CN108570476A - 厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用，编码该木聚糖酶的DNA序列选自：a）含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA序列，或b）编码SEQ ID NO.2所示蛋白序列的DNA序列，或c）在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或d）由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或e）a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链；以该序列构建出了表达载体和重组宿主菌；从重组菌种分离得到厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶。该抗抑制性木聚糖酶对XIP‑I拥有强烈抗性，能在抑制蛋白和面粉加工领域中广泛应用。

Description

厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。
背景技术
木聚糖是半纤维素的重要组分，其主要存在于植物细胞壁的次生壁中，约占细胞干重的35%，是除纤维素外自然界中最丰富的可再生资源。木聚糖由D-木糖残基通过β-1,4-糖苷键连接而成，主侧链上包含多种取代基，因此木聚糖结构比较复杂且结构差异较大。
木聚糖的降解过程是由木聚糖酶系协同作用的结果，β-木糖苷酶主要作用于木聚糖降解过程中寡聚糖的降解。α-葡萄糖醛酸苷酶、α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖脂酶和酚酸脂酶等主要负责降解木聚糖支链。然而，β-1,4-内切木聚糖酶能够切割木糖分子之间的β-1,4-糖苷键产生木寡糖，在木聚糖的降解过程中起着重要的作用。
木聚糖酶的来源相当广泛，已发现的能产木聚糖酶的微生物有细菌、链霉菌、青霉、木霉、曲霉等。目前人们广泛研究和应用的是细菌、木霉和曲霉产木聚糖酶。
依据木聚糖酶催化结构域氨基酸序列的同源性以及疏水簇的分析，将其划分为糖苷水解酶第10家族和第11家族。这两个家族的酶在结构、等电点、水解速率、底物特异等方面均存在着较大的差异。GH10家族木聚糖酶主要由α-螺旋与β-折叠组成，呈现“salad”碗状，其底物结合缝隙位于碗状结构的中间。GH10家族木聚糖酶降解木聚糖的速率较快，并且能够降解纤维寡糖及其衍生物。GH11家族木聚糖酶通常由1个α-螺旋与多个β-折叠组成，整体呈现出右手半握状的形态，可细分为“手指”、“手掌”、“thumb”等结构域。GH11家族木聚糖酶水解木聚糖的速率相对较慢，但对底物有较高的特异性，被称作是真正的木聚糖酶。
木聚糖酶的应用一直为研究者所关注，木聚糖酶在食品、饲料、造纸、生物转化等领域已经有了广泛的应用。其中，木聚糖酶在饲料工业中的应用较为广泛，它能显著地提高对木质纤维素物质的利用。麸皮、小麦等大多作为饲料的原料，其中含有大量的非淀粉类多糖，不能被非反刍动物消化吸收，反而加大消化道中的食糜体积，增加粘度，抑制营养物质的释放，影响饲料的利用率。在饲料中适当的加入木聚糖酶等酶制剂，能够降解可溶性多糖，降低食糜黏度，增强动物对营养物质吸收的能力，从而提高饲料的利用率，提高动物的生产性能。
近年的研究发现，在小麦等谷物中存在能够抑制木聚糖酶活性的木聚糖酶抑制蛋白。由于木聚糖酶抑制蛋白存在的普遍性与持久性，因此那些需要外加木聚糖酶而进行的动物饲料配制或谷物加工过程等，其中的木聚糖酶的作用效果会受到木聚糖酶抑制蛋白的影响，从而影响饲料质量或加工效果。面包烤制过程中，小麦中抑制蛋白的存在会抵消木聚糖酶增大面包体积的效果；谷朊粉-淀粉分离过程中，抑制蛋白会降低谷朊粉和淀粉的分离效率；动物饲料配制方面，谷物中抑制蛋白的存在会降低木聚糖酶降解木聚糖的效果，从而限制了饲料利用率及动物生产效率。迄今为止，已经发现了三种不同类型的木聚糖酶抑制蛋白TAXI 、XIP和TLXI。Ruth Flatman等发现TAXI、TLXI能够专一性地作用于GH11家族木聚糖酶；XIP则能够同时抑制真菌来源的GH10和GH11家族木聚糖酶。三型抑制蛋白中，XIP的含量是最高的，并且真菌木聚糖酶相较于细菌木聚糖酶拥有诸多优点。
因此，亟需选育出对XIP抑制蛋白具有抗性的木聚糖酶，以便在木聚糖酶的应用领域上提高酶的作用效率，从而降低经济成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对XIP抑制蛋白具有强烈抗性的厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术思路：
发明人前期进行了大量的筛选研究，最终筛选到一种来自于Piromyces sp. RRY-2002的木聚糖酶，并将该木聚糖酶从Piromyces sp. RRY-2002中分离并分析其氨基酸序列后，再以其为基础进行了基因密码子优化，得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列；然后进一步将该核苷酸序列转入E. coli BL21中表达，得到对XIP-I型抑制蛋白具有强烈抗性的木聚糖酶，并更进一步深入研究掌握了该酶的最适温度、最适pH、酸性稳定性、温度稳定性等特性。
具体技术方案如下：
设计编码一种厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶，所述DNA序列选自：
a）：含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA序列，或
b）：编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA序列，或
c）：在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或
d）：由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或
e）：a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链。
进一步的可构建一种含上述DNA序列表达载体。
还可进一步的利用上述表达载体转化得到一种重组宿主菌。
进一步转化，可得到一种厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶，其分子量为27kDa，其对XIP-I型抑制蛋白具有抗性。
上述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）构建所述核酸序列的重组表达载体；
（2）将重组表达载体导入宿主菌构建重组宿主菌；
（3）发酵培养重组宿主菌后，离心收集菌体；
（4）破碎菌体，高速离心后收集上清液，得粗酶液；
（5）利用亲和层析纯化粗酶后，得抗抑制性木聚糖酶。
将所述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶在抗XIP-I型抑制蛋白中应用。
优选的，所述木聚糖酶的反应温度为40℃～70℃。
优选的，所述木聚糖酶的反应pH为3.0～7.0。
优选的，所述木聚糖酶在40℃下的半失活时间为25min。
将所述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶在面粉加工领域中应用。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.发明人发现本发明的木聚糖酶与其它来源的GH11家族木聚糖酶的氨基酸序列比对，在其的“thumb”结构区域存在明显差异，并且在其G171后有额外的一个氨基酸的插入，与XIP-I形成空间上的对抗，导致其不受XIP-I的抑制。
2.本发明的木聚糖酶的酶反应温度范围广，酶活性高，酸性环境下仍能长时间保持较高相对活力。
3.本发明的木聚糖酶长时间内拥有较高的温度稳定性，对XIP-I拥有强烈抗性。
4. 本发明的木聚糖酶在谷朊粉-淀粉分离过程中，可通过降低温度以营造出利于木聚糖酶反应的环境，进而提高的谷朊粉-淀粉分离转化效率。
附图说明
图1为重组蛋白SDS-PAGE电泳图；
其中，M为M221 marker，1～3为咪唑浓度100mM，4～8为咪唑浓度150mM，9～13咪唑浓度200mM，14为pET-20b；
图2为重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图；
其中，M为 M221 marker，1为pET-20b，2为重组蛋白；
图3为温度对抗性木聚糖酶活力的影响图；
图4为pH对抗性木聚糖酶活力的影响图；
图5为在40℃环境下酶的稳定性曲线图；
图6为在pH 3.0、4℃环境下酶的稳定性曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例一：试剂和溶液
1. LB液体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，溶于1000ml蒸馏水，调节pH至7.0，121℃高温灭菌30min。
2. DNS反应液
称取酒石酸钠182g，溶解于500ml蒸馏水中，放入45℃水浴中加热，并在热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，1%的NaOH 20.96g，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至完全溶解，冷却后定容至1000ml，贮藏于棕色瓶避光保存，静置7天后使用。
3. 柠檬酸-磷酸缓冲液
甲液为0.1M柠檬酸，称取柠檬酸21.01g用灭菌去离子水定容至1000ml。
乙液为0.2M磷酸氢二钠，称取磷酸氢二钠71.62g用灭菌去离子水定容至1000ml。
4．1%山毛榉木聚糖底物
称取山毛榉木聚糖0.100g于10ml不同pH的柠檬酸-磷酸缓冲液中，100℃煮沸至完全溶解，冷却待用。
表1 柠檬酸-磷酸缓冲液配方
。
5. 其它缓冲液
Binding Buffer：0.02 M PB，0.5 M NaCl，0.02-0.04 M Imidazole，PH 7.4；
Washing Buffer：0.02 M PB，0.5 M NaCl，0.05 M EDTA，PH 7.4；
Elution Buffer：0.02 M PB，0.5 M NaCl，0.5 M Imidazole，PH 7.4。
实施例二：重组质粒的构建
将木聚糖酶从Piromyces sp. RRY-2002中分离并分析其氨基酸序列，然后，进行基因密码子优化。该酶经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
木聚糖酶基因经密码子优化后的核苷酸序列交由基因公司合成，合成基因通过Not I 和 EcoR I双酶切进行回收，然后酶连到经相同限制性酶处理过的pET-20b质粒中，最后转化E. coli BL21（DE3）。
实施例三：木聚糖酶的表达和纯化
1. 木聚糖酶的诱导表达
（1）挑取过夜培养的形状规则、大小均一的重组大肠杆菌E. coli BL21单菌落转接到含氨苄青霉素LB培养基的试管中以37℃、220rpm/min培养12h～15h；
（2）吸取2ml菌液转移至200ml加有氨苄青霉素的LB培养基中以37℃、220 rpm/min培养2h，至菌体浓度OD为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，置于25℃、180rpm/min摇床培养8h。
（3）以4000g/min低温离心5min收集菌体，灭菌去离子水悬浮菌体后置于冰上用超声破碎机破碎细胞。14000g/min低温离心30min，取上清。所得粗酶液于4℃保存。
2. 粗酶纯化
（1）Ni+柱亲和层析
① 取8ml粗酶液，6ml Binding Buffer与2ml平衡好的金属（Ni+）螯合琼脂糖凝胶树脂在层析柱中混合，置于层析柜中循环上样2h；
② 保留亲和后的混合液，留作SDS-PAGE检测。使用Washing Buffer 洗脱杂蛋白，洗脱体积为20～40ml；
③ 分别用含有不同浓度咪唑的Elution Buffer洗脱目的蛋白，洗脱速度为1ml/40～60s。咪唑浓度梯度为20mM、50mM、100mM、150mM、200mM；
④ SDS-PAGE检测酶的纯度。
结果如图1所示。
将咪唑浓度为150mM的部分收集管及200mM的全部收集管条带单一且条带位置在27kDa左右，符合理论分子量，可以进行合并。
（2）超滤除盐
将通过SDS-PAGE检测的目的条带单一的管数进行合并，并使用超滤管超滤纯酶液除去咪唑等盐离子，SDS-PAGE检测酶的纯度。
结果如图2所示。
蛋白分子大小约为27kDa，符合理论分子量，且纯度很高。
实施例四：木聚糖酶的酶学性质检测
1. 木聚糖酶酶活测定及酶活计算
使用DNS（3,5-二硝基水杨酸）法。DNS是测定木聚糖酶活性最常用的显色剂。木聚糖酶可降解木聚糖产生还原糖，还原糖与3，5-二硝基水杨酸（DNS）在100℃加热状态下发生颜色反应，颜色变化与还原糖量成正比，进而反映木聚糖酶的活性。用分光光度计测定540nm处OD值，利用木聚糖标准曲线换算即可得到酶的活性。
酶活测定具体步骤为：
在冰水混合物下，将试验组、空白组中各加100μl木聚糖底物溶液，试验组中加入100μl纯化后的木聚糖酶液，于50℃水浴反应16min，冰浴终止反应，立即加入600μlDNS溶液，空白组中加入100μl酶液，100℃水浴10min，冰浴终止反应并用蒸馏水将体系补至5ml。于540nm波长下测定OD值。在上述条件下，以每分钟产生1μmol木糖所需的酶量为一个酶活力单位（IU）。设置三个平行，取其平均值。
酶活计算公式为：E=1.53×D×Y
其中，E为木聚糖酶的活力，单位为IU/ml；D为酶液稀释度；Y为吸光值。
2. XIP-I型抑制蛋白对木聚糖酶的抑制性
XIP-I型抑制蛋白与木聚糖酶以摩尔比1：1的比例混合，在30℃下保温30min。用pH6.2的柠檬酸-磷酸缓冲液配制1%的木聚糖底物。对照组加入煮沸灭活的抑制蛋白，反应温度为50℃，其余条件不变。
测定结果如表2所示：
表2 抗性木聚糖酶对XIP-I的抗抑制作用
。
由表2可知，该重组蛋白为木聚糖酶，且对XIP-I型抑制蛋白具有强烈抗性。
3. 抗性木聚糖酶最适反应温度
用pH6.2的柠檬酸-磷酸缓冲液配制木聚糖底物，反应温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，其余条件不变，根据OD值利用还原糖的标准曲线计算出活力，以温度梯度为横坐标，酶活百分比为纵坐标绘制曲线。
结果如图 3 所示。
抗性木聚糖酶的酶活力随温度的变化呈一条有峰值的曲线，峰值处为60℃，说明抗性木聚糖酶在 60℃时有最大酶活力。温度高于60℃时酶活急剧下降，且温度越高，酶活下降速率越大。温度从60℃降低到50℃，酶活为最大值的85%；温度从60℃升高到70℃，酶活为最大值的55%。所以，抗性木聚糖酶的最适温度为60℃。
4. 抗性木聚糖酶最适反应pH
反应温度为40℃，分别用pH为3.0、3.8、4.6、5.4、6.2、7.0的柠檬酸-磷酸缓冲液配制1%的木聚糖底物，其余条件不变。根据OD值利用还原糖的标准曲线计算出活力，以pH梯度为横坐标，酶活百分比为纵坐标绘制曲线。
结果如图 4 所示。
抗性木聚糖酶的酶活力随pH的变化呈一条有峰值的曲线，峰值处pH为5.4，说明抗性木聚糖酶在pH5.4时有最大酶活力。在pH5.4～pH6.2范围内，酶活下降较少;pH小于5.4及大于6.2时，酶活急剧下降。当pH小于3.8时，酶活完全丧失。所以抗性木聚糖酶的最适反应pH是5.4。
5. 40℃环境下抗性木聚糖酶的稳定性
用pH6.2的柠檬酸-磷酸缓冲液配制1%的木聚糖底物。酶液在40℃水浴中保温0min、10min、20min、30min测定残余酶活。根据OD值利用还原糖的标准曲线计算出活力，以时间梯度为横坐标，酶活百分比为纵坐标绘制曲线。
结果如图 5 所示。
抗性木聚糖酶的酶活力随保温时间的增长不断降低，保温时间约为25min时，酶活力降低为初始酶活的一半，所以40℃环境下抗性木聚糖酶的半失活时间为25min。
6. pH3.0、4℃环境下抗性木聚糖酶的稳定性
取pH3.0的缓冲液600μl与100μl的酶液混合。4℃，放置0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h后取100μl混合液测其酶活。根据OD值利用还原糖的标准曲线计算出活力，以时间梯度为横坐标，酶活百分比为纵坐标绘制曲线。
结果如图 6 所示。
抗性木聚糖酶的酶活力随保温时间的增长不断降低，保温时间为2h时，酶活为最大值的60%；保温时间大于2h时，酶活急剧下降，2.5h时，酶活为最大值的25%。
实施例五：木聚糖酶在面粉加工领域的应用
该木聚糖酶对XIP-I型抑制蛋白具有强烈抗性，因此在谷朊粉-淀粉分离过程中，可通过降低温度以营造出利于木聚糖酶反应的环境，进而提高的谷朊粉-淀粉分离效率。
因此该木聚糖酶可应用于面粉加工领域。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南农业大学
<120> 厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的克隆、表达及其应用
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Piromyces sp. RRY-2002
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<212> PRT
<213> Piromyces sp. RRY-2002
<400> 2
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1 5 10 15
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Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser Gly Ser
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Thr Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu Cys Val
100 105 110
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115 120 125
Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala Gln Gly
130 135 140
Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln Met Asp
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Asp Val Thr Leu Leu Asp Val Tyr Thr Thr Pro Lys Gly Ser Ser Pro
225 230 235 240
Ala Thr Ser Ala Ala Pro Arg Thr Thr Thr Arg Thr Thr Thr Arg Thr
245 250 255
Lys Ser Leu Pro Thr Asn Tyr Asn Lys Cys Ser Ala Arg Ile Thr Ala
260 265 270
Gln Gly Tyr Lys Cys
275

Claims (9)

1.一种编码厌氧真菌来源的抗抑制性木聚糖酶核酸序列，其DNA序列选自：
a）：含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA序列，或
b）：编码SEQ ID NO.2所示蛋白序列的DNA序列，或
c）：在严格条件下可与a）或b）的DNA序列杂交的DNA序列，或
d）：由于遗传密码的简并性而与a）、b）或c）中DNA序列相关的DNA序列，或
e）：a）、b）、c）或d）中DNA序列的互补链。
2.一种含权利要求1所述DNA序列的表达载体。
3.一种由权利要求2所述表达载体转化而得的重组宿主菌。
4.一种由权利要求1所述核酸序列编码、权利要求2所述表达载体表达或权利要求3所述重组宿主菌分离的厌氧真菌来源的抗抑制性木聚糖酶。
5.权利要求4所述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建权利要求1所述核酸序列的重组表达载体；
（2）将重组表达载体导入宿主菌构建重组宿主菌；
（3）发酵培养重组宿主菌后，离心收集菌体；
（4）破碎菌体，离心后收集上清液，得粗酶液；
（5）利用亲和层析纯化粗酶后，得抗抑制性木聚糖酶。
6.权利要求4所述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶在抗XIP-I型抑制蛋白中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述木聚糖酶的酶反应温度控制为40℃～70℃。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述木聚糖酶的酶反应pH控制为3.0～7.0。
9.权利要求4所述厌氧真菌来源抗抑制性木聚糖酶在面粉加工领域中的应用。
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