTG诱导的BL21（pET-28a）菌体为对照实验组。

图2为SDS-PAGE检测蛋白的表达结果。其中，泳道1：BL21(pET-28a)全菌蛋白；泳道2：BL21(pET-28a-Tm350)全菌蛋白；泳道3：纯化表达重组蛋白；泳道4：BL21(pET-28a-Tm350)全菌破碎上清；泳道4：BL21(pET-28a-Tm350)全菌破碎包涵体沉淀。说明该融合蛋白为包涵体形式存在。

（3）Ni-NTA 亲和层析纯化重组蛋白

A. 将上述离心的包涵体沉淀蛋白用LE buffer 重新悬浮，在37℃水浴1h以至溶液澄清，溶解后的液体 4 ℃、12000 rpm 离心 20 min，收集上清液。

B. 取5 mL的 Ni²⁺树脂装入柱子中，柱子规格为 1.6×20 cm，柱床体积为5 mL，待自然沉降后，用3倍柱体积的LE buffer 平衡。

C.将收集的上清液加入平衡后的Ni-NTA 柱子中，流速为 0.5 mL/min，收集滤出液。

D. 待柱子中的上样液全部流尽后，向柱子中加入5倍柱体积的LE buffer，流速为2mL/min，收集滤出液。

E. 待柱子中液体流尽后，分别用含 10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500mM咪唑的缓冲液依次加入柱子中，每种缓冲液为2倍柱体积，流速为1 mL/min，分别回收各种缓冲液的滤出液。

F. 用 3倍柱体积的LE buffer 清洗柱子，然后用3倍柱体积双蒸水再次清洗，最后用3倍柱体积的20%乙醇洗柱子，流速均为 2 mL/min，最终使树脂浸没在20%乙醇中，置于4 ℃保存。

G.对以上收集的液体进行 SDS-PAGE 检测。

图3为SDS-PAGE检测NI-NAT亲和层析纯化蛋白图。泳道1-9分别为：BL21(pET-28a)全菌蛋白；包涵体蛋白上样液；过柱流出液；LE buffer 洗涤液；10 mM 咪唑洗脱液；20 mM咪唑洗脱液；50 mM 咪唑洗脱液；100 mM 咪唑洗脱液；200 mM 咪唑洗脱液。结果说明杂蛋白在10 mM咪唑洗脱液中完全洗去，融合蛋白于介质结合能力较强，在100 mM咪唑洗脱液中大量洗出。

实施例3：重组蛋白的复性

将透析膜剪成适当长度（15 cm）的小段，注意戴手套，不能直接碰触透析膜；然后将透析膜放入2% （w/v） NaHCO₃和 1mM EDTA(pH8.0)中沸煮10min，用蒸馏水彻底清洗透析膜，然后放入1mM EDTA(pH8.0)中煮沸10min；用蒸馏水清洗后，将上述纯化回收的重组蛋白液体放入透析膜中，用夹子夹住；再将透析膜依次放入不同的透析缓冲液中，每次在4℃冰箱放置6h，其尿素浓度分别8M，4M，2M，1M，0.5M，0.25M，0M ，最后在生理盐水/蒸馏水中4℃透析6h；将透析好的蛋白分装，-70℃保存。透析膜用蒸馏水清洗干净，浸泡在50%甘油中，4℃冰箱放置保存。

实施例4：脂肪酶活性的检测

脂肪酶酶活力是通过分光光度法去检测以p-nitrophenyl butyrate作为底物在405nm 处的吸光值大小来测定的。以10 mol/L 的PBS缓冲液(pH 7.5)为对照，酶活测定体系包括：在 10 mol/L 的PBS缓冲液(pH 7.5)加入终浓度为7.5µg/mL脂肪酶酶液，70℃水浴锅保温 10 min后，再加入终浓度为2 mmol/L作用底物对硝基苯丁酸酯(p-NPB)，在70℃反应2 min后，迅速在紫外可见分光光度计下检测 405 nm 的吸光值；该数值减去以PBS缓冲液和2 mmol/L p-NPB为对照组的反应值即为脂肪酶酶活的变化。以 1 min 内催化产生 1μmol对硝基酚所需的酶量为 1 个酶活力单位(U)，其中对硝基酚的消光系数 ε =165400L/(mol×cm)。计

算公式如下：

其中，△OD 值表示在 405nm 处的吸光值的变化值，V总：表示反应总体系，n：表示酶液的稀释倍数，△t：表示反应间隔时间，V酶：表示反应体系中酶液的体积； l：表示比色皿的直径。

（1）底物特异性及酶动力学分析

通过分光光度法去检测脂肪酶Tm350的对硝基苯酯底物的偏好。本实验选用三个底物：对硝基苯丁酸酯（p-NPB）、对硝基苯十二烷酸酯（p-NPD）、对硝基苯棕榈酸酯（p-NPP），用上述脂肪酶活性检测方法，其405 nm 的吸收值与酶的活力成正比，通过其在相同反应条件下，比较405 nm 的吸收值来判定Tm1350的底物偏好性。

通过上述检测发现，如图4所述Tm1350脂肪酶的最适底物为对硝基苯丁酸酯（p-NPB）。

（2）脂肪酶的最适温度及温度耐受性

在10mM的Tris 缓冲液中（pH7.5）中，以p-NPB作为底物，在不同的温度（30℃，40℃，50℃, 60℃，70℃，80℃，90℃）下检测脂肪酶的活性，每组3个平行样，以最高的酶活力定义为 100％，分别计算不同温度条件下脂肪酶的相对酶活性。如图5A所示，融合脂肪酶的最适温度为70℃，与热菌海栖热袍菌的生长温度80℃相近。

将酶液分别放置在不同的温度条件下（60℃，70℃，80℃），隔不同时间段（0 h，0.5h，1h，2 h，4 h，6 h，8 h）后取定量的酶液，立即在 0℃冰浴中冷却，然后加入终浓度为2mM 的底物pNPB，在 70℃下测酶活，每组三次平行样，以0h取的酶液所测定的酶活力定义为100％。如图5B所示，融合脂肪酶在60℃，70℃条件下孵育8h后还残留60%以上的酶活力，在80℃条件下孵育1 h后还残留40%以上的酶活力，说明该酶具有很好的温度耐受性。

（3）脂肪酶的最适pH和耐受性

在70℃水浴条件下，以p-NPB作为底物，在不同的10 mM缓冲液（柠檬酸钠缓冲液pH3.0–4.0，醋酸钠缓冲液pH4.0–6.0， Tris–HCl缓冲液pH 7.0–9.0，碳酸钠缓冲液 pH10）中检测脂肪酶活性，每组3个平行样，以最高的酶活力定义为 100％，分别计算不同pH值条件下脂肪酶的相对酶活性。如图6A所示，融合脂肪酶在最适pH值为7.5，但是在pH8 和pH9条件下拥有80%左右的酶活力。

将酶液分别放置在70℃不同的pH条件下（pH 7，8，9，10），隔不同时间段（0 h，0.5h，1h，2 h，4 h，6 h，8 h）后取定量的酶液，立即在 0℃冰浴中冷却，然后加入终浓度为2mM 的底物pNPB，在相对应的pH缓冲液下测酶活，每组三次平行样，分别以不同条件下0h取的酶液所测定的酶活力定义为 100％。如图6B所示，融合脂肪酶在pH 7，pH8.0条件下孵育8h后还残留70%以上的酶活力，在pH9.0条件下孵育8 h后残留60%以上的酶活力，而在pH10条件下孵育1 h后还残留50%左右的酶活力下，说明该酶具有很好的耐碱性。

（4）有机试剂对酶活力的影响

在脂肪酶反应体系中，分别加入终浓度为20%的有机溶剂（DMSO，甲醇，乙醇，异丙醇，丙酮，乙醚，三氯甲烷，正己烷），在室温下， 220 rpm震荡1h后，加入pNPB 底物，检测酶活力。以不加任何有机溶剂的反应体系中的酶活性定义为 100％，以添加相对应的有机溶剂而不加酶液的反应体系为阴性对照，分别测定加入不同有机试剂后各反应体系中脂肪酶的相对酶活性，每组三个平行样。如表1所示，20%的甲醇对酶活性具有激活作用，而在20%的DSMO和乙醇中保留50%左右的活性。

表1. 有机溶剂对酶稳定性的影响

为此检测脂肪酶在不同浓度的甲醇中稳定性，在酶反应体系中加入终浓度将不同的甲醇（0， 20%， 75%），在室温下， 220 rpm震荡，隔不同时间段（0 h，0.5h，1h，2 h，4 h，6h，8 h）后取定量的酶液，加入pNPB 底物反应，检测酶残留的活力。以加入相对应浓度的甲醇而不加酶液的反应体系为阴性对照，分别以不同浓度甲醇0h取的酶液所测定的酶活力定义为 100％，分别测定不同时期的各反应体系中脂肪酶残留的相对酶活，每组三个平行样。如图7所示，酶在甲醇存在的情况下比在无有机溶剂的条件下具有更好的稳定性。

实施例5：多克隆抗体的制备及验证

（1）多克隆血清的制备

选适龄健康公的昆明小白鼠，免疫前，取一只小白鼠的血清作为阴性对照；将上述实施例2中纯化后用生理盐水透析的重组蛋白（300 µg/mL）0.5 mL，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分混合后，多点注射入小鼠腹腔；2 周后，重组蛋白液（200µg/mL）0.5 mL中加入等体积的弗氏不完全佐剂，充分混合均匀后多点注射入免疫小鼠腹腔；1周后，再次腹腔注射用弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白；1周后，再次腹腔注射用弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白，免疫小鼠；1周后，免疫小鼠眼球取血，收集血液，37℃放置1 h，然后再将血液放入 4 ℃冰箱中过夜，最后收集血块上析出的抗血清，-70 ℃保存备用。

（2）western blotting 检测多克隆抗体的特异性

A. 转膜：将垫片和滤纸浸泡在含 SDS 的转膜缓冲液中。把提前剪好的与胶大小一致的 PVDF 膜浸泡在甲醇中 5 min活化，然后将膜和电泳结束后的蛋白配置胶转入无SDS转膜缓冲液中浸泡。按伯乐仪器说明书的要求将滤纸、膜和胶按顺序放好，用玻璃棒赶走膜与胶片之间的气泡，把转膜槽按说明书的要求安装好，转膜槽放入冰盒里，100 V 转膜1 h。

B. 封闭：转膜结束后，将 PVDF 膜与胶接触的那面为正面，正面朝上将PVDF浸没在含 5%脱脂奶粉的 TBST中，4℃封闭过夜或室温封闭 2 h。

C．一抗孵育：封闭结束后，将膜正面朝上在 TBST 中洗三次，每次 3 min，按1：1000的量将上述多克隆血清用TBST稀释，然后将洗好的膜浸没在稀释的血清中。4 ℃双蒸水封闭过夜或室温封闭 4h。

D. 二抗孵育：一抗孵育结束后，在脱色摇床上，将膜正面朝上在TBST 中洗三次，每次 10 min，按商用说明书用TBST将羊抗鼠二抗稀释，然后将洗好的膜正面朝上放置在二抗孵育盒中，二抗浸没PVDF膜。4 ℃封闭过夜或室温封闭2h。

E. 显色：二抗孵育结束后，在脱色摇床上，将膜正面朝上在TBST 中洗三次，每次10 min。将洗好的膜正面朝上，用ECL显色液或者DAB显色液混匀的覆盖到膜上，用仪器或者室温放置以至显色。

如图10A所示，Western blotting检测多克隆抗体的存在及特异性，泳道1：BL21(pET-28a)诱导表达全菌蛋白；泳道2：BL21(pET-28a-Tm350)诱导表达全菌蛋白。结果表明鼠多抗血清对Tm1350脂肪酶具有很高的特异性。

实施例6：枯草芽孢杆菌BS168基因组DNA的提取（根据提取试剂盒说明书）

（1）枯草芽孢杆菌BS168（购于Bacillus Genetic Stock Center ）在LB液体培养基中37℃，培养过夜。收集菌液， 10000 rpm 离心1 min，收集菌体。菌体沉淀中加入 180 µL 20 mg/mL溶菌酶溶液重悬菌液，37℃水浴 45 min。

（2）加入 20 µL proteinase K溶液，颠倒混匀，56 ℃处理 30 min，使细胞完全裂解。

（3）加入 200 µL BD Buffer，反复颠倒，使其充分混匀。若白色沉淀产生，则在70℃水浴 10min 左右使沉淀消失。

（4）向其中再加入 200 µL 无水乙醇，反复颠倒，使其充分混匀。

（5）将上述液体加入已经组装好的吸附柱中，静止2 min， 12000 rpm 离心 5min，去掉收集管中的液体。

（6）向吸附柱中加入已按比例加入异丁醇的PW 溶液500 µL，10000 rpm 离心 1min，去掉收集管中的液体。

（7）加入已按比例加入无水乙醇的500 µLWash 溶液到吸附柱中，10000 rpm 离心1 min，去掉收集管中的液体。

（8）再将吸附柱放置在收集管中，12000 rpm 离心 2 min。

（9）将吸附柱放入灭菌后的 1.5 mL 离心管中，取60 ℃预热的 50 µL洗脱液加入吸附柱中，静止 5 min，12000 rpm 离心 2 min，离心管中的液体就是枯草芽孢杆菌SB168基因组DNA，-20 ℃保存。

实施例7：穿梭表达载体pHS-CotB-Tm1350的构建

（1）pHS-CotB的构建

根据NCBI上检索到的枯草芽孢杆菌CotB基因序列及穿梭表达载体pHS（本实验室构建、保存，图谱如图8左图所示）的多克隆位点（MCS）设计 PCR 引物。运用生物学软件primer 5.0 对扩增CotB基因引物进行分析，设计脂肪酶Tm1350基因上游引物CotB-up和下游引物CotB-down，下游引物横线部分为一段编码接头蛋白的核苷酸碱基序列，该接头蛋白由五个氨基酸残基Gly-Gly-Gly-Gly-Ser 构成，扩增片段大小为1196bp，其包含CotB表达调控序列以及结构蛋白序列。

CotB-up (Xma I): 5’-TAGCCCGGGACGGATTAGGCCGTTTGTCC-3’

CotB-down (SpeI ):5’-CGGACTAGTTGAACCCCCACCTCCGTAGT

GTTTTTTATGCTT-3’

PCR 反应体系（50 µL）：PrimeSTAR ® HS DNA Polymerase 0.5 µL， 5×PrimeSTAR Buffer 10 µL，dNTP Mixture 4 µL，枯草芽孢杆菌基因组 0.5 µL，CotB -up（10 µM）1 µL，CotB-down（10 µM）1 µL，dd H₂O33 µL。

PCR 程序：1）94 ℃预变性 3 min；2）30 个循环: 98 ℃ 10 s，60℃ 10 s，72 ℃1 min 30 s；3）72 ℃ 10 min。

PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶，用凝胶回收试剂盒（omega gel extractionkit）纯化回收；限制性内切酶Xma I 和 Spe I分别对 PCR产物CotB 和pHS质粒双酶切。

pHS质粒酶切反应体系（50µL）：10×NEB Buffer 45 µL，BSA 0.5 µL，Xma I 和Spe I 各2 µL，pHS 20 µL，灭菌双蒸水 20.5 µL；CotB酶切反应体系（50µL）：10×NEB Buffer45 µL，BSA 0.5 µL，Xma I 和Spe I 各2 µL，CotB 25 µL，灭菌双蒸水 15.5 µL。

酶切反应体系在 37 ℃水浴 3 h，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，然后用凝胶回收试剂盒进行回收纯化，用琼脂糖凝胶电泳检测回收的 DNA 片段。T4连接酶连接酶切产物，体系如下（10 µL）：CotB目的片段 6 µL， pHS质粒片段 2.5 µL， 10×T4 DNALigaseBuffer 1 µL，T4 DNALigase 0.5 µL。质粒片段与目的基因片段的浓度比在1：3-10，16℃水浴过夜。

将过夜连接的酶连产物转化E.coli DH5α感受态细胞。用菌落 PCR法和质粒双酶切酶切法验证阳性转化子，并对重组菌扩大培养后提取质粒，命名该质粒为 pHS-cotB，如图9A所示为限制性内切酶Xma I 和 Spe I双酶切pHS-CotB质粒结果图。

（2）pHS-CotB-Tm1350质粒的构建

根据NCBI上检索到的Thermotoga maritima MSB8脂肪酶Tm1350基因序列（GenBank accession no. NP_229151.1）及穿梭表达载体pHSB上的多克隆位点（MCS）设计PCR 引物。运用生物学软件 primer 5.0 对扩增脂肪酶基因引物进行分析，获得脂肪酶上游引物 p-Tm350-up和下游引物p-Tm1350-down，扩增脂肪酶基因片段大小为780 bp。

p-Tm350-up (Spe I): 5’-CGGACTAGTATGAGAATGAACATCCAGAAACACG-3’；

p-Tm1350-down (Xba I): 5’-TGCTCTAGATTATTTCCCTCCAGATTTTTCAGAAC-3’；

PCR扩增脂肪酶酶基因反应体系（50 µL）： PrimeSTAR ® HS DNA Polymerase0.5 µL， 5×PrimeSTAR Buffer 10 µL，dNTP Mixture 4 µL，海栖热袍菌基因组 0.5 µL，p-Tm350 -up（10 µM）1 µL，p-Tm350-down（10 µM）1 µL，dd H₂O33 µL。

PCR 程序：1）94 ℃预变性 3 min；2）30 个循环: 98 ℃ 10 s，58℃ 10 s，72 ℃1 min；3）72 ℃ 10 min。PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，割胶，用凝胶回收试剂盒（omegagel extraction kit）纯化回收。限制性内切酶Spe I和Xba I分别对 PCR产物Tm350和pHS-CotB质粒双酶切，pHS-CotB质粒酶切反应体系（50µL）：: 10×NEB Buffer 45 µL，BSA 0.5µL， Spe I和Xba I各2 µL，pHS 20 µL，灭菌双蒸水 20.5 µL；Tm1350酶切反应体系（50µL）：: 10×NEB Buffer 45 µL，BSA 0.5 µL，Spe I和Xba I各2 µL，Tm1350 25 µL，灭菌双蒸水 15.5 µL。酶切反应体系在 37 ℃水浴 3 h，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，然后用凝胶回收试剂盒进行回收纯化。

T4连接酶连接酶切产物，酶连体系如下（10 µL）：Tm1350目的片段 6 µL， pHS-CotB质粒片段 2.5 µL， 10×T4 DNALigase Buffer 1 µL，T4 DNALigase 0.5 µL。质粒片段与目的基因片段的浓度比在1：3-10，16℃水浴过夜。将过夜连接的酶连产物转化E.coliDH5α感受态细胞，用菌落 PCR 法和质粒双酶切酶切法验证阳性转化子，并对重组菌扩大培养后提取质粒，命名该质粒为 pHS-cotB-Tm1350，图谱如图8右图所示，如图9B所示为限制性内切酶Spe I和Xba I双酶切pHS-CotB-Tm1350质粒结果。

实施例8：枯草芽孢杆菌DB403（pHS-cotB-Tm1350）获得

（1）枯草芽孢杆菌感受态的制备

在 LB 平板上划线活化枯草芽孢杆菌 DB403（Bacillus Genetic Stock Center）， 37 ℃恒温培养过夜；在平板上挑取一单菌落加入 2.5 mL GM I 中，在 30 ℃、130rpm/min 过夜培养；次日按10%的量复接于10 mL GM I 中，在 37 ℃、200 -230rpm/min 培养 3.5 h；按5%的接种量将上述培养液转接到 20 mL GMII 中， 37 ℃、 200 rpm/min 培养 90 min；5000 rpm 室温离心 5 min，收集菌体，取1/10体积的离心上清液悬浮沉淀，加入终浓度为10%的甘油，轻轻吹打均匀，小量分装到离心管中， -80 ℃保存。

（2）质粒转化

取冻存的感受态在45℃水浴解冻，加入终浓度为1µg/mL的实施例7中所得的重组质粒pHS-cotB-Tm1350，质粒体积不超过感受态悬浮液体积的1/20， 37℃放置30-60 min后， 37℃ 200 r/min 振荡培养2-4h，然后每100µL转化液涂一个含有氯霉素抗性平板，37℃过夜培养。为脂肪酶上游引物 p-Tm350-up和下游引物p-Tm1350-down为PCR引物进行菌落 PCR 法检测阳性转化子，然后挑选阳性转化子进行培养，将培养的菌液分装，标记为DB403（pHS-CotB-Tm1350），加入终浓度为10%的甘油，-80 ℃保存。

实施例9.融合脂肪酶表达的检测

（1）孢子化诱导

将保存的重组枯草芽孢杆菌划线于LB固体平板上，37 ℃培养过夜，然后挑单菌落接种于含有 7.5 µg/mL 氯霉素抗生素（Cm⁺）LB液体培养基中，37℃，220 r/min过夜培养，以1%的接种量转接到DSM培养基中，37℃，220 r/min培养36h，然后在4 ℃、8000 rpm下离心15min，收集沉淀。沉淀用10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）重新悬浮，向其中加入终浓度为1mg/mL的溶菌酶，在低功率下超声5-20min后，在37℃水浴作用5-20 min低速离心收集孢子，然后用1M NaCl，1M KCl和10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）各洗涤1-2遍，最后重悬浮于10mMTris-HCl缓冲液。

（2）融合脂肪酶表达的检测

取DB403 孢子和上述实施例8所得重组菌 DB403（pHS-CotB-Tm1350 ）孢子悬液，离心后用等体积的 SDS-DTT 缓冲液重悬浮，65 ℃水浴处理 10 min ，然后以此为样品跑SDS-聚丙烯酰胺凝胶，然后100 V 恒压转膜1h，一抗为实施例5所得的鼠抗脂肪酶T350多克隆抗体，浓度为1:1000，二抗为 HRP-conjugated affinipure Goat Anti-Mouse lgG（上海生工），浓度为1:5000，最后ECL显色液显色。如图10B所示，western blotting检测CotB-Tm1350融合蛋白的表达，泳道1：DB403孢子；泳道2：DB403（pHS-CotB-Tm1350）孢子。结果泳道2在65 kD左右有一特异性条带，与预测融合蛋白的大小相一致，说明融合蛋白表答了。

实验例10. 酶活性分析

脂肪酶酶活力是通过分光光度法去检测以p-nitrophenyl butyrate作为底物在405nm 处的吸光值大小来测定的。酶活测定体系包括：在 10 mol/L 的Tris缓冲液(pH8.0)加入纯化的孢子悬浮液，70℃水浴锅温育 10 min后，再加入终浓度为2 mmol/L作用底物对硝基苯丁酸酯(p-NPB)，在70℃反应2 min后，10000 r/min离心30s，取上清迅速在紫外可见分光光度计下检测 405 nm 的吸光值；该数值减去在Tris缓冲液中加入等量的DB403孢子和2 mmol/L p-NPB为对照组的反应值即为脂肪酶酶活的变化。浓度梯度稀释法用平板计数来计算孢子的数量。是以 1 min 内催化产生 1 μmol对硝基酚所需的酶量为 1 个酶活力单位(U)，其中对硝基酚的消光系数 ε =165400 L/(mol×cm)。计算公式如下：

孢子的相对酶活力（U/spore）=酶活力（U/mL）/C(spore/mL)

其中，△OD 值表示在 405nm 处的吸光值的变化值；V总：表示反应总体系；n：表示酶液的稀释倍数；△t：表示反应间隔时间；V酶：表示反应体系中酶液的体积；l ：表示比色皿的直径； C：孢子悬浮液的孢子浓度。

（1）脂肪酶展示在孢子表面的检测

为了进一步确定脂肪酶是固定在孢子表面，用不同的方法处理纯化的孢子悬浮液，看酶活性的变化。将纯化的DB403（pHS-CotB-Tm1350）孢子悬浮液加入到分别含有0.1%的胰蛋白酶，蛋白酶K，菠萝蛋白酶以及1M PMSF的Tris缓冲液中（pH 8.0），以纯化的DB403孢子为阴性对照，以不经处理的过DB403（pHS-CotB-Tm1350）孢子为阳性对照，37℃温育1 h后，离心，以Tris缓冲液（pH 8.0）清洗两遍后，加入终浓度为2mM的pNPB，检测残留的酶活力。以阳性对照的酶活力定义为100%。如图11所示，重组孢子在蛋白的处理后，酶活力大量下降，而DB403孢子基本酶有活力，从侧面说明了脂肪酶展示在孢子表面而被蛋白酶降解了。

（2）孢子展示脂肪酶的最适温度及耐受性

在10 mM的Tris 缓冲液中（pH8.0）中，以p-NPB作为底物，在不同的温度（30℃，40℃，50℃, 60℃，70℃，80℃，90℃）下检测孢子展示脂肪酶的活性，每组3个平行样，以最高的酶活力定义为 100％，分别计算不同温度条件下孢子悬浮液的相对酶活性。如图12A所示，孢子展示的脂肪酶的最适温度在80℃。

将孢子悬浮液分别放置在不同的温度条件下（60℃，70℃，80℃），隔不同时间段（0h,0.5h，1h，2 h,4 h,6 h,8 h）后取定量的孢子悬浮液，立即在 0℃冰浴中冷却，然后加入终浓度为2 mM 的底物pNPB,在 70℃下测酶活，每组三次平行样，以0h取的孢子悬浮液所测定的酶活力定义为 100％。如图12B所示，孢子展示的脂肪酶在60℃，70℃条件下孵育8h后还残留80%以上的酶活力，在80℃条件下孵育2 h后还残留50%的酶活力，说明孢子表面展示的脂肪酶具有更好的温度耐受性。

（3）孢子展示脂肪酶的最适pH和耐受性

在70℃水浴条件下，以p-NPB作为底物，在不同的10 mM缓冲液（柠檬酸钠缓冲液pH3.0–4.0, 醋酸钠缓冲液pH4.0–6.0, Tris–HCl缓冲液pH 7.0–9.0，碳酸钠缓冲液 pH10)中检测脂肪酶活性，每组3个平行样，以最高的酶活力定义为 100％，分别计算不同pH值条件下脂肪酶的相对酶活力。如图13A所示，孢子展示的脂肪酶的最适pH值为9。

将孢子悬浮液分别放置在70℃不同的pH条件下（pH 7, 8, 9，10），隔不同时间段（0 h,0.5h，1h，2 h,4 h,6 h,8 h）后取定量的孢子悬浮液，立即在 0℃冰浴中冷却，然后加入终浓度为2 mM 的底物pNPB,在相对应的pH缓冲液下测酶活，每组三次平行样，分别以不同pH条件下0h取的孢子悬浮液所测定的酶活力定义为 100％。如图13B所示，孢子展示的脂肪酶在pH8.0条件下孵育8h后还残留85%左右的酶活力，在pH9.0条件下孵育8h后残留75%的酶活力，而在pH10条件下孵育2h后还残留45%左右的酶活力，说明孢子表面展示的脂肪酶具有更好的耐碱性。

（4）孢子的循环利用率

取一定量的孢子化脂肪酶，按着上述酶活性分析方法检测其酶活力后，4000r/min离心1 min回收孢子化酶，用Tris缓冲液清洗数次，除去残余的杂质。加入终浓度为2 mM的pNPB进行下一次反应，以第一次反应时测定的酶活力定义为 100％。如图14所示，在重复使用5次以后，孢子展示的脂肪酶还残留60%的酶活力，说明表面展示的脂肪酶具有很好的循环利用率。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

<120> 一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法

<130> 一种脂肪酶的原核表达及应用和固定化方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> 海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8）

<400> 1

atgagaatga acatccagaa acacggagaa gactggaaag gtacagttgt gatcgtacac 60

ggtctcggtg aacactccgg gaggtacaga agacttgtga gagaattcgt ttcagagggt 120

gttcaggtgg tcacattcga tctaccaggt cacggcaaat ctcccggaag aagagggcac 180

cttcgttttg atgacgtttt taaaatattg aacgagatca cgaaagatct ggaaaggttc 240

gtgctctttg gtcacagtct cggtggattg atagctatca gattcactca gatttttcag 300

ccagagaacc agaaagggtt ggtggtgtcg gcccccgcta tcctgcttcc agatacccat 360

tctccggtcc ttgaattcat ggtgaggttt ctgtcctttt ttgttccatt cctcacgatg 420

agcaacggga taaacccgag cgatctttcc aggaacagag aagcggtgga agcgtacata 480

agagatcccc tcgttcacga caggatctct ttcaagctcg cttcagatat gctctcccat 540

atgaaaaagg ttctcaaaga cgctgaaagg ataaaggttc ctgttctcat ttttcacgga 600

actgatgaca gggtggtgtc ttttgaggga agcaagaagt ttttcgaagc actgagcaca 660

gagaaaaaac tggtgagctt tcctggagga taccatgaac tttttgaaga tccagagcac 720

cagaaagagt ttttcaaaac gatagtcgag tggagtctcg aaaaactcgg agggaaataa 780

<210> 2

<211> 259

<212> PRT

<213> 海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8）

<400> 2

Met Arg Met Asn Ile Gln Lys His Gly Glu Asp Trp Lys Gly Thr Val

1 5 10 15

Val Ile Val His Gly Leu Gly Glu His Ser Gly Arg Tyr Arg Arg Leu

20 25 30

Val Arg Glu Phe Val Ser Glu Gly Val Gln Val Val Thr Phe Asp Leu

35 40 45

Pro Gly His Gly Lys Ser Pro Gly Arg Arg Gly His Leu Arg Phe Asp

50 55 60

Asp Val Phe Lys Ile Leu Asn Glu Ile Thr Lys Asp Leu Glu Arg Phe

65 70 75 80

Val Leu Phe Gly His Ser Leu Gly Gly Leu Ile Ala Ile Arg Phe Thr

85 90 95

Gln Ile Phe Gln Pro Glu Asn Gln Lys Gly Leu Val Val Ser Ala Pro

100 105 110

Ala Ile Leu Leu Pro Asp Thr His Ser Pro Val Leu Glu Phe Met Val

115 120 125

Arg Phe Leu Ser Phe Phe Val Pro Phe Leu Thr Met Ser Asn Gly Ile

130 135 140

Asn Pro Ser Asp Leu Ser Arg Asn Arg Glu Ala Val Glu Ala Tyr Ile

145 150 155 160

Arg Asp Pro Leu Val His Asp Arg Ile Ser Phe Lys Leu Ala Ser Asp

165 170 175

Met Leu Ser His Met Lys Lys Val Leu Lys Asp Ala Glu Arg Ile Lys

180 185 190

Val Pro Val Leu Ile Phe His Gly Thr Asp Asp Arg Val Val Ser Phe

195 200 205

Glu Gly Ser Lys Lys Phe Phe Glu Ala Leu Ser Thr Glu Lys Lys Leu

210 215 220

Val Ser Phe Pro Gly Gly Tyr His Glu Leu Phe Glu Asp Pro Glu His

225 230 235 240

Gln Lys Glu Phe Phe Lys Thr Ile Val Glu Trp Ser Leu Glu Lys Leu

245 250 255

Gly Gly Lys

Claims (5)

1.一种脂肪酶Tm1350的固定化方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

（1）构建一个以CotB为锚定蛋白的高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体pHS-CotB；

（2）将脂肪酶Tm1350基因与步骤（1）中的穿梭表达载体相连，得到重组表达载体pHS-cotB-Tm1350；

（3）将重组表达载体pHS-cotB-Tm1350转入宿主菌株枯草芽孢杆菌DB403中，得到孢子表面展示脂肪酶的重组枯草芽孢杆菌；

所述脂肪酶Tm1350基因来源于极端嗜热菌海栖热袍菌脂肪酶Tm1350基因，其中脂肪酶Tm1350基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1获得的穿梭表达载体pHS-CotB。

3.根据权利要求1所述的一种脂肪酶Tm1350的固定化方法，其特征在于，所述穿梭表达载体pHS-CotB含有大肠杆菌复制起点，氯霉素抗性基因，枯草芽孢杆菌复制、转录起始位点以及CotB基因的调控表达序列和结构蛋白序列；

所述穿梭表达载体pHS-CotB是以诱导型表达载体pLJ为模板，进行PCR扩增获得一条不含有乳糖诱导调控序列Pglv-inframe的质粒骨架片段，且在扩增时在片段的两端同时引入Eco RI酶切位点，并酶切、纯化，经T4DNA连接酶自环化成质粒pHS；再以CotB-up (Xma I):5’-TAGCCCGGGACGGATTAGGCCGTTTGTCC-3’，

CotB-down (SpeI ):5’-CGGACTAGTTGAACCCCCACCTCCGTAGTGTTTTTTATGCTT-3’为引物，在质粒pHS的多克隆位点Xma I和Spe I之间插入枯草芽孢杆菌的自带有完整的诱导调控序列的衣壳蛋白cot B基因，形成一种高效的芽孢展示载体平台pHS-cotB。

4.一种权利要求1获得的重组表达载体pHS-cotB-Tm1350，其特征在于，所述重组表达载体包含脂肪酶Tm1350基因序列和权利要求2所述的穿梭表达载体pHS-CotB。

5.一种孢子表面展示脂肪酶Tm1350基因的重组枯草芽孢杆菌DB403（pHS-cotB-Tm1350），其中在于，所述重组枯草芽孢杆菌包含权利要求4所述的重组表达载体pHS-cotB-Tm1350。