CN108424923A - 抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。该木聚糖酶的DNA序列选自：a）含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA序列，或b）编码SEQ ID NO.1所示蛋白序列的DNA序列，或c）在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或d）由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或e）a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链；设计对应的引物序列，构建了含该序列的表达载体和重组宿主菌；从宿主菌中分离得到抗抑制性木聚糖酶。本发明的抗抑制性木聚糖酶稳定性好，对XIP‑I具有强烈抗性，在抗XIP‑I型抑制蛋白和面粉加工领域有着广泛的应用前景。

Description

抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的主要成分，约占植物细胞干重的30%左右，可以被降解为低聚木糖、阿拉伯糖等，也可以被转化为生物燃料乙醇、丁醇等有用物质，因此被称作自然界中继纤维素后第二丰富的再生资源。木聚糖作为麸皮、小麦等谷物饲料中主要抗营养因子，它的完全水解需要木聚糖酶系的共同参与，其中内切β-1,4木聚糖酶能够对木聚糖的主链骨架结构之间的β-1,4糖苷键进行切割，因此被认为在木聚糖的水解中起着关键的作用。

木聚糖酶的来源十分广泛，在植物、昆虫、微生物中均能发现其踪迹。然而其主要来源于能致植物病的细菌和真菌。

依据其催化结构域氨基酸序列的同源性以及疏水簇的分析，将木聚糖酶划分为糖苷水解酶第10以及第11两个家族。这两个家族的酶在结构、等电点、底物特异、水解速率等方面均存在着较大的差异。GH10家族木聚糖酶主要由α-螺旋与β-折叠组成，呈现“salad”碗状，其底物结合缝隙位于碗状结构的中间。GH10家族木聚糖酶降解木聚糖的速率较快，并且能够降解纤维寡糖及其衍生物。GH11家族木聚糖酶通常由1个α-螺旋与多个β-折叠组成，整体呈现出右手半握状的形态，可细分为“手指”、“手掌”、“thumb”结构等区域。GH11家族木聚糖酶水解木聚糖的速率相对较慢，并且对底物有较高的特异性，被称作是真正的木聚糖酶。

木聚糖酶在食品加工、饲料生产、医药工程和造纸工艺等方面。其中，木聚糖酶在饲料生产中的应用较为广泛，它能显著地提高对木质纤维素物质的利用。麸皮、小麦等大多作为饲料的原料，其中含有大量的非淀粉类多糖，不能被非反刍动物消化吸收，反而加大消化道中的食糜体积，增加粘度，影响饲料的转化率。在饲料中适当的加入木聚糖酶等酶制剂，能够降解可溶性多糖，增强动物对营养物质吸收的能力，从而提高饲料的利用率，提高动物的生产性能。

然而，木聚糖酶的活性往往受到多方面因素的影响，例如酶的热稳定性，动物体内的蛋白酶等。近年包括发明人等的研究发现，在小麦等谷类植物中存在能够抑制木聚糖酶活性的蛋白类酶抑制剂——木聚糖酶抑制蛋白，从而严重影响木聚糖酶催化降解木聚糖的效率。由于木聚糖酶抑制蛋白存在的普遍性与持久性，因此动物饲料配制或谷物加工过程中添加的木聚糖酶的作用效果会受到木聚糖酶抑制蛋白的影响，从而影响饲料质量或加工效果；谷物中抑制蛋白的存在会降低木聚糖酶降解木聚糖的效果，从而限制了饲料利用率及动物生产效率；面包烤制过程中，小麦中抑制蛋白的存在会抵消木聚糖酶增大面包体积的效果；谷朊粉-淀粉分离过程中，抑制蛋白会降低谷朊粉和淀粉的分离效率。

因此，亟需研发一种热稳定性好的木聚糖酶，以便在木聚糖酶的应用领域上提高酶的作用效率，从而降低经济成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对XIP-I型抑制蛋白具有强烈抗性且稳定性好的抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术思路：

在对前期筛选获得的Orpinomyces sp.LT-3木聚糖酶序列进行深入分析研究的基础之上，发现了其具有抗XIP抑制蛋白的关键结构，进而对该木聚糖酶进行基因合成、诱导表达，进行抗性木聚糖酶的验证表明，该酶对XIP-I型抑制蛋白具有强烈抗性。研究发现该真菌木聚糖酶在其催化结构域的氨基酸序列后连接有纤维素结合模块（CBM）。目前已知序列的木聚糖酶中，CBM通常存在于GH10家族木聚糖酶中，并且在GH10家族木聚糖酶降解纤维寡糖及其衍生物方面起着重要作用。而且进一步的探究了CBM对木聚糖酶酶学性质、抗XIP-I型抑制蛋白抑制作用的影响，进一步拓宽真菌GH11家族抗性木聚糖酶在抗XIP-I抑制作用方面的视野。

本发明的详细技术方案如下：

一种编码抗抑制性木聚糖酶的DNA序列，选自：

a）：含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA序列，或

b）：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA序列，或

c）：在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或

d）：由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或

e）：a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链。

一种扩增所述上述DNA的引物序列， 如SEQ ID NO.3所示或SEQ ID NO.4所示。

构建一种表达载体，含上述DNA序列。

构建一种重组宿主菌，由所述表达载体转化而得。

由上述重组宿主菌可分离得到抗抑制性木聚糖酶，其对XIP-I型抑制蛋白具有抗性。

上述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建所述核酸序列的重组表达载体；

（2）将重组表达载体导入宿主菌构建重组宿主菌；

（3）发酵培养重组宿主菌后，离心收集菌体；

（4）破碎菌体，离心后收集上清液，得粗酶液；

（5）利用亲和层析纯化粗酶后，得抗抑制性木聚糖酶。

将所述抗抑制性木聚糖酶在抗XIP-I型抑制蛋白中应用。

优选的，所述木聚糖酶的反应温度为40℃～70℃。

优选的，所述木聚糖酶的反应pH为3.0～7.0。

将所述抗抑制性木聚糖酶在面粉加工领域中应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1.本发明对筛选自于Orpinomyces sp.LT-3木聚糖酶（XynA）的催化结构域（Xyn1）和CBM进行分析，通过PCR技术从XynA的基因序列中扩增出其催化结构模块的基因序列Xyn1，将XynA 和Xyn1在E.coli BL21（DE3）中诱导表达，并进一步的对二者的最适温度、最适pH、酸性稳定性、温度稳定性以及对XIP-Ⅰ型抑制蛋白抗抑制性作用的比较，基本探明了CBM对其相关的酶学性质及抗性作用的影响。

2.本发明得到的抗抑制性木聚糖酶在长时间内拥有较高的温度稳定性，对XIP-I具有强烈抗性。

3. 本发明得到的抗抑制性木聚糖酶的适宜的酶反应温度和酶反应pH范围广，酶活高，有很高的工业应用价值。

4. 本发明研究发现在较高温度的木聚糖酶应用领域，可开发使用XynA；而温度较低的木聚糖应用领域，可开发使用Xyn1。

5. 本发明的木聚糖酶在谷朊粉-淀粉分离过程中，可通过降低温度以营造出利于木聚糖酶反应的环境，进而提高的谷朊粉-淀粉分离效率。

附图说明

图1为通过PCR扩增出XynA催化结构域Xyn1的示意图；

图2为重组质粒pET-20b-Xyn1的琼脂糖凝胶核酸电泳图，

其中，M为λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker，1、2、3为pET-20b-Xyn1，4为pET-20b；

图3为XynA和Xyn1核苷酸序列翻译为氨基酸序列的比对图；

图4为XynA和Xyn1的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，

其中，M为M221 Marker，1为pET-20b，2为Xyn1，3为XynA；

图5为酶促反应的最适温度图；

图6为酶促反应的最适pH图；

图7为40℃条件下对酶稳定性的影响图；

图8为pH3.0条件下对酶稳定性的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：试剂配制

1. DNS反应液

取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中，于45℃水浴中放置一段时间后，依次加入3,5二硝基水杨酸6.3g（3,5一二硝基水杨酸在光照下不稳定，需避光操作），1%的NaOH 20.96g，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌使它们溶解，冷却后定容至1000mL，贮藏于棕色瓶中静置一周后使用。

2. 柠檬酸-磷酸缓冲液

甲液为0.1M柠檬酸， 21.01g C₆H₈O₇H₂O用灭菌去离子水定容至1000mL；

乙液为0.2M磷酸氢二钠，71.62g Na₂HPO₄•12H₂O用灭菌去离子水定容至1000mL。

表1 柠檬酸-磷酸缓冲液配方

。

实施例二：抗抑制性木聚糖酶催化结构域的克隆

1. 目的基因PCR扩增

分离来自Orpinomyces sp.LT-3的木聚糖酶，分析其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，进而由基因公司合成能够编码该氨基酸序列的核苷酸序列命名为XynA，如SEQ ID NO.2所示。

将核苷酸序列XynA导入表达载体pET-20b合成重组质粒pET-20b-XynA；

为克隆该木聚糖酶催化结构域，设计引物引入Nde-I与Xhol-I酶切位点扩增出核苷酸序列XynA的催化结构域的基因序列，命名为Xyn1。

通过PCR扩增催化结构域的基因序列Xyn1示意图如图1所示。

引物序列如表2所示。

表2 上、下游引物序列

。

PCR反应体系如表3所示。

表3 PCR反应体系

。

PCR反应条件为：

。

2. 目的基因PCR产物纯化

PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶核酸电泳检测并割胶回收，并用GeneMark公司的Plus DNA Clean/Extraction Kit试剂盒进行纯化。

具体操作步骤如下：通过割胶回收获得PCR产物后，水分吸干后放置于已称重的干净离心管中。加入3倍体积的Binding Buffer，于60℃加热5～10min至完全溶解后，转移至吸附柱中，13000g/min离心1min,弃滤液。加入500μl的Binding Buffer，13000g/min离心1min，弃滤液，完全除去琼脂。加入700μl的Wash Solution Buffer 13000g/min 离心1min,弃滤液，并重复此步骤。将空柱离心3-5min，除去残余乙醇。将吸附柱转移到新的离心管中，加入3μl 60℃预热的Elution Solution至滤膜上，静置2min。离心1min，洗脱出的DNA溶液置于-20℃保存。

3. 重组载体构建

将核苷酸序列Xyn1导入表达载体pET-20b合成重组质粒pET-20b-Xyn1，步骤如下：

（1）质粒pET-20b双切酶反应，按表4依次加入反应组分，37℃反应2.5h，纯化；

表4 酶切反应体系

。

（2）酶切产物与实施例二纯化的PCR产物在T4 DNA连接酶的作用下，按表5所示反应体系进行连接反应，形成连接有Xyn1的重组质粒。

表5酶连反应体系

。

经琼脂糖凝胶核酸电泳对Xyn1质粒DNA进行检测，如图2所示，在4360bp位置处有线性条带出现，符合重组质粒理论分子量大小，并且在对照组pET-20b的相应位置却未发现条带，因此挑选上述重组质粒进行基因测序。

测序结果如图3所示，Xyn1和XynA的催化结构域的氨基酸序列比对完全相同。

实施例三：抗抑制性木聚糖酶催化结构域的表达

1. 重组质粒的转化

将感受态细胞与重组质粒pET-20b-XynA或pET-20b-Xyn1共200μl充分混合后置于冰上静置保存30min后，放置于42℃水浴锅中热击90s，转至冰上静置90s后进行复苏。加入800µlLB液体培养基，放置于37℃，220rpm摇床培养30min，3000g/min离心5min。弃去上清液，保留20～50µL的LB培养基悬浮菌体，吸取转移至添加Amp的LB固体培养基上，37℃恒温条件下，平板倒置过夜培养。

2. 阳性转化子的筛选

挑选大小均一，形状规则的单菌落接种到5mL含有Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12～15h。使用上海生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳进行检测。挑选条带位置正确的质粒DNA送去金唯智生物科技有限公司进行基因测序。

3. 木聚糖酶的诱导表达

挑取保存的测序结果正确的单菌落在5mL含有Amp的LB培养基中，37℃，220rpm/min培养12h～15h。以1：100的比例吸取菌液转移至200mL加有Amp的LB培养基37℃，220rpm/min进行培养，至菌体浓度OD值达到0.6～0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，25℃, 180rpm/min诱导8h。4000g/min低温离心5min收集菌体，用灭菌的去离子水悬浮菌体。经超声破碎后，14000g/min低温离心30min，收集上清液。所得粗酶液于4℃保存。

4. Ni⁺柱亲和层析

① 取8ml粗酶液，6ml Binding Buffer与2ml平衡好的金属（Ni⁺）螯合琼脂糖凝胶树脂在层析柱中混合，置于层析柜中循环上样2h；

② 保留亲和后的混合液，留作SDS-PAGE检测。使用Washing Buffer 洗脱杂蛋白，洗脱体积为20～40ml；

③ 用含有咪唑的Elution Buffer洗脱目的蛋白，洗脱速度为1ml/40～60s，得纯酶。

5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白分子量

配制12％的分离胶，5％的浓缩胶，用制胶槽制胶。用M221的蛋白Mark做对照。

结果显示：

Xyn1重组质粒和XynA重组质粒经E.coli BL21（DE3）诱导表达，通过收集菌体、悬浮菌体、破碎细胞以及低温离心收集上清液后，经SDS-PAGE测定XynA和Xyn1木聚糖酶的分子量，如图4所示，2号位的25KD位置为目的蛋白Xyn1，3号位的36KD位置为目的蛋白XynA。

实施例四：木聚糖酶酶学性质的测定

1. 木聚糖酶酶活测定和酶活计算

通过3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitro salicylicacid，简称DNS）法，检测木聚糖酶降解木聚糖所释放的还原糖量。由于木聚糖酶可专一的降解木聚糖产生具有还原性的木糖或木寡糖，其暴露的还原性基团与3,5-二硝基水杨酸在加热状态下产生颜色反应，释放的还原糖量与颜色变化成正比，而木聚糖酶的活性又与还原糖的量成正比。使用分光光度计在540nm处测得的OD值，利用木糖标准曲线进行计算，从而计算出酶的活性。

酶活测定：

空白组和试验组中各加入100μl木聚糖底物，在试验管中加入100μl酶液， 50℃反应16min，冰浴终止反应，随即加入600μl DNS，同时空白组中补加100μl酶液，沸水浴共同反应10min，冰浴终止反应。用蒸馏水补齐5ml体系。使用分光光度计在540nm处的测定OD值。

酶活单位：最适反应条件下，以每分钟产生1μmol木糖所需要的酶量为一个酶活单位（IU）。

根据实验室的实验结果，酶活计算公式为：E=1.53×D×Y，

其中，E为木聚糖酶的活力，其单位为IU/ml，D为酶液稀释度，Y为吸光值。

2. 木聚糖酶酶学性质测定

（1）酶对XIP-I型抑制蛋白的抗抑制性

在50℃，pH6.2条件下进行测定，结果如表6所示：

表6 XynA和Xyn1对XIP-I的抗抑制性作用（550nmOD值）

。

XynA和Xyn1对XIP-I型抑制蛋白均具有一定的抗性，且经计算可得XynA对XIP-I的抑制率为19%，Xyn1对XIP-I的抑制率为1.48%，可知Xyn1比XynA具有更强的抗抑制作用。

（2）酶反应的最适温度

反应PH为6.2，分别设定温度40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，测定在不同温度条件下的酶活性。

结果如图5和表7所示：

表7 不同温度条件下XynA和Xyn1的酶活性（IU/ml）

。

如图5所示，XynA和Xyn1酶活性随温度的变化呈现出一条有峰值的曲线，随着温度的升高两者均在50℃处呈现最高酶活性，说明两者最适反应温度均为50℃。

（3）酶反应的最适PH

反应温度为50℃，分别用pH为3.0、3.8、4.6、5.4、6.2、7.0的柠檬酸-磷酸缓冲液配制木聚糖底物，测定在不同pH值条件下的酶活性。

结果如图6和表8所示：

表8不同pH反应条件下XynA和Xyn1的酶活性（IU/ml）

。

XynA和Xyn1的酶活性随pH的变化呈现出一条有峰值的曲线，且两者在pH3.0～3.8之间酶活显著降低，说明两者的耐酸性都比较弱。从图6可得知XynA和Xyn1在pH5.4～6.2之间酶活变化不大，处于最高酶活水平，说明两者的最适反应pH在5.4～6.2之间。

（4）温度对酶稳定性的影响

检测40℃下酶的稳定性，反应pH为6.2，反应温度为50℃，酶液放置在40℃水浴锅中分别保温1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h，测定残余酶活。

结果如图7和表9所示：

表9 40℃条件下XynA和Xyn1的酶活性（IU/ml）

。

在40℃条件下孵育不同的时间后，随着时间的增加XynA和Xyn1酶活性降低的不显著，说明两者在40℃条件下都具有广泛的稳定性。

（5）pH对酶稳定性的影响

取PH3.0的柠檬酸-磷酸缓冲液600μl与100μl的酶液混合。4℃，放置0h、1h、2h、3h、4h，测定其残余酶活。

结果如图8和表10所示：

表10 pH3.0条件下保温不同时间XynA和Xyn1的酶活性（IU/ml）

。

在pH3.0条件下，两者的初始酶活都显著降低，而在4℃冰箱孵育不同时间后，XynA和Xyn1在0～3h之间随着时间的增加酶活都无显著地降低，保持着较高的稳定性；3h～4h之间酶活突然急速下降直至完全丧失，说明XynA和Xyn1在pH3.0条件下不具有广泛的稳定性。

实施例五：结论和分析

通过以上实施例可知XynA和Xyn1都是对XIP-I型抑制蛋白具有抗性的木聚糖酶，但XynA在抗XIP的抑制作用方面弱于Xyn1；XynA和Xyn1的最适反应温度均为50℃；最适反应PH在5.0～6.2之间；在40℃条件下两者均具有广泛的稳定性，但XynA明显优于Xyn1；在pH3.0条件下两者不具有广泛的稳定性。

通过Ni⁺亲和层析纯化粗酶液，XynA的表达量明显多于Xyn1的表达量，可能是由催化结构域和CBM的氨基酸序列的差异造成的，也可能是由于CBM的存在增强了蛋白的表达量。

发明人研究表明CBM并不影响酶的最适温度、最适pH、酸性稳定性，而在XynA的热稳定性中起重要的作用。在对XIP-I抗抑制作用方面，CBM可能会与抑制蛋白相互作用，从而形成较大的复合物，降低酶的灵活性，从而导致酶活性的下降。因此在较高温度的木聚糖酶应用领域，应考虑开发使用XynA；而温度较低的木聚糖应用领域，应考虑开发使用Xyn1。

实施例六：Xyn1在面粉加工领域的应用

Xyn1对XIP-I型抑制蛋白具有强烈抗性，因此在谷朊粉-淀粉分离过程中，可通过降低温度以营造出利于木聚糖酶反应的环境，进而提高的谷朊粉-淀粉分离效率。

因此该Xyn1可应用于面粉加工领域。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 344

<212> PRT

<213> Orpinomyces sp.LT-3

<400> 1

Gln Trp Gly Gly Asn Gly Gly Ala Ser Ala Gly Gln Lys Leu Ser Val

1 5 10 15

Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val Phe Asp Gly Phe Ser Tyr

20 25 30

Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser Gly Ser Met Thr Leu Gly

35 40 45

Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser Ala Ala Val Asn Arg Gly

50 55 60

Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe Gly Ser Thr Lys Lys Ala

65 70 75 80

Thr Asp Tyr Glu Tyr Ile Gly Met Asp Tyr Glu Ala Ser Tyr Arg Gln

85 90 95

Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu Cys Val Tyr Gly Trp Phe

100 105 110

Gln Asn Arg Gly Ala Gln Gly Val Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Ile

115 120 125

Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala Gln Gly Lys Met Val Thr

130 135 140

Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln Met Asp His Thr Gly Pro

145 150 155 160

Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys Gln Tyr Phe Ser Val Arg

165 170 175

Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr Val Ser Asp His Phe Lys

180 185 190

Ala Trp Ala Ser Gln Gly Trp Gly Ile Gly Asn Leu Tyr Glu Val Ala

195 200 205

Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly Val Ala Asp Val Thr Lys

210 215 220

Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser Ala Pro Arg Thr Thr Thr

225 230 235 240

Thr Thr Thr Arg Thr Thr Thr Arg Thr Thr Thr Lys Thr Leu Pro Thr

245 250 255

Ser Gly Asn Lys Cys Ser Ala Lys Ile Thr Ala Gln Gly Tyr Lys Cys

260 265 270

Cys Ser Asp Pro Asn Cys Val Ile Tyr Tyr Thr Asp Glu Asp Gly Thr

275 280 285

Trp Gly Val Glu Asn Asn Gln Trp Cys Gly Cys Gly Val Glu Ala Cys

290 295 300

Ser Ser Lys Ile Thr Ala Gln Gly Tyr Lys Cys Cys Ser Asp Pro Lys

305 310 315 320

Cys Val Val Tyr Tyr Thr Asp Asp Asp Gly Lys Trp Gly Val Glu Asp

325 330 335

Asn Glu Trp Cys Gly Cys Gly Phe

340

<210> 2

<211> 1032

<212> DNA

<213> Orpinomyces sp.LT-3

<400> 2

caatggggtg gtaacggcgg cgcatctgca ggtcaaaaac tgtctgttgg cggcggtcaa 60

aaccagcata aaggcgtttt cgacggcttc tcctacgaaa tctggctgga taataccggc 120

ggttctggta gtatgaccct gggtaaaggc gcaaccttta aagcagagtg gtctgcagca 180

gttaatcgcg gtaattttct ggcacgtcgc ggtctggatt tcggtagcac caaaaaagcg 240

accgactacg aatacatcgg catggactac gaagcgagtt atcgtcaaac cgcatctgca 300

agcggtaatt ctcgtctgtg cgtttacggt tggtttcaaa atcgcggcgc acaaggcgtt 360

ccgctggtcg aatactacat catcgaggat tgggttgatt gggttccgga cgctcagggt 420

aaaatggtta ccattgacgg cgcgcagtac aaaatcttcc agatggacca taccggtccg 480

accattaacg gcggcaacga gaccttcaaa cagtacttca gcgttcgtca gcagaaacgt 540

acctctggcc atattaccgt cagcgatcat tttaaagcct gggcaagtca aggttggggt 600

attggcaacc tgtacgaagt tgcgctgaac gcagaaggtt ggcaaagttc tggcgtagct 660

gacgttacca aactggacgt ctataccacc aaacaaggtt ctgcaccgcg taccaccacc 720

accaccaccc gtaccaccac ccgtaccacc accaaaaccc tgccgacctc tggtaacaaa 780

tgtagcgcga aaattaccgc gcaaggctat aaatgttgca gcgatccgaa ctgcgtcatc 840

tactataccg acgaagacgg tacctggggc gttgaaaata atcagtggtg cggttgcggc 900

gttgaagcct gtagcagcaa aattaccgcc caaggctaca aatgctgttc cgacccgaaa 960

tgcgtcgtat attataccga cgacgacggt aaatggggcg ttgaagataa cgagtggtgc 1020

ggttgcggtt tt 1032

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gggtttcata tgatgcagtg gggtggtaac 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccctcgagca gtttggtaac gtcagcaac 29

Claims (10)

1.一种编码抗抑制性木聚糖酶的核酸序列，其DNA序列选自：

a）：含有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的DNA序列，或

b）：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的DNA序列，或

c）：在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或

d）：由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或

e）：a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链。

2.一种扩增权利要求1所述编码抗抑制性木聚糖酶的核酸序列的引物序列，其为SEQID NO.3所示或SEQ ID NO.4所示。

3.一种含有权利要求1所述DNA序列的表达载体。

4.一种由权利要求3所述表达载体转化而得的重组宿主菌。

5.一种由权利要求1所述核酸序列编码、权利要求3所述表达载体表达或权利要求4所述重组宿主菌分离的抗抑制性木聚糖酶。

6.权利要求5所述抗抑制性木聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建权利要求1所述核酸序列的重组表达载体；

（2）将重组表达载体导入宿主菌构建重组宿主菌；

（3）发酵培养重组宿主菌后，离心收集菌体；

（4）破碎菌体，离心后收集上清液，得粗酶液；

（5）利用亲和层析纯化粗酶后，得抗抑制性木聚糖酶。

7.权利要求5所述抗抑制性木聚糖酶在抗XIP-I型抑制蛋白中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述木聚糖酶的酶反应温度控制为40℃～70℃。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述木聚糖酶的酶反应pH控制为3.0～7.0。

10.权利要求5所述抗抑制性木聚糖酶在面粉加工领域中的应用。