CN107586787A - 具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法，提取小麦全基因组，并采用以下特异引物扩增小麦的Xyn B基因第三外显子内的活性位点序列，电泳切胶回收DNA片段经限制性内切酶EcoR V和EcoR I酶切后与载体pET30a+构建重组表达载体，经转化菌转化后获得重组质粒pET30a‑Xyn B，重组质粒pET30a‑Xyn B转化至工程菌，经培养后获取单克隆菌落，转至培养基中培养并诱导蛋白表达，获得重组木聚糖酶XynB；其中，所述的特异引物为：正向引物：5’‑TCGATATCATGCAGCTGGACAACGCCTT‑3’，反向引物：5’‑TCGAATTCTGCGTCCGTCTTCCACTCCC‑3’。所得重组木聚糖酶XynB活性强，取其未经过纯化的酶液进行DNS检测，以桦木木聚糖为底物推算，重组木聚糖酶Xyn B的比活力能达到67.30U/mg。

Description

具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法

技术领域

本发明涉及木聚糖酶XynB的构建，尤其涉及具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法。

背景技术

青贮作为一种保存越冬饲料作物青绿多汁的传统方式，是以新鲜的青绿饲料为原料，利用植物表面自然附生的乳酸菌，在密闭条件下，通过厌氧发酵，将植物表面的可溶性碳水化合物转化为乳酸、乙酸等有机酸，导致饲料pH降低，来抑制腐败微生物菌群的生长繁殖，从而达到保持作物的营养特性的目的。木聚糖作为一种多聚五碳糖，是植物细胞壁中的主要结构非淀粉多糖，是植物半纤维素的重要组成部分，占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生物质资源。但在青贮发酵过程中，乳酸菌不能分解植物的半纤维素，而微生物木聚糖酶却能水解木聚糖生成长度各异的木寡糖，对半纤维素降解起着关键作用，其能大幅度提高木质纤维素物质的利用效率，因此在饲料工业、食品工业和造纸工业中具有巨大的应用前景。如在制作青贮饲料过程中添加木聚糖酶，木聚糖酶就能把植物中的半纤维素成分降解转化为小分子的单糖、寡糖，不仅便于牲畜的吸收利用，还能为青贮过程中，乳酸菌的发酵提供营养。谷物作物(水稻、玉米、小麦等)中存在抑制木聚糖酶活性的木聚糖酶抑制蛋白，能对木聚糖酶的应用产生负面影响。为了进一步提高该类饲料的青贮品质，在青贮过程中添加抗抑制活性木聚糖酶是非常必要的，且具有重要的现实意义和重大的经济价值。

研究表明小麦等谷物作物中存在能抑制木聚糖酶活性的蛋白质成分，称为木聚糖酶抑制蛋白。1997年，内切木聚糖酶抑制蛋白首次在小麦中发现(Debyser et al.,1997)。2005年，木聚糖酶抑制蛋白首次在水稻中发现(Goesaert et al.,2005)。木聚糖酶抑制蛋白还在黑麦、大麦、玉米和高粱等谷物中都有发现。木聚糖酶抑制蛋白按结构分为三大类：XIP型木聚糖酶抑制蛋白、TAXI型木聚糖酶抑制蛋白和TLXI型木聚糖酶抑制蛋白(Debyseret a1.,1997；Fierens et a1.,2007；MeLauchlan et a1.,1999)。谷物作物整个发育过程中都存在木聚糖酶抑制蛋白，且木聚糖酶抑制蛋白存在谷物的各组织中，如根、芽、叶及发育和萌芽的谷物等(侯春晓,2014；王明道等,2010；Xin et a1.,2014)。这就对木聚糖酶应用领域中酶功效的发挥提出了挑战：抑制蛋白的存在是否影响外加木聚糖酶的作用？据估算(Gebruers et a1.,2005)，小麦面粉中抑制蛋白的含量远大于应用过程中外加木聚糖酶在其中的比例。而小麦基础饲粮中抑制蛋白也影响了对抑制蛋白敏感的木聚糖酶添加剂的作用(Perez-Vendrell et a1.,2003)。因此，我们应当足够重视木聚糖酶抑制蛋白对木聚糖酶应用领域产生的负面作用。令人值得欣喜的是，研究表明木聚糖酶抑制蛋白能抑制外源木聚糖酶的活性(尤其是细菌等来源的)，但却无法抑制植物内源木聚糖酶的活性(Dornez et a1.,2010)。但是，直接从植物中提取分离木聚糖酶，需要耗费大量植物，而且工艺复杂，所得木聚糖酶活性也不理想。然而目前，对于植物内源性木聚糖酶的克隆和表达研究还相对较少。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法。

本发明上述目的通过以下技术方案来实现：具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法，提取小麦全基因组，并采用以下特异引物扩增小麦的Xyn B基因第三外显子内的活性位点序列，电泳切胶回收DNA片段经限制性内切酶EcoR V和EcoR I酶切后与载体pET30a+构建重组表达载体，经转化菌转化后获得重组质粒pET30a-Xyn B，重组质粒pET30a-Xyn B转化至工程菌，经培养后获取单克隆菌落，转至培养基中培养并诱导蛋白表达，获得重组木聚糖酶XynB；其中，所述的特异引物为：

正向引物：5’-tcgatatcatgcagctggacaacgcctt-3’，划线部分为EcoR V限制性内切酶位点，

反向引物：5’-tcgaattctgcgtccgtcttccactccc-3’，划线部分为EcoR I限制性内切酶位点。

本发明所述的限制性内切酶采用EcoR I和EcoR V。所述工程菌选用原核表达感受态菌株Ecoli.BL21(DE3)。

本发明具有以下优点：

1.本发明以中国春小麦内切-1,4-β-木聚糖酶序列为模板设计特性引物扩增小麦的Xyn B基因第三外显子内的活性位点序列并构建表达载体pET30a-Xyn B后诱导获得重组木聚糖酶XynB。由于所得的重组木聚糖酶XynB由于来源于中国春小麦，属于植物内源性木聚糖酶不会受到植物中木聚糖酶抑制蛋白所抑制，是具有抗抑制活性的重组蛋白。将其应用于青贮饲料中可以抵抗小麦等谷物作物中木聚糖酶抑制蛋白的抑制作用，对饲料中的纤维素进行有效分解。

2.本发明构建的重组木聚糖酶XynB的比活力高达152.0891U/mg，活性强，具有非常强的分解植物纤维素能力。

附图说明

图1是PCR扩增电泳图；

图2是重组质粒PCR扩增电泳图；

图3是重组木聚糖酶基因序列与NCBI基因序列比对结果；

图4是重组木聚糖酶表达情况电泳图；

图5是重组His融合蛋白的Wester Blotting检测结果；从左至右依次分别为：诱导1小时；4小时和6小时。

图6是重组木聚糖酶质谱鉴定结果。

具体实施方式

本发明提供具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建如下：

①使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)抽提小麦全基因组。以NCBI基因库中的序列中国春小麦内切-1,4-β-木聚糖酶(endo-1,4-b-xylanase,NCBI基因编码:AF156977.2)序列为模板，通过Oligo 7.0生物学软件设计特异引物，用于扩增小麦的Xyn B基因第三外显子内的活性位点序列。

引物序列为：

正向引物：5’-tcgatatcatgcagctggacaacgcctt-3’(划线部分为EcoR V限制性内切酶位点)；

反向引物：5’-tcgaattctgcgtccgtcttccactccc-3’(划线部分为EcoR I限制性内切酶位点)

引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

②以小麦基因组DNA为模板，通过特异引物，在Bio-Rad C1000touch PCR仪进行扩增。扩增程序如下：

95℃，3min；

72℃，10min。

所得的Xyn B基因扩增产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后(图1)，符合预计产物判断大小的条带使用DNA片段琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化)进行回收。

③纯化后的Xyn B基因扩增产物和pET 30a+载体使用EcoR I和EcoR V(TaKaRa公司)限制性内切酶，37℃酶切8h；酶切产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，使用DNA片段琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化)进行回收。

回收后的酶切产物按照以下连接程序构建重组表达载体：

16℃恒温水浴连接过夜。

④次日，取连接产物5.0μL转化至100μL的Ecoli.DH5a感受态细胞(天根生化)；转化菌BL21DE3Plyss经过37℃，150rpm活化1h后，取200μL活化菌涂布在含有50μM卡那霉素的LB平皿，37℃，培养16h；挑取筛选平皿上的单克隆菌落，在5mL含有50μM卡那霉素的LB液体培养基中37℃，220rpm培养8h。离心收集细菌，通过质粒小量提取试剂盒(天根生化)抽提重组质粒pET 30a-Xyn B；重组质粒pET 30a-Xyn B经过PCR(图2)和双酶切鉴定后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定(图3)，结果如SEQ IDNO：1所示。

⑤序列鉴定正确的重组质粒pET 30a-Xyn B转化原核表达感受态菌株Ecoli.BL21(DE3)(天根生化)，转化菌经过37℃，150rpm活化1h后，取200μL活化菌涂布在含有50μM卡那霉素的LB平皿，37℃，培养16h；挑取筛选平皿上的单克隆菌落，在5mL含有50μM卡那霉素的LB液体培养基中37℃，220rpm培养至OD600达到0.5时，添加终浓度为0.1mM的IPTG诱导重组蛋白表达5h。分别离心留取诱导前和诱导后的菌体用于重组蛋白表达检测。

⑥使用5×SDS PAGE蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司)分别悬浮沉淀的步骤⑤中的诱导前及诱导后的菌体，然后置于沸水中煮沸10min，然后通过12％SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达情况，凝胶经过考马斯亮蓝R250染色后可见有清晰的重组蛋白表达条带(图4)。并通过Western Blotting技术以鼠源HRP标记6×His-tag融合标签的单克隆抗体检测重组His融合蛋白的表达(图5)；最后，将12％SDS-PAGE凝胶中的疑似重组蛋白条带切割后，送广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室进行蛋白质谱鉴定(图6)，所得的重组木聚糖酶XynB的分子量为33.497kDa。

⑦参照中国国家标准化管理委员会2009年公布的《饲料添加剂木聚糖酶活力的测定—分光光度法》(GBT23874-2009)的测定方法，以木聚糖为底物，用DNS法测定添加重组木聚糖酶Xyn B后还原糖的生成量，并参照木糖标准曲线，推算出重组木聚糖酶Xyn B的比活力为152.0891U/mg。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims (2)

1.具有抗抑制活性的重组木聚糖酶XynB的构建方法，其特征是，提取小麦全基因组，并采用以下特异引物扩增小麦的Xyn B基因第三外显子内的活性位点序列，电泳切胶回收DNA片段经限制性内切酶EcoR V和EcoR I酶切后与载体pET30a+构建重组表达载体，经转化菌转化后获得重组质粒pET30a-Xyn B，重组质粒pET30a-Xyn B转化至工程菌，经培养后获取单克隆菌落，转至培养基中培养并诱导蛋白表达，获得重组木聚糖酶XynB；其中，所述的特异引物为：

正向引物：5’-TCGATATCATGCAGCTGGACAACGCCTT-3’，划线部分为EcoR V限制性内切酶位点，

反向引物：5’-TCGAATTCTGCGTCCGTCTTCCACTCCC-3’，划线部分为EcoR I限制性内切酶位点。

2.根据权利要求1所述的重组木聚糖酶XynB的构建方法，其特征是，所述工程菌选用原核表达感受态菌株Ecoli.BL21(DE3)。