CN104293748A - 一种高热稳定性的内切木聚糖酶及其应用 - Google Patents
一种高热稳定性的内切木聚糖酶及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高热稳定性的内切木聚糖酶。本发明通过对来源于嗜热微生物的木聚糖酶DtX进行改造，去除了信号肽，实现了木聚糖酶基因在异源宿主细胞如大肠杆菌内的高效表达。本发明进一步对该木聚糖酶进行改造，截去了C端的碳水化合物结合结构域，并在C末端引入二硫键，构建的木聚糖酶蛋白突变体的分子量更小，热稳定性提高，比活力也大大提高。通过以上方式，使该木聚糖酶及其突变体更有潜力应用于工业生产。
Description
技术领域
本发明属于酶的基因工程领域，涉及一种木聚糖酶，尤其涉及一种高热稳定性的内切木聚糖酶以及生产该高热稳定性内切木聚糖酶的基因工程菌。
背景技术
木聚糖酶(Xylanase,EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶系中最关键的酶，常被用于饲料、食品、饮料、制药、造纸工业和生物能源等方面(Beg,Q.K.Kapoor,M.Mahajan,L.Hoondal,G.S(2001)Microbial xylanases and their industrial applications:a review.ApplMicrobiol Biotechnol.56(3-4):326-338)。尤其在造纸工业，木聚糖酶在纸浆的预漂白、二次纤维的脱墨等过程中，水解凝结于纤维表面的半纤维素，提高漂白剂在纸浆中的扩散速度，提高漂白效率，减少氯的使用量，从而减少漂白过程对环境的污染(LiisaViikari,Anne Kantelinen,Jorma Sundquist,Matti Linko(1994)Xylanases in bleaching:From an idea to the industry.FEMS Microbiology Reviews.13(2-3):335–350)。
目前，研究报道的大多数木聚糖酶的最适温度都在45-55℃，其稳定性都比较差(Haki,G.(2003)Developments in industrially important thermostable enzymes:a review.Bioresour Technol.89(1):17-34)。随着木聚糖酶的不断开发和利用，对酶的稳定性要求越来越高，而现有的商品化木聚糖酶大多数是从中温微生物中获得的，热稳定性差，在60℃以上很容易丧失催化活性，不能满足工业应用的需要。
Dictyoglomus turgidum DSM6724(以下简称D.turgidum DSM 6724)是一株于1990年在俄国堪察加半岛的乌宗火山分离的菌株，是一种嗜高温、厌氧的新型化能自养型微生物，最适生长温度高达80℃(Svetlichnii,V.A.,Svetlichnii,T.P.(1988)Dictyoglomus turgidus sp.nov.,a new extremely thermophilic eubacteriumisolated from hot springs of the Uzon volcano caldera.Mikrobiologiya,57:435-441)。其基因组测序已在2008年完成(GenBank accession no.NC_011661).D.turgidum DSM6724能够高效利用多种糖类作为碳源，利用糖基水解酶基因搜索，其基因组中包含54个糖类水解基因(Brumm,P.Hermanson,S.Hochstein,B.Boyum,J.Hermersmann,N.Gowda,K.Mead,D.(2011)Mining Dictyoglomus turgidum forenzymatically active carbohydrases.163(2):205-14)。其中，包含三个木聚糖基因。目前，这些木聚糖酶还没有被研究和利用。本发明涉及其中一个木聚糖酶(GeneID:217966449)基因，即DtXyn11A(以下简称DtX)。由于原始菌株的最适生长温度高达80℃，预测该基因编码的木聚糖酶可能具有良好的热稳定性。
但是利用野生型菌产酶所要求的培养条件苛刻。另外，野生型菌株产酶水平非常低，是细菌的千分之一以下。此外，野生型菌株所产的酶系复杂，无法直接应用，而且目的酶的纯化困难。应用蛋白质工程技术对天然基因进行改造，可以突破自然进化的限制，获得针对工业用途特定设计的、具有优良性质的人工酶基因。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，且又由于在实验中发现重组菌中天然的木聚糖酶DtX表达量很低，而且很难纯化，本发明所要解决的技术问题是改造高热稳定性的木聚糖酶基因，使其在表达系统内高效表达，同时简化目的酶的纯化步骤，并对目的酶进行改造，进一步提高其催化效率与热稳定性，以满足工业应用的需求。
为实现上述目的，本发明提供了一种基因工程木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：
1)构建目的蛋白基因；
2)构建基因工程菌并表达目的蛋白；
3)纯化目的蛋白。
对于步骤1)，所述目的蛋白基因可以为木聚糖酶DtX的全基因，其序列见序列表SEQ ID NO:1，其蛋白序列见序列表SEQ ID NO:2。本发明利用SignalP3.0软件对目的蛋白的氨基酸序列进行分析，木聚糖酶DtX的N末端存在一段含28个氨基酸的信号肽。信号肽的存在可能影响目的蛋白的表达。为此，应用分子生物学工具在DtX上去除了信号肽基因，重新构建了不含信号肽的目的蛋白基因，其基因序列为SEQ IDNO:3，蛋白序列为SEQ ID NO:4。
进一步地，通过NCBI Blastp对DtX基因全长序列进行分析，得出该蛋白由两个结构域构成，包括N端的催化结构域(Catalyze Domain,CD)和C端的碳水化合物结合结构域(Carbohydrate Binding Module，CBM)，两个结构域由一段柔性的连接肽(Linker)相连。其中，其催化结构域属于糖苷水解酶11家族(GH11)，碳水化合物结合结构域属于CBM第36家族(CBM36)。但是，仅仅根据NCBI Blastp的结果，很难界定CD的C-末端和CBM的N-末端，即Linker区域的起始和终止。为此，我们分别搜集收集了大量关于GH11和CBM36家族的蛋白质序列和结构。通过MEGA软件进行序列比对，利用Pymol软件进行结构比对分析，最终确定1-201位的区域为催化结构域CD(编号是从去除信号肽的蛋白的第一个氨基酸开始)，202-211的区域为Linker，212-328的区域为CBM。通过Discovery Studio 3.0软件进行同源建模，得到DtX的结构模型(如图1所示)。
我们预测CBM仅影响木聚糖酶与纤维素的结合能力，对底物特异性、酶活性中心、米氏常数和可溶性木聚糖的水解能力无明显影响。而linker的功能还不清楚，但小分子量的酶蛋白分子在反应体系中更易于扩散，应该具有更强的应用优势。为此，根据对DtX的基因序列分析结果构建了截去CBM结构域的突变体基因，我们设计了的两个截短突变体，分别是DtX-CDL(基因序列为SEQ ID NO:5，蛋白序列为SEQ ID NO:6)和DtX-CD(基因序列为SEQ ID NO:7，蛋白序列为SEQ ID NO:8)。
为了进一步提高木聚糖酶的热稳定性，可以在木聚糖酶C末端引入相互作用，如氢键、离子键、二硫键等。本发明在DtX-CD的基础上，利用Disulfide by design软件，对DtX-CD的结构模型进行计算分析，筛选出两处可以引入二硫键的合理位置分别在DtX-CD中引入二硫键，构建了突变体DtX-CDS1(基因序列为SEQ ID NO:9，蛋白序列为SEQ ID NO:10)和DtX-CDS2(基因序列为SEQ ID NO:11，蛋白序列为SEQ IDNO:12)。
对于步骤2)，重组基因的载体优选为质粒pET28a，构建的重组质粒pET28a-DtXyn11A的结构如图2所示，除此以外也可以将木聚糖酶基因整合在宿主细胞基因组上进行表达。
以上述各天然或重组基因构建基因工程菌，使各基因可以在宿主菌中高效表达，所述宿主菌可以为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、丝状真菌等，优选为大肠杆菌。在此基础上，通过在重组目的蛋白(包括去除信号肽的DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体)的N端引入His-tag，不仅可以保护目的蛋白的N-末端，使得目的蛋白的表达量提高2倍，而且还有利于后续纯化。
对于步骤3)，具体方法为将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎后，放置于55-65℃热处理20-30分钟，沉淀大量杂蛋白，此时DtX的纯度已达到80％以上，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后就能得到95％以上纯度的目的蛋白。
在本发明的实施例中，将DtX及其两个截短突变体DtX-CDL和DtX-CD以及含二硫键的截短突变体DtX-CDS1和DtX-CDS2的热稳定性进行比较(结果如表1所示)。包括Topt(最适反应温度)、t1/2(一定温度下，蛋白质活性损失一半时所需要的时间)、T50(一定时间内，蛋白质活性损失一半时所需要的温度)等动力学稳定性参数以及通过差示热量扫描仪(differential scanning calorimetry，DSC)测定的蛋白质解折叠50％时的温度(Tm)这一热动力学稳定性参数。
最适温度比较：DtX为78～82℃；DtX-CDL为85～87℃；DtX-CDS1和DtX-CDS2为83～85℃；DtX-CD为80～82℃。与DtX比较，DtX-CD的最适温度有一定的提高，DtX-CDL，DtX-CDS1和DtX-CDS2的最适温度明显提高。
从图7的85℃时的热稳定性可以看出，DtX-CDL和DtX-CD的热稳定性明显高于DtX。从表1的具体数据可见，DtX的半衰期t1/2为8.54h；DtX-CD的t1/2为62.45h，为DtX的7.3倍；DtX-CDL的稳定性最好，t1/2为77.63h；DtX-CDS1和DtX-CDS2的热稳定性相对于DtX-CD有一定的提高，t1/2分别为68.14h和70.02h。
T50(30)的比较结果显示，DtX为82.51℃；DtX-CDL为91.2℃；DtX-CD为89.7℃；DtX-CDS1和DtX-CDS2的T50(30)均为91℃左右，都高于DtX大约8.5℃。
该结果与DSC所检测的Tm结果一致(图8)，DtX有两个结构域，故Tm1＝92.86℃，Tm2＝75.46℃；DtX-CDL为94.58℃；DtX-CD为94.18℃；DtX-CDS1和DtX-CDS2的Tm相对于DtX-CD提高了约0.6℃。
由于DtX、DtX-CDL、DtX-CD、DtX-CDS1和DtX-CDS2分子量存在差异，我们将比活力定义为每μmol木聚糖酶所含的酶活力(U/μmol)。表1的数据显示，DtX-CDL的比活力最高，高于DtX-CD，说明linker的存在有助于提高酶的活力，推测因为DtX-CDL的最适温度和热稳定性的提高。DtX比活力反而最低，可能CBM的存在不利于酶的催化水解。DtX-CDS1和DtX-CDS2相对于DtX-CD活力略有提高，二硫键的引入并没有破坏DtX-CD原有的催化活性。从DtX、DtX-CDL、DtX-CD、DtX-CDS1和DtX-CDS2的比较可以看出，C末端对酶的热稳定性有较大影响，稳定该区域可能提高酶的热稳定性。
通过以上技术方案的实现，本发明具有以下优点：
(1)在极端嗜热菌中获得新型内切木聚糖酶，比常规的中温菌中获得的内切木聚糖酶具有更强的热稳定性与高温催化活性。
(2)通过对编码木聚糖酶的基因片段去除信号肽和引入N末端组氨酸尾，可以在异源宿主细胞如大肠杆菌内进行木聚糖酶基因的高效表达。
(3)目的蛋白木聚糖酶的表达水平高，且纯化方便。
(4)构建的木聚糖酶蛋白突变体的分子量更小，热稳定性提高，比活力也大大提高。
以上优点使得木聚糖酶及其截短突变体更有潜力应用于食品、造纸、饲料等行业的工业生产中。
以下将结合附图对本发明的构思、具体实施方式及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是DtX的结构模型；
图2是重组质粒pET28a-DtXyn11A的构建图；
图3是DtX的酶学性质表征：最适温度曲线；
图4是DtX的酶学性质表征：热稳定性曲线；
图5是DtX的酶学性质表征：最适pH曲线；
图6是DtX的酶学性质表征：pH稳定性曲线；
图7是DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体的85℃热稳定性比较图；
图8是DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体的DSC曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行进一步阐述。
实施例1、D.turgidum DSM 6724菌株的培养和保存
按照DSMZ的配方，配置厌氧培养基(anaerocellum medium)，分装于厌氧试管中，每管5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量的氮气和二氧化碳的混合气体(80％N2和20％CO2)，在厌氧箱中用培养基1ml溶解购买于DSMZ的D.turgidum DSM 6724，按照1％的接菌量接种于5ml试管中，混匀，80℃静置培养数天，直至细菌开始生长起来。然后转移至装有100ml培养基的锥形瓶中80℃培养数天，-80℃保存菌体。
实施例2、基因组DNA的提取
取5ml小试管培养的D.turgidum DSM 6724，用北京普博欣生物技术有限责任公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒(Bacteria Genomic Mini Preparation Kit)提取细菌的基因组，所得基因组DNA溶液放4℃冰箱备用。
实施例3、目的基因的克隆
以GenBank报道的D.turgidum DSM 6724 DtX(Gene ID:217966449)基因序列(即SEQ ID NO:1)为模板，用Oligo7.0设计两条特异性引物，通过PCR技术获得目的基因。引物如下：
P1:5’-TCAGCCATGGGCATGTTTAAAGTGTA-3’(下划线标注的为Nco I的酶切位点)
P2:5’-GTGCCAAGCTTCTATTGTATTTCTAA-3’(下划线标注的为Hind III的酶切位点)
将目的基因与载体进行NcoI和Hind III双酶切处理，体系如下，
将纯化好的酶切产物按照目的基因与载体摩尔比为10:1的比例通过T4连接酶进行连接，连接产物转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL中。在该重组质粒的构建过程中，克隆的是完整的目的基因，而且没有引入载体上的His-tag，所获得的是天然的目的蛋白。测序结果显示重组子pET28a-DtX构建成功，即木聚糖酶wtDtX重组菌构建成功。为了除去信号肽，并在N-末端引入His-tag，重新构建DtX基因工程菌，设计了如下引物，
P1:5’-CCGGGATCCACATCTATAACTCTAA-3’(下划线标注的为BamH I的酶切位点)
P2:5’-GTGCCAAGCTTCTATTGTATTTCTAA-3’(下划线标注的为Hind III的酶切位点)
实施例4、目的基因的表达和纯化
将DtX重组菌按1％接种量接种于5ml含100μg/ml卡那霉素的2YT培养基，在37℃下震荡培养过夜。然后按1％的接种量转接1000ml 2YT培养基，37℃震荡培养至OD600达到1.0左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度1mM，23℃诱导16-18h后，5000rpm离心20min收集菌体。菌体重悬于50mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液中，超声破碎后65℃热处理20-30分钟后离心取上清液即得粗酶。根据粗酶液体积计算，加入终浓度30-50mM的咪唑，150-200mM的NaCl。Ni-NTA重力柱同样缓冲液平衡，将处理的粗酶液以1ml/min的速度流过柱子。载样完毕后，以含有80-100mM的咪唑，150-200mM的NaCl，50mM Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液冲洗杂蛋白，最后用含有150-200mM的咪唑，50mM Tris-HCl(pH7.0)的缓冲液洗脱目的蛋白。
实施例5、DtX的活力测定及其酶学性质表征
用DNS法分析测定重组木聚糖酶活性：在一定条件下，300μl的反应体系包括10μl适当浓度酶液，150μl 2％的底物(w/v)，60μl缓冲液(200mM)和80μl ddH2O，反应5min；立即将反应体系放入冰水浴中，加入600μl DNS终止反应；沸水煮5min，冰浴5min，12000rpm离心2min，然后540nm测定OD值；根据D(+)-木糖标准曲线得出反应体系中产生的还原糖浓度，计算酶活力。
酶活力单位(U)定义：在给定条件下每分钟降解木聚糖底物释放1μmol还原糖所需要的酶量。
比活力定义：每mg或者g蛋白质所含的酶活力(U/mg或U/g)。
通过测定40-100℃温度范围内，酶催化水解Beechwood xylan的反应速率来测定DtX最适温度。以1％(w/v)的Beechwood xylan为底物，缓冲体系为40mMNa2HPO4-NaH2PO4(pH6.7)，酶浓度为0.05mg/ml，每个温度下测定3组平行数据，数据通过3组平行数据的平均值而得。最高酶活力设定为100％，以各温度下的酶活力相对于最高比活力的百分比(即相对活力)对温度作图，得温度-活力曲线(如图3所示)。
热稳定性测定方法：将0.2mg/ml的酶液，分别在80℃、85℃和90℃条件下保温不同的时间并取样，5倍稀释后在75℃下测定酶活，每个条件测定3组平行数据，取平均值为酶活力值，最高酶活力设定为100％，不同温度下的酶活力相对于最高酶活力的百分比(即相对活力)对孵育时间作图(如图4所示)，由此曲线可计算出DtX在对应温度下丧失一半活力的时间t1/2。另外，将一定浓度的酶液，分别在不同的温度保温30min后，再在75℃下测定酶活，每个条件测定3组平行数据，取平均值为酶活力值。初始时刻的酶活力设定为100％，不同保温温度下的酶活力相对于最高酶活力的百分比(即相对活力)对温度作图，由此曲线可计算出DtX在30min丧失一半活力的温度T50(30)。
75℃条件下精确配制不同pH的缓冲液。利用木聚糖酶的测活反应体系，在75℃下进行木聚糖酶活力测定pH 4.0-11.0范围内酶活力的变化(酶浓度为0.04mg/ml)，以1％Beechwood xylan为底物。每个pH下测定3组平行数据，取平均值为酶活力值。最高酶活力设定为100％，不同pH下的酶活力对于最高酶活力的百分比(即相对活力)对pH作图，即得pH-活力曲线(如图5所示)。
pH稳定性的测定也是基于DNS方法，取5μl酶液，分别加入500μl不同pH值缓冲液，酶的终浓度为0.04mg/ml。混匀后，在37℃水浴4h，然后冰浴，最后按标准方法测定酶活。酶储存液(储存于40mM Tris-HCl pH7.0中)的酶活力设定为100％，以不同pH下的酶活力对于最高酶活力的百分比(即相对活力)对pH作图，即得pH稳定性曲线(如图6所示)。
实施例6、DtX截短突变体及其含二硫键突变体的构建
基于结构域区域的界定结果，并在N末端引入His-tag，设计了截短突变体的引物。
DtX-CDL的引物如下，
P1:5’-CCGGGATCCACATCTATAACTCTAA-3’(下划线标注的为BamH I的酶切位点)
P2:5’-AGCAAGCTTTTATGTTACAGTAGTAC-3’(下划线标注的为Hind III的酶切位点)
DtX-CD的引物如下，
P1:5’-CCGGGATCCACATCTATAACTCTAA-3’(下划线标注的为BamH I的酶切位点)
P2:5’-AATCTCGAGTTAACTAGTGGAAAAGG-3’(下划线标注的为Xho I的酶切位点)
在DtX-CD的基础上，基于Disulfide by Design软件的分析结果，本发明分别设计了两对二硫键，S70C/Q195C和G35C/N196C。引物分别为：
如同以上步骤进行截短突变体和含二硫键的截短突变体的克隆、表达纯化和酶学性质表征。DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体的85℃热稳定性比较结果参见图7(初始时刻的酶活力设定为100％)；表1对DtX、截短突变体和含二硫键的截短突变体的酶学性质进行了综合比较。
实施例7、DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体的DSC曲线测定
差示扫描量热法(DSC)是在程序控制温度下，测量试样与参比物之间的能量差值随温度变化的一种分析方法。为使试样和参比物的温差保持为零，在单位时间所必需施加的热量与温度的关系曲线为DSC曲线。该方法被应用于检测广谱生物分子的内部结构稳定性，包括蛋白质、核酸、脂类和表面活性剂胶束等。VP-DSC仪器可以精确的快速测定蛋白质的半数分子变性温度(Tm)，用以检测蛋白的折叠和稳定性、抗体结构域测定等。本实施例对DtX及其截短突变体和含二硫键的截短突变体的DSC曲线进行了测定。实验中，保证参比(reference)和各样品缓冲液成分一致，均为10mMNa2HPO4-NaH2PO4(pH6.7)缓冲液，扫描温度范围为25-120℃，扫描速率为2℃/min。其结果如图8所示，各酶的Tm值见表1中的相应数据。
表1.DtX、截短突变和含二硫键的截短突变体的酶学性质综合比较
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列为SEQ ID NO:3，蛋白序列为SEQ ID NO:4。
2.一种基因工程木聚糖酶，其特征在于，其是DtX酶截去了C端的碳水化合物结合结构域之后的突变体。
3.如权利要求2所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列为SEQ IDNO:5，蛋白序列为SEQ ID NO:6；或基因序列为SEQ ID NO:7，蛋白序列为SEQ IDNO:8。
4.一种基因工程木聚糖酶，其特征在于，其是DtX酶截去了C端的碳水化合物结合结构域之后，又在C末端引入相互作用的突变体。
5.如权利要求4所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，所述引入的相互作用为二硫键。
6.如权利要求5所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列为SEQ IDNO:9，蛋白序列为SEQ ID NO:10；或基因序列为SEQ ID NO:11，蛋白序列为SEQ IDNO:12。
7.一种制备基因工程木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建目的蛋白基因；
2)构建基因工程菌并表达目的蛋白；
3)纯化目的蛋白；
其中，步骤1)中目的蛋白基因为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)在构建基因工程菌时，在重组目的蛋白的N端引入His-tag。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)的具体方法为将发酵后收获的宿主菌菌体悬液超声破碎后，放置于55-65℃热处理20-30分钟，沉淀大量杂蛋白，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后得到目的蛋白。
10.如权利要求1-6所述的基因工程木聚糖酶在工业生产中的应用。
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2014
- 2014-10-11 CN CN201410535145.1A patent/CN104293748A/zh active Pending
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