CN107109346A - 用于生产乙醇的方法和发酵生物 - Google Patents

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Abstract

用于生产乙醇的方法，包括用纤维素分解酶组合物使纤维素材料糖化，并且用发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料，以生产乙醇。该发酵生物是酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(Agricultural Research Culture Collection,NRRL)登录号NRRL Y‑50973下保藏)或具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物。

Description

用于生产乙醇的方法和发酵生物
发明领域
本发明涉及用于从纤维素材料生产乙醇的改进方法和改进的发酵生物。
发明背景
乙醇是通常共混入汽油中的运输燃料。纤维素材料用作乙醇生产方法中的原料。在本领域中存在若干种用于制造包含葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的纤维素和半纤维素水解产物的方法。葡萄糖和甘露糖在天然无氧代谢过程中有效地转化为乙醇。到目前为止，最有效的产乙醇微生物是酵母菌酿酒酵母。然而，酿酒酵母缺乏将主要的糖木糖转化为木酮糖所必需的酶，并且因此不能利用木糖作为碳源。这样做需要酿酒酵母的基因工程以表达可以将木糖转化为木酮糖的酶。需要的多种酶之一是木糖异构酶(E.C.5.3.1.5)，它将木糖转化为木酮糖，然后木酮糖可以在发酵期间被酿酒酵母转化为乙醇。
WO 2003/062430披露了将功能性的梨囊鞭菌属(Piromyces)木糖异构酶(XI)引入酿酒酵母，通过由XKS1编码的内源性木酮糖激酶(EC 2.7.1.17)和戊醣磷酸途径的非氧化部分的酶，允许木糖的缓慢代谢，并且赋予该酵母菌转化体生长在木糖上的能力。
美国专利号8,586,336-B2披露了一种表达由牛瘤胃液而获得的木糖异构酶的酿酒酵母酵母菌菌株。该酵母菌菌株可以用于在厌氧发酵条件下通过培养来生产乙醇。
尽管在过去十年中来自纤维素材料的乙醇生产方法显著改进，但仍然存在提供改进方法的希望和需求。为了经济地生产乙醇，需要一种生物学有效的发酵生物。
发明概述
本发明还涉及生产乙醇的方法，该方法包括：
(a)用一种纤维素分解酶组合物使一种纤维素材料糖化；
(b)用发酵微生物发酵糖化的纤维素材料以生产乙醇；其中该发酵生物是酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(Agricultural Research Culture Collection,NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)或一种具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物菌株。
在一个优选的实施例中，该方法包括从发酵中回收乙醇。
在一个实施例中，该酵母细胞投料是介于0.1g和20g DWC酿酒酵母CIBTS1260/L发酵培养基之间，例如0.2g/L-10g/L，优选地是0.3g/L-5g/L，例如0.4g/L，例如1g DWC/L左右或2g DWC/L左右。
在另一方面，本发明涉及具有与酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)的一样的特性的重组发酵生物或具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物。
在一个优选的实施例中，具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的本发明的发酵生物具有一个或多个，例如所有的，以下特性：
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，相比BSGX001更高的木糖消耗，特别是如在实例3中所述；
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，相比BSGX001更高的葡萄糖消耗，特别是如在实例3中所述；
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，相比BSGX001更高的乙醇生产，特别是如在实例3中所述。
在一个实施例中，本发明的发酵生物包括编码具有在US 8586336B2中在SEQ IDNO:2或在此SEQ ID NO:13中示出的木糖异构酶活性的氨基酸序列，或编码与在US8586336B2中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:13至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％一致的氨基酸序列的基因。在该发酵生物中编码该木糖异构酶的基因可以是在美国专利号8,586,336-B2(通过引用结合在此)中在SEQ ID NO:1或在此的EQ ID NO:20中示出的那一个，或是与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％一致性的序列。
在一个实施例中，本发明的发酵生物具有一个或多个，例如所有的，以下遗传修饰：
-从牛瘤胃液获得的木糖异构酶基因(Ru-XI)，特别是在此SEQ ID NO:20中示出的一个，编码在此SEQ ID NO:13中示出的木糖异构酶；
-任选地来自中间假丝酵母的一种戊糖转运基因(GXF1)，特别是在SEQ ID NO:18中示出的那一个；
-木酮糖激酶基因(XKS)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-核酮糖5磷酸3-差向异构酶基因(RPE1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-核酮糖5磷酸异构酶基因(RKI1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-转酮酶基因(TKL1)和转醛醇酶基因(TAL1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
在一个具体实施例中，该发酵生物是酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)。
附图简述
图1示出容纳mgXI和GXF表达盒的质粒pYIE2-mgXI-GXF1-δ的质粒图。
图2示出使用pSH47-hyg的质粒的质粒图。
图3示出生成的质粒pYIE2-XKS1-PPP-δ的图。
图4示出在1g DCW/L酵母菌投料、35℃、pH 5.5下，经72小时，在NREL酸预处理的玉米秸杆水解产物中的CIBTS1260对比BSGX001的发酵比较。
图5示出在模式培养基(2g/L酵母菌投料、32℃、pH 5.5、72小时)中酿酒酵母对比BSGX001的比较。
图6示出经72小时，以1g/L酵母菌投料，与CIBTS1260一起的纤维素分解酶组合物CA和纤维素分解酶组合物CB产生的甘蔗渣水解产物的发酵比较。
图7示出在1g/L酵母菌投料、35℃、pH 5.5下，72小时，在用纤维素酶CA或CB产生的水解产物的发酵期间，DP2浓度的降低百分比。
发明详细说明
本发明提供了用于使用一种发酵生物，从木质纤维素材料中生产乙醇的改进方法。
定义
辅助活性9：术语“辅助活性9”或“AA9”意指分类为溶解性多糖单加氧酶(昆兰(Quinlan)等人，2011，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)208:15079-15084；菲利普斯(Phillips)等人，2011，ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)6:1399-1406；林(Lin)等人，2012，结构(Structure)20:1051-1061)的多肽。根据亨利萨特(Henrissat)，1991，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；以及亨利萨特(Henrissat)和贝洛赫(Bairoch)，1996，生物化学杂志(Biochem.J.)316:695-696，AA9多肽之前被分类为糖苷水解酶家族61(GH61)。
AA9多肽通过具有纤维素分解活性的酶增强纤维素材料的水解。可以通过测量在以下条件下来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白包括50％-99.5％w/w纤维素分解酶蛋白和0.5％-50％w/w AA9多肽蛋白，在适合的温度(例如40℃-80℃，例如，50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)、和适合的pH(例如4-9，例如，4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、或8.5)下持续1-7天，与不具有纤维素分解增强活性的相等的总蛋白负载的对照水解(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)进行比较。
可以使用CELLUCLASTTM1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦德(Bagsvaerd)，丹麦)和β-葡糖苷酶的混合物作为纤维素分解活性的来源来测定AA9多肽增强活性，其中该β-葡糖苷酶是以纤维素酶蛋白负载的至少2％-5％蛋白的重量存在的。在一方面，该β-葡糖苷酶是米曲霉β-葡糖苷酶(例如，根据WO 02/095014，在米曲霉中重组产生的)。在另一方面，该β-葡糖苷酶是烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，如在WO 02/095014中描述的，在米曲霉中重组产生的)。
AA9多肽增强活性还可通过以下来确定：在40℃下，将AA9多肽与0.5％磷酸溶胀纤维素(PASC)、100mM乙酸钠(pH 5)、1mM MnSO4、0.1％没食子酸、0.025mg/ml的烟曲霉β-葡糖苷酶，以及0.01％X-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)一起孵育24-96小时，接着测定从PASC释放的葡萄糖。
还可以根据WO 2013/028928测定高温组合物的AA9多肽增强活性。
AA9多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指一种β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。可以根据文丘里(Venturi)等人，2002，基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66的程序，使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶被定义为25℃，pH 4.8下，在包含0.01％20的50mM柠檬酸钠中，从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指催化短β(1→4)-木寡糖的外切水解，以从非还原末端去除连续的D-木糖残基的β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)。可以在包含0.01％20的100mM柠檬酸钠中，在pH 5、40℃下，使用1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物确定β-木糖苷酶活性。将一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基酚根阴离子。
过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”意指过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC1.11.1.6)，该酶催化2H2O2转化为O2+2H2O。出于本发明的目的，根据美国专利号5,646,025确定过氧化氢酶活性。一个单位的过氧化氢酶活性等于在测定条件下催化1微摩尔的过氧化氢氧化的酶的量。
纤维二糖水解酶：该术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含有β-1,4-连接葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从而从链的还原性末端(纤维二糖水解酶I)或非还原性末端(纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167；泰里等人，1998，生物化学学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。可以根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279；范·帝伯赫(van Tilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)，149:152-156；范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶组合物或纤维素酶：术语“纤维素分解酶组合物”或“纤维素酶”意指水解纤维素材料的一种或多种(例如若干种)酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解酶活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解酶活性，以及(2)测量单独的纤维素分解酶活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所述的。可使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解酶活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定法是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)建立的(高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)59:257-68)。
可以通过测量在以下条件下，由一种或多种纤维素分解酶进行的纤维素材料水解期间，糖的产生/释放的增加来确定纤维素分解酶活性：1-50mg纤维素分解酶蛋白/g预处理的玉米秸秆(PCS)中的纤维素(或其他预处理的纤维素材料)，在适合的温度(例如40℃-80℃，例如，50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)，以及在适合的pH(例如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下持续3-7天，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比。典型条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固体(干重)，50mM乙酸钠(pH 5)，1mM MnSO4，50℃、55℃、或60℃，72小时，通过HPX-87H柱层析(伯乐实验室有限公司(Bio-RadLaboratories,Inc.)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州，美国)进行糖分析。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产生的次生细胞壁也包含多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴，或树的叶、枝、以及木材中。纤维素材料可以是，但不限于：农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸、和木材(包括林业废弃物)(参见例如维塞劳格尔(Wiselogel)等人，1995，生物乙醇手册(Handbook on Bioethanol)(查尔斯E.怀曼(Charles E.Wyman)，编著)中，第105-118页，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区；怀曼(Wyman)，1994，生物资源技术(Bioresource Technology)50:3-16；林德(Lynd)，1990，应用生物化学与生物技术(Applied Biochemistry and Biotechnology)24/25:695-719；马塞尔(Mosier)等人，1999，木质纤维素的生物转化的最近进展，生物化学工程/生物技术进展(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，斯卡皮尔(T.Scheper)，总编辑，第65卷，第23-40页，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，纽约)。在此应该理解的是，纤维素可以处于木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素、和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。在一方面，该纤维素材料是任何生物质材料。在另一方面，该纤维素材料是木质纤维素，该木质纤维素包括纤维素、半纤维素、以及木质素。
在一个实施例中，该纤维素材料是农业废弃物、草本材料(包括能源作物)、城市固体废物、纸浆和造纸厂废弃物、废纸或木材(包括林业废弃物)。
在另一实施例中，该纤维素材料是芦竹、甘蔗渣、竹子、玉米芯、玉米纤维、玉米秸秆、芒属、稻秸、柳枝稷或麦秸。
在另一实施例中，该纤维素材料是山杨、桉树、冷杉、松树、白杨、云杉或柳树。
在另一实施例中，该纤维素材料是海藻纤维素、细菌纤维素、棉短绒、滤纸、微晶纤维素(例如，)、或经磷酸处理的纤维素。
在另一实施例中，纤维素材料是一种水生生物质。如在此所用的，术语“水生生物质(Aquatic Biomass)”是指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理，如在此所描述。在一优选方面，对该纤维素材料进行预处理。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3-1,4葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及包含纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原性末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481)。还可以根据高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure and Appl.Chem.)59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物测定内切葡聚糖酶活性。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”是指水解半纤维素材料的一种或多种(例如，若干种)酶。参见例如，沙鲁姆(Shallom)和沙哈姆(Shoham)，2003，微生物学当前观点(Current Opinion In Microbiology)6(3):219-228)。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不局限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素是支链和直链多糖的异质性组，其可通过氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维相结合，交联成坚固的网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。在碳水化合物活性酶(CAZY)数据库中可得到这些酶以及碳水化合物活性酶的最翔实和更新的分类。可以根据高斯(Ghose)和比赛亚(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752，在适合的温度(例如40℃-80℃，例如，50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃)以及适合的pH(例如4-9，例如，5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0)下测量半纤维素分解酶活性。
预处理的玉米秸杆：术语“预处理的玉米秸杆”或“PCS”意指通过热和稀硫酸处理、碱预处理、中性预处理、或本领域已知的任何预处理从玉米秸杆得到的纤维素材料。
包含木聚糖的材料：术语“包含木聚糖的材料”意指包含包含β-(1-4)连接的木糖残基主链的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物，其通过短的碳水化合物链分支。它们包括D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，这些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以及D-葡萄糖构成。可以将木聚糖类型的多糖分成同源木聚糖(homoxylan)和异源木聚糖(heteroxylan)，包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯糖)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及复杂的异源木聚糖。参见，例如，埃伯林格罗瓦(Ebringerova)等人，2005，聚合物科学进展(Adv.Polym.Sci.)186:1-67。
在本发明的方法中，可以使用包含木聚糖的任何材料。在一优选方面，包含木聚糖的材料是纤维素材料。
木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解包含木聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总木聚糖分解活性，和(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。木聚糖分解酶的测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括别雷(Biely)和普查德(Puchard)，2006，食品与农业科学杂志(Journal of the Science ofFood and Agriculture)86(11):1636-1647；斯帕尼克娃(Spanikova)和别雷(Biely)，2006，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)580(19):4597-4601；赫尔曼(Herrimann)等人，1997，生物化学杂志(Biochemical Journal)321:375-381。
可以通过确定由不同类型的木聚糖，包括例如燕麦木聚糖、山毛榉木材木聚糖、和落叶松木材木聚糖形成的还原糖，或者通过光度确定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段，测量总木聚糖降解活性。一种常见的总木聚糖分解活性测定是基于由聚合4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如描述于别雷(Biely)等人，1992，用于木聚糖酶活性测定的多个实验室测试方法(Interlaboratory testing of methods for assay ofxylanase activity)，生物技术杂志(Journal of Biotechnology)23(3):257-270中。木聚糖酶活性还可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。将一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH 6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。
还可以通过测量在以下典型条件下由一种或多种木聚糖降解酶引起的桦木木聚糖(西格玛化学有限公司(Sigma Chemical Co.,Inc.)，圣路易斯，密苏里州，美国)水解的增加来确定木聚糖降解活性：1ml反应，5mg/ml底物(总固形物)，5mg的木聚糖分解蛋白/g的底物，50mM的乙酸钠(pH 5)，50℃，24小时，使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法的糖分析，如莱韦尔(Lever)，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279中所述的。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指一种1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。木聚糖酶活性可以在37℃下在0.01％X-100和200mM磷酸钠(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定。将一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下，在200mM磷酸钠(pH6)中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青蛋白。
木糖异构酶：术语“木糖异构酶”或“XI”意指可以在体内将D-木糖催化为D-木酮糖，并且在体外将D-葡萄糖转化为D-果糖的酶。木糖异构酶也称为“葡萄糖异构酶”，并且被分类为E.C.5.3.1.5。由于该酶的结构非常稳定，木糖异构酶是用于研究蛋白质结构和功能之间的关系的良好模型之一(芟牧(Karimaki)等人，蛋白质工程、设计与选择(Protein EngDes Sel)，12004,17(12):861-869)。此外，极其重要的工业应用价值使得木糖异构酶被视为重要的工业酶，如蛋白酶和淀粉酶(田申(Tian Shen)等人，微生物学通报(MicrobiologyBulletin)，2007,34(2):355-358；博萨莱(Bhosale)等人，微生物学评论(Microbiol Rev)，1996,60(2):280-300)。科学家保持高度关注并对木糖异构酶进行了广泛的研究。自20世纪70年代以来，木糖异构酶的应用已经集中在高果糖浆和燃料乙醇的生产。近年来，科学家已经发现在某些条件下，木糖异构酶可用于生产许多重要的稀有糖，它们是制药工业中的生产材料，例如核糖、甘露糖、阿拉伯糖和来苏糖(芟牧(Karlmaki)等人，蛋白质工程、设计与选择(Protein Eng Des Sel)12004,17(12):861-869)。这些发现为木糖异构酶的研究带来了新的活力。
本发明的方法
本发明还涉及生产乙醇的方法，该方法包括：
(a)用一种纤维素分解酶组合物使一种纤维素材料糖化；
(b)用发酵微生物发酵该经糖化的纤维素材料以生产乙醇；其中该发酵生物是酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)或一种具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物。
在一个优选的实施例中，该方法包括从发酵培养基中回收乙醇。
根据本发明的纤维素材料的加工可以使用本领域常规的方法来完成。此外，本发明的方法可以使用被配置成根据本发明来操作的任何常规生物质加工设备来实施。
分开或同时的糖化(即，水解)和发酵包括但不限于：分开水解和发酵(SHF)；同时糖化和发酵(SSF)；同时糖化和共发酵(SSCF)；杂合的水解和发酵(HHF)；分开水解和共发酵(SHCF)；杂合的水解和共发酵(HHCF)。
SHF使用分开的处理步骤，以首先将纤维素材料酶促水解为可发酵糖(例如，葡萄糖、纤维二糖、以及戊糖单体)，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中(菲利皮迪斯·G.P.(Philippidis,G.P.)，1996，纤维素生物转化技术(Cellulose bioconversion technology)，生物乙醇手册：生产和利用(Handbook on Bioethanol:Production and Utilization)，怀曼·C.E(Wyman,C.E.)编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团(Taylor&Francis)，华盛顿特区(Washington,DC)，179-212))。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩(Sheehan)和希默尔(Himmel)，1999，生物技术进展(Biotechnol.Prog.)15:817-827)。HHF涉及一个分开的水解步骤，并且另外涉及一个同时糖化和水解步骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高温酶糖化，随后在发酵生物耐受的更低温度下进行SSF。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶法水解(糖化)、发酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本发明的方法。
常规的装置可以包括一个分批补料搅拌反应器、一个批式搅拌反应器、一个具有超滤作用的连续流搅拌反应器、和/或一个连续活塞流柱式反应器(continuous plug-flowcolumn reactor)(德卡斯特胡斯克拉兹(de Castilhos Corazza)等人，2003，技术学报(Acta Scientiarum.Technology)25:33-38；古萨考瓦(Gusakov)和斯尼特森(Sinitsyn)，1985，酶学与微生物学技术(Enz.Microb.Technol.)7:346-352)，一个碾磨反应器(刘(Ryu)和李(Lee)，1983，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)25:53-65)。另外的反应器类型包括：用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层(upflow blanket)反应器、固定化反应器、以及挤出机型反应器。
预处理
在一个实施例中，在步骤(a)中的糖化之前对纤维素材料进行预处理。
在实践本发明的方法中，可以使用本领域中已知的任何预处理方法来破坏纤维素材料的植物细胞壁组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，生化工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:67-93；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2007，生化工程/生物技术进展，108:41-65；亨德里克斯(Hendriks)和塞曼(Zeeman)，2009，生物资源技术(Bioresource Technology)100:10-18；莫西尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术96:673-686；泰和拉德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi)，2008，分子科学国际杂志(Int.J.Mol.Sci.)9:1621-1651；杨(Yang)和怀曼，2008，生物燃料，生物产品和生物精制Biofpr.(Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。
在使用本领域已知的方法进行预处理之前，纤维素材料还可以经受颗粒粒度减小、筛分、预浸泡、湿润、洗涤和/或调理。
常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O、臭氧、离子液体以及γ辐射预处理。
在一个优选的实施例中，在糖化(即，水解)和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。预处理优选在水解前进行。可替代地，预处理可以与酶水解同时进行，以释放可发酵的糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。
蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素、和纤维素以使纤维素和其他级分，例如半纤维素可接近酶。纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。优选在140℃-250℃，例如160℃-200℃或170℃-190℃进行蒸汽预处理，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理的停留时间优选是1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4-10分钟，其中最适停留时间取决于温度和化学催化剂的任选添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的爆炸放料组合，这被称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和材料湍流，以通过破碎增加可及的表面积(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，生物资源技术(Bioresource Technology)855:1-33；盖博(Galbe)和小林(Zacchi)，2002，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)59:618-628；美国专利申请号2002/0164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙酰基被裂解，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上去除木质素。
化学预处理。术语“化学处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放的任何化学预处理。这种预处理可以将结晶纤维素转化为无定形纤维素。适合的化学预处理方法的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿法氧化、氨纤维/冷冻膨胀(AFEX)、氨渗滤(APR)、离子液体、以及有机溶剂预处理。
有时在蒸汽预处理之前添加化学催化剂，例如H2SO4或SO2(典型地是0.3％至5％w/w)，该催化剂减少时间并降低温度、增加回收率、并改进酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人，2006，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)129-132:496-508；瓦尔加(Varga)等人，2004，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)113-116:509-523；塞斯尼尔(Sassner)等人，2006，酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)39:756-762)。在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(典型地是H2SO4)和水混合，以形成浆料，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后闪变至大气压。可采用多种反应器设计来进行稀酸预处理，例如，活塞流反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(达夫(Duff)和默里(Murray)，1996，生物资源技术(BioresourceTechnology)855:1-33；谢尔(Schell)等人，2004，生物资源技术(BioresourceTechnology)91:179-188；李(Lee)等人，1999，生物化学工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.)65:93-115)。在一个具体实施例中，在180℃下使用4％w/w硫酸持续5分钟来进行纤维素材料的稀酸预处理。
还可以使用碱性条件下的若干种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗滤(APR)、以及氨纤维/冷冻膨胀(AFEX)预处理。
用氧化钙或氢氧化钙在温度85℃-150℃下进行石灰预处理，停留时间是从1小时至若干天(怀曼(Wyman)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96:1959-1966；莫西尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technology)，96:673-686)。WO2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900、和WO 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
湿氧化是典型地在添加如过氧化氢等氧化剂或过压的氧气、在180℃-200℃下进行5-15分钟的热预处理(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen)，1998，生物资源技术(Bioresource Technol.)64:139-151；帕隆恩(Palonen)等人，2004，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)117:1-17；瓦尔加(Varga)等人，2004，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)88:567-574；马丁(Martin)等人，2006，化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。预处理优选以1％-40％干物质，例如2％-30％干物质，或5％-20％干物质进行，并且由于添加碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。
被称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)的湿氧化预处理方法的修改方案能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理(WO 2006/032282)。
氨纤维膨胀(AFEX)涉及用液体或气体氨在适中的温度(例如90℃-150℃)和高压(例如17-20巴)处理纤维素材料，持续5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(戈拉帕里(Gollapalli)等人，2002，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)98:23-35；丘恩达瓦特(Chundawat)等人，2007，生物技术和生物工程(Biotechnol.Bioeng.)96:219-231；阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:1133-1141；泰莫里(Teymouri)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technol.)96:2014-2018)。在AFEX预处理期间，纤维素和半纤维素保持相对完整。木质素-碳水化合物复合物被裂解。
有机溶剂预处理可通过使用乙醇水溶液(40％-60％ethanol)在160℃-200℃下萃取30-60分钟使纤维素材料去木质化(潘(Pan)等人，2005，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)90:473-481；潘等人，2006，生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)94:851-861；酷比(Kurabi)等人，2005，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被去除。
适合的预处理方法的其他实例由谢尔(Schell)等人，2003，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)105-108:69-85，和马塞尔(Mosier)等人，2005，生物资源技术(Bioresource Technology)96:673-686，以及美国公开的申请号2002/0164730进行描述。
在一方面，化学预处理优选作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理进行。酸典型地是硫酸，但也可以使用其他酸，例如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或其混合物。优选在1-5，例如1-4或1-2.5的pH范围进行温和的酸处理。在一方面，酸浓度在优选从0.01至10wt.％酸的范围内，例如0.05至5wt.％酸或0.1至2wt.％酸。酸与纤维素材料接触，并且优选在温度140℃-200℃的范围内，例如165℃-190℃，进行1到60分钟范围的时间。
在另一方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选在10wt.％至80wt.％之间，例如20wt.％至70wt.％或30wt.％至60wt.％，如大约40wt.％的量存在。可以使用本领域已知的任何方法不洗涤或洗涤预处理的纤维素材料，例如用水洗涤。
机械预处理或物理预处理：术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒粒度减小的任何预处理。例如，这样的预处理可以涉及不同类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。
纤维素材料可以物理地(机械地)且化学地预处理。机械或物理预处理可以与蒸汽/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)、稀酸或弱酸处理、高温、高压处理、辐射(例如，微波福射)或其组合相结合。在一个方面，高压是指优选在约100至约400psi的范围内的压力，例如约150至约250psi。在另一方面，高温意指温度在约100℃至约300℃，例如约140℃至约200℃的范围内。在一优选方面，机械或物理预处理在分批过程中使用蒸汽枪水解器系统，例如从顺智公司(Sunds Defibrator AB)，瑞典可获得的顺智水解器(SundsHydrolyzer)来进行，该系统使用如上所定义的高压和高温。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。
因此，在一优选方面，使纤维素材料经受物理(机械)或化学预处理、或其任何组合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
生物预处理。术语“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质素的微生物和/或酶(参见，例如，舒T.-A.(Hsu,T.-A.)，1996，生物质的预处理(Pretreatmentof biomass)，生物乙醇手册：生产和利用(Handbook on Bioethanol:Production andUtilization)，怀曼C.E.(Wyman,C.E.)，编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团，华盛顿特区(Taylor&Francis,Washington,DC)，179-212；高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，应用微生物学进展(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333；麦克米兰·J.D.(McMillan,J.D.)，1994，预处理木质纤维素生物质：综述(Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，用于燃料生产的生物质的酶转化(in Enzymatic Conversion of Biomass for FuelsProduction)，希默尔·M.E.(Himmel,M.E.)，贝克·J.O.(Baker,J.O.)，以及奥弗伦·R.P.(Overend,R.P.)编辑，美国化学学会讨论会系列566(ACS Symposium Series 566)，美国化学学会，华盛顿特区(American Chemical Society,Washington,Dc)，第15章；贡·C.S.(Gong,C.S.)，卡奥·N.J.(Cao,N.J.)，杜·J.(Du,J.)，以及曹·G.T.(Tsao,G.T.)，1999，由可再生资源生产乙醇(Ethanol production from renewable resources)，生物化学工程/生物技术的进展(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，舍佩尔·T.(Scheper,T.)，编辑，施普林格出版社(Springer-Verlag)，柏林，海德堡，德国(BerlinHeidelberg,Germany)，65:207-241；奥尔森(Olsson)和哈恩-哈格达尔(Hahn-Hagerdal)，1996，酶与微生物技术(Enz.Microb.Tech.)18:312-331；以及瓦蓝德(Vallander)和埃里克松(Eriksson)，1990，生物化学工程/生物技术的进展(Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.)42:63-95)。
糖化
在糖化步骤(即，水解步骤)中，纤维素材料(例如预处理的)被水解，来分解纤维素和/或半纤维素为可发酵糖，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶寡糖。水解由纤维素分解酶组合物酶促进行。这些组合物的酶可以同时或顺序添加。
酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在适合的含水环境中进行。在一方面，水解在适合于一种或多种酶的活性，即，对于该一种或多种酶来说最佳的条件下进行。水解可以作为进料分批过程或连续过程进行，其中将纤维素材料逐渐进料至例如含酶的水解溶液中。
糖化通常在受控的pH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续高达200小时，但是典型地优选进行约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。温度优选在约25℃至约70℃，例如约30℃至约65℃、约40℃至约60℃、或约50℃至55℃的范围内。优选pH是在约3至约8的范围内，例如约3.5至约7、约4至约6、或约4.5至约5.5。干固体含量优选在约5至约50wt.％，例如，约10至约40wt.％或约20至约30wt.％的范围内。
使用纤维素分解酶组合物进行在步骤(a)中的糖化。这样的酶组合物在下面的“纤维素分解酶组合物”部分中进行了描述。这些纤维素分解酶组合物可以包括有用于降解纤维素材料的任何蛋白。在一方面，该纤维素分解酶组合物包括或进一步包括选自下组的一种或多种(例如，若干种)蛋白质，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9(GH61)多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
在另一方面，纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
在另一方面，半纤维素酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。在另一方面，氧化还原酶优选是一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：过氧化氢酶、漆酶、以及过氧化物酶。
在本发明的方法中使用的酶或酶组合物可以是以任何适于使用的形式存在的，例如像发酵液配制品或细胞组合物、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解物、半纯化或纯化的酶制剂、或作为酶的来源的宿主细胞。该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体、或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(例如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶制剂进行稳定化。
在一方面，纤维素分解或半纤维素分解酶组合物对于纤维素材料的有效量是约0.5mg至约50mg，例如，约0.5mg至约40mg、约0.5mg至约25mg、约0.75mg至约20mg、约0.75mg至约15mg、约0.5mg至约10mg、或约2.5mg至约10mg/g的该纤维素材料。
在一方面，将这样一种化合物以该化合物与纤维素的葡糖基单元的以下摩尔比：约10-6至约10，例如，约10-6至约7.5、约10-6至约5、约10-6至约2.5、约10-6至约1、约10-5至约1、约10-5至约10-1、约10-4至约10-1、约10-3至约10-1、或约10-3至约10-2添加。在另一方面，这样一种化合物的有效量是约0.1μM至约1M，例如约0.5μM至约0.75M、约0.75μM至约0.5M、约1μM至约0.25M、约1μM至约0.1M、约5μM至约50mM、约10μM至约25mM、约50μM至约25mM、约10μM至约10mM、约5μM至约5mM、或约0.1mM至约1mM。
术语“液体(liquor)”意指在如描述于WO 2012/021401中的条件下，由处理浆料中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如，木糖、阿拉伯糖、甘露糖等)所产生的溶液相(水相、有机相或其组合)、及其可溶性内容物。可以通过对木质纤维素或半纤维素材料(原料)加热和/或加压进行处理，任选地是在一种例如酸等催化剂存在下、任选地是在有机溶剂的存在下、和任选地与材料的物理破坏相结合，然后将溶液与残余固形物分离，来产生一种用于加强AA9多肽(GH61多肽)纤维分解的液体。在由纤维素分解酶制剂对纤维素底物的水解过程中，从液体与AA9多肽的组合中可得到纤维素分解增强的程度是由这类条件决定的。可以使用本领域的标准方法，例如过滤、沉淀或离心，而将液体与经过处理的材料进行分离。
在一方面，液体对于纤维素的有效量是约10-6至约10g/g的纤维素，例如，约10-6至约7.5g、约10-6至约5g、约10-6至约2.5g、约10-6至约1g、约10-5至约1g、约10-5至约10-1g、约10-4至约10-1g、约10-3至约10-1g、或约10-3至约10-2g/g的纤维素。
发酵
可以用一种或多种(例如若干种)能够直接或间接将糖发酵成希望的发酵产物的发酵微生物，对从水解的纤维素材料获得的可发酵糖进行发酵。“发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包括发酵步骤的任何方法。发酵方法还包括用于消费性醇工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如，发酵奶制品)、皮革工业、以及烟草工业的发酵方法。发酵条件取决于所希望的发酵产物和发酵生物，并且可以由本领域的普通技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，通过发酵有机体，例如酵母，作为预处理和酶水解步骤的结果，从纤维素材料释放的糖被发酵为产物，例如乙醇。水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。
在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的水解的纤维素材料。该材料一般是基于经济学，即，每当量糖势的成本，以及对酶致转变的难降解性而进行选择。
术语“发酵培养基”在此可理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及在同时糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。
本发明的发酵生物
在这个方面，本发明涉及能够将己糖和戊糖转化为乙醇的重组发酵生物。
在一个实施例中，本发明涉及具有与酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)的一样的特性的重组发酵生物，或具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物。
在一个实施例中，具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物具有一个或多个，例如所有的，以下特性：
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，相比BSGX001更高的木糖消耗，特别是如在实例3中所述；
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，相比BSGX001更高的葡萄糖消耗，特别是如在实例3中所述；
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，相比BSGX001更高的乙醇生产，特别是如在实例3中所述。
在一个实施例中，具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物，在实例3的方法条件下，即1g DCW/L、35℃、pH 5.5下，通过48小时发酵，提供完全的木糖消耗。
在一个实施例中，具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物，在实例3的方法条件下，即1g DCW/L、35℃、pH 5.5下，通过24小时发酵，提供完全的葡萄糖消耗。
在一个实施例中，具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物，在实例3的方法条件下，即1g DCW/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，提供多于30g/L乙醇，例如多于40g/L乙醇、例如多于45g/L乙醇、例如大约47g/L乙醇。
在一个优选的实施例中，该重组发酵生物是酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)。
在一个实施例中，本发明的发酵生物包括编码在US 8586336B2中的SEQ ID NO:2或在此SEQ ID NO:13中示出的具有木糖异构酶活性地氨基酸序列，或编码与在US8586336B2中的SEQ ID NO:2或在此SEQ ID NO:13的至少80％，例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％一致的氨基酸序列的基因。
在一个任选的实施例中，本发明的发酵生物包括一个戊糖转运基因，例如GFX基因，特别是来自中间假丝酵母的GFX1，例如，在SEQ ID NO:18中示出的序列。
在一个实施例中，包括在发酵生物中的戊糖转运基因具有与在此SEQ ID NO:18的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。
在一个实施例中，本发明的发酵生物过量表达木酮糖激酶基因(XKS)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
在一个实施例中，本发明的发酵生物过量表达核酮糖5磷酸3-差向异构酶基因(RPE1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
在一个实施例中，本发明的发酵生物过量表达核酮糖5磷酸异构酶基因(RKI1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
在一个实施例中，本发明的发酵生物过量表达转酮酶基因(TKL1)，并且过量表达转醛醇酶基因(TAL1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
在一个实施例中，本发明的发酵生物具有一个或多个，例如一个、两个、三个、四个、五个或所有，以下遗传修饰：
-从牛瘤胃液获得的木糖异构酶基因(Ru-XI)，特别是在此SEQ ID NO:20中示出的一个，编码在此SEQ ID NO:13中示出的木糖异构酶；
-任选地来自中间假丝酵母的一种戊糖转运基因(GXF1)，特别是在SEQ ID NO:18中示出的那一个；
-木酮糖激酶基因(XKS)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-核酮糖5磷酸3-差向异构酶基因(RPE1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-核酮糖5磷酸异构酶基因(RKI1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-转酮酶基因(TKL1)和转醛醇酶基因(TAL1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
例如，在一个实施例中，本发明发酵生物具有以下遗传修饰：
-从牛瘤胃液获得的木糖异构酶基因(Ru-XI)，特别是在此SEQ ID NO:20中示出的一个，编码在此SEQ ID NO:13中示出的木糖异构酶；
-木酮糖激酶基因(XKS)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-核酮糖5磷酸3-差向异构酶基因(RPE1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-核酮糖5磷酸异构酶基因(RKI1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-转酮酶基因(TKL1)和转醛醇酶基因(TAL1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
发酵刺激剂
发酵刺激剂可以用于在此所描述的本发明的方法中，以进一步改进发酵，并且特别是改进发酵生物的性能，例如速率增加和产物产率(例如，乙醇产率)。“发酵刺激剂”是指用于发酵生物(特别是酵母)生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆醇、对氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素A、B、C、D和E。参见例如，奥芬诺拉(Alfenore)等人，在补料分批方法过程中通过维生素补料策略改进乙醇生产和酿酒酵母的生存力(Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process)，施普林格出版社(Springer-Verlag)(2002)，将其通过引用结合在此。矿物质的实例包括可以供应营养素(包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu)的矿物质和矿物盐。
发酵产物
本发明的发酵产物是乙醇。
回收
可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基中回收发酵产物(即，乙醇)，该方法包括但不限于：层析法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏或萃取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得具有高达约96vol.％的纯度的乙醇，这可以用作例如燃料乙醇、饮用乙醇(即可饮用的中性烈酒)，或工业乙醇。
酶
以下部分说明了可以用于本发明的方法中的多肽、酶、和酶组合物。
纤维素分解酶组合物
根据本发明，纤维素分解酶组合物是在步骤(a)中的糖化过程中存在的或添加的。纤维素分解酶组合物是包含水解纤维素材料的一种或多种(例如若干种)酶的酶制剂。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、和/或其组合。
该纤维素分解酶组合物可以具有任何来源。在一个实施例中，纤维素分解酶组合物来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。在一个优选的实施例中，该纤维素分解酶制剂来源于里氏木霉的菌株。
该纤维素分解酶组合物可进一步包括以下多肽(例如酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的AA9多肽(GH61多肽)、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、CBH I、CBHII、或其两种、三种、四种、五种、或六种的混合物。
该另外的一种或多种多肽(例如，AA9多肽)和/或一种或多种酶(例如，β-葡糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶、CBH I和/或CBH II)对于该纤维素分解酶组合物生产生物(例如，里氏木霉)可以是外来的。
在一个实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的AA9多肽和一种β-葡糖苷酶。
在另一实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、一种β-葡糖苷酶、以及一种CBH I。
在另一实施例中，该纤维素分解酶制剂包括一种具有纤维素分解增强活性的AA9多肽、一种β-葡糖苷酶、一种CBH I以及一种CBH II。
其他酶(例如内切葡聚糖酶)，还可以包括在纤维素分解酶组合物中。
如以上提到的，该纤维素分解酶组合物可以包括多种不同的多肽，包括酶。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61A)多肽(例如，WO 2005/074656)，以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，披露于WO 2008/057637中的一种，特别是如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60中所示)。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61A)多肽(例如，在WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:4)，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO2011/041397或在此的SEQ ID NO:7中的一种，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO2011/041397中的一种，以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)，或披露于WO 2012/044915(通过引用结合在此)的一个变体，特别是包括一个或多个，例如所有的以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y的一个变体。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的AA9(GH61A)多肽，特别是来源于埃默森青霉菌(例如，在WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:7)的菌株，烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，在WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)变体(该变体具有一个或多个，特别是所有的下述取代：F100D、S283G、N456E、F512Y，并且披露于WO 2012/044915中)；烟曲霉Cel7A CBH1(例如，披露为WO2011/057140中的SEQ ID NO:6和在此的SEQ ID NO:10的一种)，以及烟曲霉CBH II(例如，披露为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18或在此的SEQID NO:11的一种)。
在一个优选的实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括半纤维素酶或半纤维素分解酶组合物，例如，烟曲霉木聚糖酶(例如，在此的SEQ ID NO:8)和烟曲霉β-木糖苷酶(例如，在此的SEQ ID NO:9)。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物还包括一种木聚糖酶(例如，来源于曲霉属的菌株，特别是棘孢曲霉或烟曲霉；或踝节菌属的菌株，特别是雷塞特纳斯踝节菌(Talaromyces leycettanus))和/或一种β-木糖苷酶(例如，来源于曲霉属，特别是烟曲霉，或踝节菌属的菌株，特别是埃默森踝节菌)。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61A)多肽(例如，WO 2005/074656或在此的SEQ ID NO:4)，米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，披露于WO 2008/057637中的一种，特别是如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60)，以及棘孢曲霉木聚糖酶(例如，在WO94/21785中的Xyl II或在此的SEQ ID NO:6)。
在另一实施例中，纤维素分解酶制剂包括一种里氏木霉纤维素分解制剂，进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，在WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:4)，烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ IDNO:2或在此的SEQ ID NO:5)，以及棘孢曲霉木聚糖酶(披露于WO 94/21785中的的Xyl II或在此的SEQ ID NO:6)。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61A)多肽(例如，在WO2005/074656中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:4)，烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)以及棘孢曲霉木聚糖酶(例如，披露于WO 94/21785中的Xyl II或在此的SEQ ID NO:6)。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是在WO 2011/041397或在此的SEQ ID NO:7中披露的一种，烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的EQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)和烟曲霉木聚糖酶(例如，在WO 2006/078256中的XylIII或在此的SEQ ID NO:8)。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO2011/041397或在此的SEQ ID NO:7中的一种，烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)，烟曲霉木聚糖酶(例如，在WO 2006/078256中的XylIII或在此的SEQ ID NO:8)，以及来自烟曲霉的CBH I，特别是披露为WO2011/057140中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:10的Cel7A CBH1。
在另一实施例中，纤维素分解酶包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO 2011/041397或在此的SEQ ID NO:7中的一种，烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)，烟曲霉木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的Xyl III或在此的SEQ ID NO:8)，来自烟曲霉的CBH I，特别是披露为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:10的Cel7A CBH1，以及来源于烟曲霉的CBH II，特别是披露为WO2013/028928中的SEQ ID NO:4或在此的SEQ ID NO:11的一种。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，进一步包括具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌AA9(GH61A)多肽，特别是披露于WO2011/041397或在此的SEQ ID NO:7中的一种，烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)或其变体(具有一个或多个，特别是所有的，以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y)；烟曲霉木聚糖酶(例如，在WO 2006/078256中的Xyl III或在此的SEQ ID NO:8)，来自烟曲霉的CBH I，特别是披露为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:10的Cel7A CBH I，以及来源于烟曲霉的CBH II，特别是披露于WO2013/028928或在此的SEQ ID NO:11中的一种。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括在此的SEQ ID NO:14的CBH I(GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293)；在此的SEQID NO:15的CBH II(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288)；在此的SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶变体(GENSEQP登录号AZU67153(WO 2012/44915))，特别是具有一种或多种，特别是所有的，以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y；以及在此的SEQ ID NO:7的AA9(GH61多肽)(GENSEQP登录号BAL61510(WO 2013/028912))。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括在此的SEQ ID NO:14的CBH I(GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293))；在此的SEQID NO:15的CBH II(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288)；在此的SEQ ID NO:16的GH10木聚糖酶(GENSEQP登录号BAK46118(WO 2013/019827))；以及在此的SEQ ID NO:17的β-木糖苷酶(GENSEQP登录号AZI04896(WO 2011/057140))。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括在此的SEQ ID NO:14的CBH I(GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293))；在此的SEQID NO:15的CBH II(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288))；以及在此的SEQ ID NO:7的AA9(GH61多肽)(GENSEQP登录号BAL61510(WO 2013/028912))。
在另一实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括在此的SEQ ID NO:14的CBH I(GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293))；在此的SEQID NO:15的CBH II(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288))，在此的SEQ ID NO:7的AA9(GH61多肽)(GENSEQP登录号BAL61510(WO 2013/028912))，以及在此的SEQ ID NO:19的过氧化氢酶(GENSEQP登录号BAC11005(WO 2012/130120))。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，包括在此的SEQ ID NO:14的CBH I(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288)；在此的SEQID NO:15的CBH II(GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288))，在此的SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶变体(GENSEQP登录号AZU67153(WO 2012/44915))，该变体具有一个或多个，特别是所有的，以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y；在此的SEQ ID NO:7的AA9(GH61多肽)(GENSEQP登录号BAL61510(WO 2013/028912))，在此的SEQ ID NO:16的GH10木聚糖酶(GENSEQP登录号BAK46118(WO 2013/019827))，以及在此的SEQ ID NO:17的β-木糖苷酶(GENSEQP登录号AZI04896(WO 2011/057140))。
在一个实施例中，纤维素分解组合物是一种里氏木霉纤维素分解酶制剂，包括在此的SEQ ID NO:21的EG I(Swissprot登录号P07981)，在此的SEQ ID NO:22的EG II(EMBL登录号M19373)，在此的SEQ ID NO:14的CBH I；在此的SEQ ID NO:15的CBH II；在此的SEQID NO:5的β-葡糖苷酶变体，该变体具有以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y；在此的SEQID NO:7的AA9(GH61多肽)，在此的SEQ ID NO:16的GH10木聚糖酶；以及在此的SEQ ID NO:17的β-木糖苷酶。
也考虑披露于WO 2013/028928中的所有的纤维素分解酶组合物并且通过引用结合在此。
该纤维素分解酶组合物包括或可以进一步包括选自下组的一种或多种(若干种)蛋白质，该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的AA9(即GH61)多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、以及膨胀素。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物是一种商业纤维素分解酶组合物。适合用于本发明的方法的商业纤维素分解酶组合物的实例包括：CTec(诺维信公司)、CTec2(诺维信公司)、CTec3(诺维信公司)、CELLUCLASTTM(诺维信公司)、SPEZYMETMCP(杰能科国际公司(Genencor Int.))、ACCELLERASETM1000、ACCELLERASE1500、ACCELLERASETMTRIO(杜邦公司(DuPont))、NL(DSM)；S/L 100(DSM)、ROHAMENTTM7069W(罗姆公司(GmbH))、或CMAX3TM(并矢国际公司(Dyadic International,Inc.))。可以按从约0.001wt.％至约5.0wt.％的固体，例如，约0.025wt.％至约4.0wt.％的固体、或约0.005wt.％至约2.0wt.％的固体的有效量添加纤维素分解酶组合物。
内切葡聚糖酶
在本发明的方法中使用的纤维素分解酶组合物可以包括任何来源的内切葡聚糖酶。
可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO 93/15186；美国专利申请号5,275,944；WO 96/02551；美国专利申请号5,536,655，WO 00/70031，WO 05/093050)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因(Gene)90:9-14)、嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)、以及嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因45:253-263，里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GenBank:M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)，里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GenBank:M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563，GenBank:AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:219-228，GenBank:Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究18:5884)；白曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(Current Genetics)27:435-439)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GenBank:L29381)；灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)内切葡聚糖酶(GenBank:AB003107)；热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GenBank:MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GenBank:XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS117.65内切葡聚糖酶；橙色嗜热子囊菌内切葡聚糖酶I(GenBank:AF487830)；里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GenBank:M15665)、嗜松青霉内切葡聚糖酶(WO 2012/062220)；以及(WO 2013/019780)。
在一个实施例中，该内切葡聚糖酶，例如来源于里氏木霉的一种或其同系物，选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种内切葡聚糖酶(EG)，包括在此的SEQ ID NO:21的成熟多肽；
(ii)一种内切葡聚糖酶(EG)的氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:21的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在一个实施例中，该内切葡聚糖酶，例如来源于里氏木霉的一种或其同系物，选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种内切葡聚糖酶(EG)，包括在此的SEQ ID NO:22的成熟多肽；
(ii)一种内切葡聚糖酶(EG)的氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:22的成熟多肽具有至少60％，例如至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
具有纤维素分解增强活性的AA9(即，GH61)多肽
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解酶组合物可以包括一种或多种具有纤维素分解增强活性的AA9(GH61)多肽。在本发明的方法中使用的纤维素分解酶组合物可以包括一种任何来源的AA9(GH61)多肽。
在本发明的方法中有用的AA9多肽的实例包括但不限于来自于以下各项的AA9多肽：土生梭孢壳霉(WO 2005/074647、WO 2008/148131和WO 2011/035027)、橙色嗜热子囊菌(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、里氏木霉(WO 2007/089290和WO 2012/149344)、嗜热毁丝霉(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868及WO2009/033071)、烟曲霉(WO 2010/138754)、嗜松青霉(WO 2011/005867)、嗜热子嚢菌属(WO2011/039319)、青霉菌属(埃默森青霉菌)(WO 2011/041397和WO 2012/000892)、甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO 2011/041504)、棘孢曲霉(WO 2012/125925)、疏棉状嗜热丝孢菌(WO 2012/113340、WO 2012/129699、WO 2012/130964及WO 2012/129699)、Aurantiporus alborubescens(WO 2012/122477)、褐孢长毛盘菌(WO 2012/122477)、托姆青霉(WO 2012/122477)、柄踝节菌(WO 2012/135659)、特异腐质霉(WO 2012/146171)、樟绒枝霉(WO 2012/101206)、Talaromyces leycettanus(WO 2012/101206)、以及嗜热毛壳菌(WO 2012/101206)和嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(WO 2012/129697和WO2012/130950)。
在一方面，AA9多肽在根据WO 2008/151043的可溶性活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下使用。
在另一方面，AA9多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料(如预处理的玉米秸杆)获得的液体的存在下使用(WO 2012/021394、WO 2012/021395、WO 2012/021396、WO 2012/021399、WO 2012/021400、WO 2012/021401、WO 2012/021408、以及WO 2012/021410)。
在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的AA9(GH61)多肽，例如来源于嗜热子嚢菌属的，例如橙色嗜热子囊菌的菌株，例如在WO2005/074656描述为SEQ ID NO:2，或在此的SEQ ID NO:4的；或来源于梭孢壳菌属的，例如土生梭孢壳的菌株，例如在WO 2005/074647描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、和在此的SEQ ID NO:2的；或来源于曲霉属的菌株的，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2010/138754描述为SEQ ID NO:2；或来源于源于青霉属的菌株的，例如埃默森青霉菌的菌株，例如WO2011/041397中披露的或此处的SEQ ID NO:7的。
在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌AA9(GH61)多肽或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，包括在此的SEQ ID NO:4的成熟多肽；
(ii)一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一实施例中，具有纤维素分解增强活性的青霉属AA9(GH61)多肽或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，包括在此的SEQ ID NO:7的成熟多肽；
(ii)一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
β-葡糖苷酶
根据本发明，β-葡糖苷酶可以存在于和/或添加到糖化步骤(a)中。在本发明的方法中使用的纤维素分解酶组合物可以包括任何来源的β-葡糖苷酶。
在本发明中有用的β-葡糖苷酶的实例包括但不限于，来自以下各项的β-葡糖苷酶：棘孢曲霉(川口(Kawaguchi)等人，1996，基因(Gene)173:287-288)、烟曲霉(WO 2005/047499)、黑曲霉(丹(Dan)等人，2000，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，275:4973-4980)、米曲霉(WO 02/095014)、巴西青霉菌IBT 20888(WO 2007/019442和WO 2010/088387)、土生梭孢壳霉(WO 2011/035029)、以及褐孢长毛盘菌(WO 2007/019442)。
在一个实施例中，该β-葡糖苷酶可以是来源于曲霉属的菌株的一种，例如黑曲霉或米曲霉，例如披露于WO 2002/095014中的一种或具有β-葡糖苷酶活性的在WO 2008/057637中披露为SEQ ID NO:59和EQ ID NO:60的融合蛋白，或烟曲霉，例如披露于WO 2005/047499或在此的SEQ ID NO:5中的一种，或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如披露于WO 2012/044915中的一种，例如具有以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y的一种(使用在此的SEQID NO:5用于编号)。
在另一实施例中，该β-葡糖苷酶来源于青霉属的菌株，例如披露于WO 2007/019442中的巴西青霉菌的菌株，或木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶是一种选自下组的烟曲霉β-葡糖苷酶或其同系物，该组由以下各项组成：
(i)一种β-葡糖苷酶，包括在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽；
(ii)一种β-葡糖苷酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶是一个变体，该变体在对应于在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽的位置100、283、456以及512的一个或多个(若干个)位置处包括取代，其中该变体具有β-葡糖苷酶活性。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶是以下各项的一个变体：(a)包括在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽；(b)具有与在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽至少80％序列一致性的多肽，或(c)在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽的具有β-葡糖苷酶活性的片段。
在一个实施例中，该β-葡糖苷酶变体与在此的SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％序列一致性。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株，例如烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，在此的SEQ ID NO:5中示出)，它包括一个或多个选自下组的取代，该组由以下各项组成：L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E、和F512Y；例如一种具有以下取代的其变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
在一个实施例中，取代的数目在1与10之间，例如1与8之间，例如1与6之间，例如1与4之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。
在一个实施例中，变体在对应于位置100的位置处包括取代、在对应于位置283的位置处包括取代、在对应于位置456的位置处包括取代和/或在对应于位置512的位置处包括取代。
在一个优选的实施例中，该β-葡糖苷酶变体包括以下取代：在此SEQ ID NO:5中的Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。
纤维二糖水解酶
在本发明的方法中使用的纤维素分解酶组合物可以包括任何来源的纤维二糖水解酶，例如CBH I和/或CBH II。
在本发明中有用的的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于：棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2011/059740)、烟曲霉纤维二糖水解酶I(WO 2013/028928)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(WO 2013/028928)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II(WO 2009/042871)、奥斯塔尼青霉(Penicillium occitanis)纤维二糖水解酶I(GenBank:AY690482)、埃默森踝节菌纤维二糖水解酶I(GenBank:AF439936)、赫卡尼亚梭孢壳霉(Thielavia hyrcanie)纤维二糖水解酶II(WO 2010/141325)、土生梭孢壳霉纤维二糖水解酶II(CEL6A，WO 2006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、以及褐孢长毛盘菌纤维二糖水解酶II(WO 2010/057086)。
纤维二糖水解酶I。
纤维二糖水解酶I
在一个实施例中，在本发明的方法中使用的纤维素分解酶组合物可以包括一种或多种CBH I(纤维二糖水解酶I)。在一个实施例中，该纤维素分解酶组合物包括纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如来源于曲霉属的菌株的一种，例如烟曲霉的菌株，例如披露于在WO2011/057140中的SEQ ID NO:6或在此的SEQ ID NO:10的Cel7A CBH I；木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；或踝节菌属的菌株，例如雷塞特纳斯踝节菌(Talaromyces leycettanus)的菌株，优选地是在此的SEQ ID NO:14中示出的一种或GENSEQP登录号AZY49536(WO 2012/103293)。
在一个实施例中，该烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种纤维二糖水解酶I，包括在此的SEQ ID NO:10的成熟多肽；
(ii)一种维二糖水解酶I，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ IDNO:10的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在另一实施例中，该纤维二糖水解酶I，例如，来源于雷塞特纳斯踝节菌(Talaromyces leycettanus)的菌株的一种，选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种纤维二糖水解酶I，包括在此的SEQ ID NO:14的成熟多肽；
(ii)一种维二糖水解酶I，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ IDNO:14的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
纤维二糖水解酶II
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解酶组合物可以包括一种或多种CBH II(纤维二糖水解酶II)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II(CBHII)，例如来源于曲霉属的菌株的一种，例如烟曲霉的菌株，例如在此的SEQ ID NO:11中的一种或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳菌属的菌株，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A；或踝节菌属的菌株，例如雷塞特纳斯踝节菌(Talaromyces leycettanus)的菌株，优选地是在此的SEQ ID NO:15中示出的一种或GENSEQP登录号AZY49446(WO 2012/103288)。
在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同系物选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种纤维二糖水解酶II，包括在此的SEQ ID NO:11的成熟多肽；
(ii)一种纤维二糖水解酶II，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQID NO:11的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性。
在另一实施例中，该纤维二糖水解酶II，例如，来源于雷塞特纳斯踝节菌(Talaromyces leycettanus)的菌株的一种，选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种纤维二糖水解酶II，包括在此的SEQ ID NO:15的成熟多肽；
(ii)一种纤维二糖水解酶II，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQID NO:15的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
半纤维素酶
根据本发明，半纤维素酶可以是在步骤(a)中的糖化过程中存在的和/或添加的。该半纤维素酶可以呈半纤维素分解酶组合物的形式。该半纤维素酶可以是任何起源的，但优选真菌或细菌起源的。
术语“半纤维素酶”或“半纤维素分解酶”意指一种或多种(若干种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如，沙勒姆(Shallom)和肖汉姆(Shoham)，2003，微生物半纤维素酶(Microbial hemicellulases.)微生物学当前观点(Current Opinion In Microbiology)，6(3):219-228。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以通过数字进行标记而被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)数据库中获得。可以根据高斯(Ghose)和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752来测量半纤维素分解酶活性。
在一个实施例中，在糖化过程中存在和/或添加的半纤维素酶是半纤维素分解酶组合物。在一个实施例中，该半纤维素分解酶组合物是来自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，进一步包括木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。在一个优选的实施例中，该半纤维素分解酶组合物是来自里氏木霉的纤维素分解酶组合物，进一步包括烟曲霉木聚糖酶(在此的SEQ IDNO:8中示出的XYL III)和烟曲霉β-木糖苷酶(在此的SEQ ID NO:9)。
优选地，可以0.01mg EP/g和20mg EP/g纤维素之间，例如0.1mg EP/g-1mg EP/g纤维素的浓度添加半纤维素酶或半纤维素分解酶制剂。
木聚糖酶
在一个优选的实施例中，该半纤维素酶是木聚糖酶或半纤维素分解酶组合物包括木聚糖酶。术语“木聚糖酶”意指一种1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。出于本发明的目的，在37℃下，在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来确定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃、pH 6下在200mM磷酸钠(pH6)缓冲液中从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖每分钟产生1.0μ摩尔天青蛋白。
在本发明的方法中有用的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下各项的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(WO 2006/078256)、嗜松青霉(WO2011/041405)、青霉菌属(WO 2010/126772)、疏棉状嗜热丝孢菌(GeneSeqP:BAA22485)、嗜热踝节菌属(GeneSeqP:BAA22834)、土生梭孢壳霉NRRL 8126(WO 2009/079210)、和褐孢长毛盘菌(WO 2011/057083)。
特别考虑到的木聚糖酶的实例包括GH10木聚糖酶，例如来源于曲霉属的菌株的一种，例如来自烟曲霉的菌株的，例如在WO 2006/078256中披露为Xyl III的一种，或来自棘孢曲霉的菌株的，例如在WO 94/21785中披露为SEQ ID NO:5(Xyl II)的一种。
木聚糖酶可以包括在一种纤维素分解酶制剂(其进一步包括一种木聚糖酶)中。在一个实施例中，半纤维素酶是一种纤维素分解酶制剂，该制剂进一步包括一种木聚糖酶，优选地是一种GH10木聚糖酶，例如来源于曲霉属的菌株的一种，例如来自烟曲霉的菌株的，例如在WO 2006/078256中披露为Xyl III的一种，或来自棘孢曲霉的菌株的，例如在WO 94/21785中披露为SEQ ID NO:5(Xyl II)或在此的SEQ ID NO:6的一种。
在一个实施例中，木聚糖酶来源于棘孢曲霉，例如示于在此的SEQ ID NO:6中的一种木聚糖酶。在一个优选的实施例中，木聚糖酶来源于烟曲霉，例如示于在此的SEQ ID NO:8中的一种木聚糖酶。
考虑到的木聚糖酶还包括包含与WO 2006/078256中的如在此的SEQ ID NO:8所示的烟曲霉木聚糖酶或WO 94/21785中披露为SEQ ID NO:5(Xyl II)的或在此的SEQ ID NO:6的棘孢曲霉木聚糖酶具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性，至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列的那些。
在一个实施例中，该木聚糖酶，例如，来源于雷塞特纳斯踝节菌(Talaromycesleycettanus)的菌株，包括在纤维素分解酶组合物中，具有与在此的SEQ ID NO:16具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性、至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列。
β-木糖苷酶
在一个优选的实施例中，用于本发明的方法中的半纤维素酶是一种β-木糖苷酶，或该半纤维素分解酶组合物包括一种β-木糖苷酶。术语“β-木糖苷酶”意指β-D-木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)-木寡糖的外切水解，以从非还原末端去除连续的D-木糖残基。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下在包含0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
在本发明的方法中有用的β-木糖苷酶包括但不限于来自以下各项的β-木糖苷酶：粗糙脉孢菌(SwissProt:Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL:Q92458)、埃默森踝节菌(SwissProt:Q8X212)、以及嗜热踝节菌(GeneSeqP:BAA22816)。
特别考虑到的β-木糖苷酶的实例包括来源于曲霉属的菌株的一种β-木糖苷酶，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2013/028928(实例16和17)或在此的SEQ ID NO:9中披露的一种，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如在WO 2011/057140中的SEQ ID NO:58或在此的SEQ ID NO:1的成熟多肽。
用于本发明的方法中的β-木糖苷酶可以包括在一种纤维素分解酶组合物中。在一个实施例中，该半纤维素酶是一种纤维素分解酶组合物；例如里氏木霉纤维素分解酶组合物；进一步包括一种β-木糖苷酶，例如来源于曲霉属的菌株的一种β-木糖苷酶，例如烟曲霉的菌株(例如，在WO 2011/057140或在此的SEQ ID NO:9中披露的一种)，例如在WO 2013/028928(实例16和17)中披露的一种，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如在WO 2011/057140中的SEQ ID NO:58的成熟多肽。
考虑到的β-木糖苷酶还包括包含与WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:206的烟曲霉β-木糖苷酶或在此的SEQ ID NO:9或在此提到的β-木糖苷酶中的任一种具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性，至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列的那些。
在一个实施例中，该β-木糖苷酶，例如，来源于埃默森踝节菌的菌株，包括在纤维素分解酶组合物中，具有与在此的SEQ ID NO:17具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性，至少97％、至少98％、至少99％一致性的氨基酸序列。
用于本发明的方法中的半纤维素酶可以包括一种商业半纤维素酶产品。商业半纤维素酶产品的实例包括：例如SHEARZYMETM(诺维信公司)、CELLICTMHTec(诺维信公司)、CELLICTMHTec2(诺维信公司)、CELLICTMHTec3(诺维信公司)、(诺维信公司)、(诺维信公司)、HC(诺维信公司)、木聚糖酶(杰能科)、TX-200A(AB酶(AB Enzymes))、HSP 6000木聚糖酶(帝斯曼(DSM))、DEPOLTM333P(生物催化剂有限公司(Biocatalysts Limit)，英国威尔士(Wales,UK))、DEPOLTM740L。(生物催化剂有限公司，英国威尔士)以及DEPOLTM762P(生物催化剂有限公司，英国威尔士)。
过氧化氢酶
该纤维素分解酶组合物可以包括一种过氧化氢酶。该过氧化氢酶可以是任何过氧化氢酶。该过氧化氢酶可以包括，但不限于E.C.1.11.1.6或E.C.1.11.1.21过氧化氢酶。
有用的过氧化氢酶的实例包括但不限于来自以下各项的过氧化氢酶：海水产碱杆菌(Alcaligenes aquamarinus)(WO 98/00526)、兰图鲁斯曲霉(Aspergillus lentilus)、烟曲霉、黑曲霉(美国专利号5,360,901)、米曲霉(JP 2002223772A；美国专利号6,022,721)、嗜热葡糖苷酶芽孢杆菌(JP 11243961A)、特异腐质霉(WO 2009/104622，WO 2012/130120)、樟绒枝霉、变黑微颤菌(WO 98/00526)、粗糙脉孢菌、埃默森青霉菌(WO 2012/130120)、嗜松青霉、微小根毛霉、巴斯德酵母(WO 2007/105350)、嗜热柱顶孢霉、柄状踝节菌(WO 2012/130120)、橙色嗜热子囊菌(WO 2012/130120)、布氏栖热菌(Thermusbrockianus)(WO 2005/044994)、和土生梭孢壳霉(WO 2010/074972)。
有用的过氧化氢酶的非限制性实例是来自以下各项的过氧化氢酶：专性嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)(UNIPROT：P30266)、枯草芽孢杆菌(UNIPROT：P42234)、灰腐质霉(GeneSeqP：AXQ55105)、费希新萨托菌(UNIPROT：A1DJU9)、埃默森青霉(GeneSeqP：BAC10987)、嗜松青霉(GeneSeqP：BAC10995)、嗜热柱顶孢霉(GeneSeqP：AAW06109或ADT89624)、柄状踝节菌(GeneSeqP：BAC10983或BAC11039；UNIPROT：B8MT74)以及橙色嗜热子囊菌(GeneSeqP：BAC11005)。将登录号以其全部内容结合在此。
在一个优选的实施例中，该纤维素分解酶组合物可以包括一种过氧化氢酶，例如，来源于嗜热子嚢菌属的一种，特别是橙色嗜热子囊菌，特别是在WO 2012/130120或在此的SEQ ID NO:19中示出的一种。
在一个实施例中，该过氧化氢酶，例如，来自橙色嗜热子囊菌的菌株的一种过氧化氢酶，选自下组，该组由以下各项组成：
(i)一种过氧化氢酶，包括在此的SEQ ID NO:19的成熟多肽；
(ii)一种过氧化氢酶，包括以下氨基酸序列，该氨基酸序列与在此的SEQ ID NO:19的成熟多肽具有至少60％、至少70％，例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列一致性。
在糖化/水解反应中，过氧化氢酶的蛋白含量处于约0.5％至约10％，例如，约0.5％至约7％、约0.5％至约5％、约0.5％至约4％、约0.5％至约3％、约0.5％至约2％、以及约0.5％至约1％的总酶蛋白的范围内。
在一个实施例中，过氧化氢酶与纤维素分解酶组合物的蛋白比处于约1:200至约1:10，例如，约1:100至约1:15或约1:50至约1:25的范围内。
通过以下实例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。
材料&方法
材料：
纤维素分解酶组合物CA(“CA”)：来源于里氏木霉的纤维素分解酶制剂，进一步包括具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(该多肽来源于埃默森青霉菌菌株(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:7))、披露于WO 2012/044915中的烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:5)变体F100D、S283G、N456E、F512Y；WO2011/057140中披露为SEQ ID NO:6的和此处SEQ ID NO:10中的烟曲霉Cel7A CBH1以及WO 2011/057140中披露为SEQ ID NO:18的和在此的SEQ ID NO:11的烟曲霉CBH II。此外，纤维素分解酶制剂CA进一步包含一种来自里氏木霉的10％的纤维素分解酶制剂，进一步包括烟曲霉木聚糖酶(在此的SEQ ID NO:8)和烟曲霉β-木糖苷酶(在此的SEQ ID NO:9)。
纤维素分解酶组合物CB(“CB”)：里氏木霉纤维素分解酶制剂包括以下各项：在此的SEQ ID NO:21的EG I、在此的SEQ ID NO:22的EG II、在此的SEQ ID NO:14的CBH I；在此的SEQ ID NO:15的CBH II；在此的SEQ ID NO:5的β-葡糖苷酶变体，该变体具有以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y；在此的SEQ ID NO:7的AA9(GH61多肽)、在此的SEQ ID NO:16中的GH10木聚糖酶；以及在此的SEQ ID NO:17的β-木糖苷酶。
CIBTS1260：根据布达佩斯条约，由诺维信公司(Novozymes A/S)，在农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)，北大学街(North University Street)1815号，皮奥瑞亚(Peoria)，伊利诺伊州(Illinois)61604，美国)保藏了酿酒酵母酵母菌，并且给出以下登录号：
保藏 登录号 保藏日期
CIBTS1260 NRRL Y-50973 2014年9月5日
BSGX001披露于美国专利号8,586,336-B2(通过引用结合在此)中，并且被构建如下：用载体pJFE3-RuXI转化宿主酿酒酵母菌株BSPX042(表型：ura3-251，XKS1过量表达；RPE1、RKI1、TAL1、和TKL1过量表达，它们是在PPP中的基因；醛糖还原酶基因GRE3的敲除；以及适应进化后通过缺失基因COX4，电子传递呼吸链的损伤)，该载体插入有木糖异构酶基因(在美国专利号8,586,336-B2中的SEQ ID NO:1或在此的SEQ ID NO:20)，该木糖异构酶基因编码在美国专利号8,586,336-B2中的SEQ ID NO:2或在此的SEQ ID NO:13中示出的RuXI。
方法：
一致性
两个氨基酸序列之间或两个多核苷酸序列之间的相关性由参数“一致性”来描述。
出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的一致性程度是通过Clustal方法(希金斯(Higgins)，1989，CABIOS 5:151-153)来确定，其中使用具有一致性表(identity table)的LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)和以下多重比对参数：缺口罚分10和缺口长度罚分10。成对比对参数是：K元组(Ktuple)＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5，并且对角线＝5。
出于本发明的目的，两个多核苷酸序列之间的一致性程度是通过威尔伯-李普曼(Wilbur-Lipman)方法(威尔伯(Wilbur)和李普曼(Lipman)，1983，美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Science USA)80:726-730)来确定，其中使用具有一致性表(identity table)的LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)和以下多重比对参数：缺口罚分10和缺口长度罚分10。成对比对参数是：K元组＝3，缺口罚分＝3和窗口＝20。
在此描述并且要求保护的本发明不局限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面预期处于本发明的范围之内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，对于本领域普通技术人员而言本发明的不同修改将从前述描述变得清楚。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在发生冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
实例
实例1
菌株CIBTS1000的构建.
鉴定出是已知从葡萄糖的有效的乙醇生产者的二倍体酿酒酵母菌株。使用来自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的酿酒酵母菌株CCTCC M94055。
从表示供体生物体是未知的宏基因组学项目克隆了称为mgXI的木糖异构酶。此木糖异构酶的分离和特征描述于中国专利申请号102174549A或美国专利公开号2012/0225452中。
使用标准方法从中间假丝酵母克隆称为GXF的戊糖转运体。此木糖转运体由D.兰奎斯特(D.Runquist)等人.(兰奎斯特D.(Runquist D)，方西卡C(Fonseca C)，瑞德托姆P(Radstrom P)，斯宾塞-马丁I(Spencer-Martins I)，汗-哈格戴B(Hahn-B)：“来自中间假丝酵母的Gxf1转运体的表达改进了利用重组木糖的酿酒酵母的发酵性能”(“Expression of the Gxf1transporter from Candida intermedia improvesfermentation performance in recombinant xylose-utilizing Saccharomycescerevisiae”).应用微生物学与生物技术(Appl Microbiol Biotechnol)2009,82:123-130)进行了描述。
使用标准方法将木糖异构酶基因与来自酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶(TPI)启动子和TPI终止子融合，使得木糖异构酶在酿酒酵母中的表达由TPI表达信号控制。
以相同的方式将该GXF基因与该TPI表达信号融合。
插入大肠杆菌克隆载体的这两种表达盒包含：
·保证该质粒可在大肠杆菌中增殖的大肠杆菌colE1复制起点。
·来自酿酒酵母的一个δ(δ)序列片段。
·一种来自印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的博来霉素抗性标记，用于博来霉素抗性的大肠杆菌或酿酒酵母转化体的选择。将双启动子与博来霉素基因的5’端融合，该博来霉素基因由酿酒酵母翻译延长因子(TEF1)启动子和大肠杆菌Em7启动子组成。向博来霉素基因的3’端添加酿酒酵母CYC1终止子。整个博来霉素表达盒侧翼有loxP位点以能够通过Cre-lox重组来使该表达盒缺失(B.萨奥尔(B.Sauer)：“酵母菌酿酒酵母中的Cre-lox位点特异性重组系统的功能性表达”(“Functional expression ofthe Cre-Lox site specific recombination system in the yeast Saccharomycescerevisiae.”)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)1987,7:2087-2096)。
该木糖异构酶/戊糖转运体表达质粒被称为pYIE2-mgXI-GXF1-δ，并且在图1中示出。
该质粒pYIE2-mgXI-GXF1-δ最初由XhoI消化来线性化，然后转化为亲本菌株酿酒酵母CCTCC M94055，随后选择博来霉素抗性转化体。分离具有整合到δ序列中的质粒的称为CIBTS0912的菌株。然后通过瞬时CRE重组酶表达来缺失位于两个loxP位点之间的博来霉素抗性盒，生成菌株CIBTS0914。
实现的该瞬时CRE重组酶表达类似于由普瑞(Prein)等人(普瑞B(Prein B)，耐特K(Natter K)，考文SD(Kohlwein SD).“用于在酵母酿酒酵母中构建绿色荧光蛋白的N-末端染色体融合的新策略”(“A novel strategy for constructing N-terminal chromosomalfusions to green fluorescent protein in the yeast Saccharomyces cerevisiae”).欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)2000:485,29-34.)描述的酵母菌标准方法，用一种不稳定的质粒表达该CRE重组酶来转化，随后再次固化那一质粒。在这项工作中，酵母菌标准载体pSH47的卡那霉素基因被潮霉素抗性标记替代，使得使用潮霉素的选择，而不是选择卡那霉素抗性。使用pSH47-hyg的质粒的质粒图在图2中示出。
再次用XhoI消化的pYIE2-mgXI-GXF1-δ转化菌株CIBTS0914，以增加两个表达盒的拷贝数，并且选择博来霉素抗性菌株CIBTS0916。
为了过量表达戊糖磷酸途径的基因，装配容纳经选择的戊糖磷酸途径的基因的表达质粒。
选择用于过量表达的基因是：
1.木酮糖激酶(XKS1)。
2.转醛醇酶(TAL1)。
3.核酮糖5磷酸差向异构酶(RPE1)。
4.转酮酶(TKL1)。
5.核糖5磷酸异构酶(RKI1)
除了这些基因之外，被loxP位点包围的KanMX选择盒被包括作为大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体pUG6的一部分(盖登纳U(Güldener U)，海克S(Heck S)，菲尔德T(Fielder T)，贝霍尔J(Beinhauer J)，黑格曼JH.(Hegemann Jh.)用于芽殖酵母中重复使用的一种新的有效的基因破坏盒(“A new efficient gene disruption cassette for repeated usein budding yeast.”)NAR 1996,24:2519-24)。
生成的质粒pYIE2-XKS1-PPP-δ的图在图3中示出。使用列出遗传要素的表如下所示：
将质粒pYIE2-XKS1-PPP-δ用NotI消化，并且通过琼脂糖凝胶电泳去除这些载体元件。然后将包含所有表达盒的线性片段转化到CIBTS0916中，用于双重同源重组，随后选择卡那霉素(G418)抗性。选择卡那霉素抗性菌落，并且称为CIBTS0931。
CIBTS0931包含博来霉素选择标记和卡那霉素选择标记二者。它们二者的侧翼都具有loxP重组位点。
为了去除博来霉素和卡那霉素抗性标记，用附加体质粒pSH47-hygs再次转化该菌株，并且在包含潮霉素的平板上选择转化体。随后，进行针对已经失去博来霉素和卡那霉素抗性的转化体的筛选，并且在此之后，进行针对也失去潮霉素抗性标记的菌株的筛选。选择菌株CIBTS1000，并且示出已经失去质粒pSH47-hyg。
实例2
菌株CIBTS1000对高木糖摄取和乙酸盐抗性的适应。
修饰该菌株CIBTS1000，使得它可以利用木糖作为碳源，并且将其发酵为乙醇。然而，该木糖利用是非常低效的。改进代谢工程领域中的那个问题的一种熟知方式是使用适应。在这种情况下也是这样进行的。在包含木糖作为唯一碳源和已知存在于纤维素生物质水解产物中的酵母生长抑制剂的培养基中，将菌株CIBTS1000从摇瓶连续转移至摇瓶。在这些连续转移中累积突变，使得菌株在所提供的条件下更好地生长-并且由此更好地利用木糖。
在第一轮适应中，使用YPX培养基(10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、和20g/l木糖)和YPDX(10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、10g/l葡萄糖、和10g/l木糖)，将CIBTS1000在摇瓶系统中连续转移。
在适应的第二轮中，在YPXI(补充有43mM甲酸钠、50mM乙酸钠、和100mM硫酸钠的YPX)和YPDXI(补充有43mM甲酸钠、50mM乙酸钠、和100mM硫酸钠的YPDX)中进行连续转移。
在适应的最后一轮中，使补充有10g/l酵母菌提取物、20g/l蛋白胨、10g/l葡萄糖和10g/l木糖的NREL稀酸预处理的玉米秸秆水解产物(参见实例3)来进行连续转移。
选择名为CIBTS1260-J132-F3的菌株作为适应的菌株。
实例3
在NREL稀酸预处理的玉米秸秆水解产物中的CIBTS1260和BSGX001的发酵比较
将两种酿酒酵母菌株(CIBTS1260和BSGX001)在NREL稀酸预处理的玉米秸秆水解产物(4％w/w硫酸，在180℃下持续5分钟)中进行测试。在20kg反应器中，在50℃下，用纤维素分解酶组合物CA的20mg酶蛋白/g葡聚糖水解3天后，产生水解产物。稀酸预处理的玉米秸秆水解产物具有63.2g/L葡萄糖、44.9g/L木糖、0.8g/L甘油、和9.5g/L乙酸盐的最终组成。发酵之前，每个菌株在30℃空气震荡器中，在150rpm下，在YPD培养基(10g/L酵母菌提取物、20g/L蛋白胨、和20g/L葡萄糖)上进行繁殖。生长24小时后，将这两种酵母菌菌株在50ml的水解产物中，在125ml带挡板的锥形瓶(以1g干细胞重量(DCW)/L的酵母菌投料)中进行测试。使用装配有18号钝头填充针的橡皮塞来密封每个烧瓶，并将这些烧瓶置于35℃，150rpm的速度下的空气震荡器中。在24、48和72小时取样，经由HPLC分析用于确定葡萄糖、木糖、和乙醇的浓度。将每组3个重复的结果进行平均，并且在图1中给出，其示出了在72小时内，以1g/L酵母菌投料的NREL酸预处理的玉米秸秆水解产物中，CIBTS1260对比BSGX001的比较。如在图4中所示，通过48小时发酵，CIBTS1260菌株完成了完全的木糖消耗，并且产生了大约47g/L乙醇。然而，BSGX001菌株摄取用于乙醇转化的葡萄糖缓慢，并且因此消耗了仅3g/L木糖。这些结果表明，与BSGX001相比，CIBTS1260导致了改进的用于转化至乙醇的木糖摄取和利用。
实例4
在模式培养基中，针对发酵性能进行CIBTS1260和BSGX001的比较
将CIBTS1260及其前体BSGX001的发酵性能进行比较。发酵之前，每个菌株在30℃空气震荡器中，在150rpm下，在YPD培养基(10g/L酵母菌提取物、20g/L蛋白胨、和20g/L葡萄糖)上进行繁殖。生长24小时后，将这两种酵母菌菌株在YPX培养基(5g/L酵母菌提取物、5g/L蛋白胨、和50g/L木糖)中进行测定。为了测试发酵性能，将每个菌株在50ml的YPX培养基中，在125ml带挡板的锥形瓶中(以2g DCW/L酵母菌投料)中进行接种。使用装配有18号钝头填充针的橡皮塞来密封每个烧瓶，并将这些烧瓶置于32℃，150rpm的速度下的空气震荡器中。在24、48和72小时取样，经由HPLC分析用于确定葡萄糖、木糖、和乙醇的浓度。将每组3个重复的结果进行平均，并在图5中给出。
如在图5中所示，CIBTS1260(虚线)在24小时内已经完全利用了所有可用的木糖，并产生了21.3g/L的乙醇。在72小时发酵期间内，BSGX001(实线)消耗了1.5g/L的木糖，并且所得乙醇浓度是1.3g/L。
实例5
具有CIBTS1260的纤维素分解酶组合物CA(“CA”)和纤维素分解酶组合物CB(“CB”) 甘蔗渣水解产物的发酵
将CIBTS1260用于使用在美国诺维信北美公司(Novozymes North America，USA)产生的NREL稀酸预处理的甘蔗渣水解产物的发酵测试中。在2L IKA反应器中，在50℃下，用两种纤维素分解酶组合物(称为“CA”和“CB”)的6mg酶蛋白/g葡聚糖的剂量水解5天后，产生水解产物。这些材料是针对具有以下最终组成的稀酸预处理的甘蔗渣水解产物的代表性的基准：分别针对“CA”和“CB”，40.7g/L和58.7g/L葡萄糖、42.5g/L和44.7g/L木糖、0.19g/L和0.08g/L甘油、以及8.99g/L和11.3g/L乙酸盐。发酵之前，将酵母菌在30℃空气震荡器中，在150rpm下，在2％YPD培养基(10g/L酵母菌提取物、20g/L蛋白胨、以及20g/L葡萄糖)上进行繁殖。生长24小时后，将CIBTS1260在50ml的“CA”和“CB”水解产物中，在125ml带挡板的锥形瓶中(以1g DCW/L的酵母菌投料)中进行测试。使用装配有18号钝头填充针的橡皮塞来密封每个烧瓶，并将这些烧瓶置于35℃，150rpm的速度下的空气震荡器中。在24、48和72小时取样，经由HPLC分析用于确定葡萄糖、木糖、乙醇、乙酸盐、和甘油的浓度。将每组3个重复的结果进行平均，并在图6中给出。在72小时时间段内，存在于两种系统中的大于95％的葡萄糖和木糖被消耗，其中基于总糖的乙醇产率对于“CA”水解产物为84.1％，对于“CB”水解产物为86.4％。
实例6
稀酸预处理的玉米秸秆和甘蔗的甘蔗渣水解产物的CIBTS1260和BSGX001发酵过 程中的DP2减少
将来自美国国家可再生能源实验室(NREL)的稀酸预处理的玉米秸杆和甘蔗的甘蔗渣在50℃下，2L IKA反应器中，用两种酶产物混合物(称为CA和CB)的6mg酶蛋白/g葡聚糖剂量，持续5天进行水解。发酵之前，将CIBTS1260和BSGX001酵母菌在30℃空气震荡器中，在150rpm下，在YPD培养基(10g/L酵母菌提取物、20g/L蛋白胨、以及20g/L葡萄糖)上进行繁殖。生长24小时后，经由离心收获来自每个菌株的细胞，并且将这些细胞分别添加至在125ml带挡板的锥形瓶中的补充有2g/L尿素的50ml的CA和CB水解产物(以1g DCW/L(干细胞重量/L)的酵母菌投料)。使用装配有18号钝头填充针的橡皮塞来密封每个烧瓶，并将这些烧瓶置于35℃，150rpm的速度下的空气震荡器中。在0小时和72小时取样，经由HPLC分析用于确定DP2浓度。将每组的重复的结果进行平均(对于CIBTS1260，n＝3，并且对于BSGX001，n＝2)。如图7所示，在相同的水解产物中，使用CIBTS1260进行的发酵比使用BSGX001的发酵更多地降低了DP2浓度。如在HPLC上测量的DP2峰，包含纤维二糖和短链的糖。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
萨顿（SUTTON）, 凯特 布兰登（Kate Brandon）
刁（DIAO）, 刘杨（Liuyang）
江（JIANG）, 宇（Yu）
杨（ YANG）, 盛（Sheng）
<120> 用于生产乙醇的方法和发酵生物
<130> 13021-WO-PCT[4]
<160> 22
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 797
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 1
Met Val Asn Asn Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Thr Ala Leu Ala Gln Asn Asn Gln Thr Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Gln
20 25 30
Gly Gln Pro Asp Leu Tyr Pro Glu Thr Leu Ala Thr Leu Thr Leu Ser
35 40 45
Phe Pro Asp Cys Glu His Gly Pro Leu Lys Asn Asn Leu Val Cys Asp
50 55 60
Ser Ser Ala Gly Tyr Val Glu Arg Ala Gln Ala Leu Ile Ser Leu Phe
65 70 75 80
Thr Leu Glu Glu Leu Ile Leu Asn Thr Gln Asn Ser Gly Pro Gly Val
85 90 95
Pro Arg Leu Gly Leu Pro Asn Tyr Gln Val Trp Asn Glu Ala Leu His
100 105 110
Gly Leu Asp Arg Ala Asn Phe Ala Thr Lys Gly Gly Gln Phe Glu Trp
115 120 125
Ala Thr Ser Phe Pro Met Pro Ile Leu Thr Thr Ala Ala Leu Asn Arg
130 135 140
Thr Leu Ile His Gln Ile Ala Asp Ile Ile Ser Thr Gln Ala Arg Ala
145 150 155 160
Phe Ser Asn Ser Gly Arg Tyr Gly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Val
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Asn Gly Phe Arg Ser Pro Leu Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly
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Glu Asp Ala Phe Phe Leu Ser Ser Ala Tyr Thr Tyr Glu Tyr Ile Thr
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210 215 220
Val Lys His Phe Ala Gly Tyr Asp Leu Glu Asn Trp Asn Asn Gln Ser
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Arg Leu Gly Phe Asp Ala Ile Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ser Glu Tyr
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Tyr Thr Pro Gln Phe Leu Ala Ala Ala Arg Tyr Ala Lys Ser Arg Ser
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Pro His Asp Tyr Ala Ser Asn Gln Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Leu
325 330 335
Arg Ala Gly Thr Asp Ile Asp Cys Gly Gln Thr Tyr Pro Trp His Leu
340 345 350
Asn Glu Ser Phe Val Ala Gly Glu Val Ser Arg Gly Glu Ile Glu Arg
355 360 365
Ser Val Thr Arg Leu Tyr Ala Asn Leu Val Arg Leu Gly Tyr Phe Asp
370 375 380
Lys Lys Asn Gln Tyr Arg Ser Leu Gly Trp Lys Asp Val Val Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ala Trp Asn Ile Ser Tyr Glu Ala Ala Val Glu Gly Ile Val Leu
405 410 415
Leu Lys Asn Asp Gly Thr Leu Pro Leu Ser Lys Lys Val Arg Ser Ile
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Ala Leu Ile Gly Pro Trp Ala Asn Ala Thr Thr Gln Met Gln Gly Asn
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Tyr Tyr Gly Pro Ala Pro Tyr Leu Ile Ser Pro Leu Glu Ala Ala Lys
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Lys Ala Gly Tyr His Val Asn Phe Glu Leu Gly Thr Glu Ile Ala Gly
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Asn Ser Thr Thr Gly Phe Ala Lys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ser
485 490 495
Asp Ala Ile Ile Tyr Leu Gly Gly Ile Asp Asn Thr Ile Glu Gln Glu
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Gly Ala Asp Arg Thr Asp Ile Ala Trp Pro Gly Asn Gln Leu Asp Leu
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Ile Lys Gln Leu Ser Glu Val Gly Lys Pro Leu Val Val Leu Gln Met
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Gly Gly Gly Gln Val Asp Ser Ser Ser Leu Lys Ser Asn Lys Lys Val
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Asn Ser Leu Val Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln Ser Gly Gly Val Ala
565 570 575
Leu Phe Asp Ile Leu Ser Gly Lys Arg Ala Pro Ala Gly Arg Leu Val
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610 615 620
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Thr Thr Phe Lys Glu Thr Leu Ala Ser His Pro Lys Ser Leu Lys Phe
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660 665 670
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Ala Gly Pro Ala Pro Tyr Pro Asn Lys Trp Leu Val Gly Phe Asp Arg
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Leu Ala Asp Ile Lys Pro Gly His Ser Ser Lys Leu Ser Ile Pro Ile
725 730 735
Pro Val Ser Ala Leu Ala Arg Val Asp Ser His Gly Asn Arg Ile Val
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Tyr Pro Gly Lys Tyr Glu Leu Ala Leu Asn Thr Asp Glu Ser Val Lys
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Leu Glu Phe Glu Leu Val Gly Glu Glu Val Thr Ile Glu Asn Trp Pro
770 775 780
Leu Glu Glu Gln Gln Ile Lys Asp Ala Thr Pro Asp Ala
785 790 795
<210> 2
<211> 452
<212> PRT
<213> 太瑞斯梭孢壳霉
<400> 2
Met Leu Ala Asn Gly Ala Ile Val Phe Leu Ala Ala Ala Leu Gly Val
1 5 10 15
Ser Gly His Tyr Thr Trp Pro Arg Val Asn Asp Gly Ala Asp Trp Gln
20 25 30
Gln Val Arg Lys Ala Asp Asn Trp Gln Asp Asn Gly Tyr Val Gly Asp
35 40 45
Val Thr Ser Pro Gln Ile Arg Cys Phe Gln Ala Thr Pro Ser Pro Ala
50 55 60
Pro Ser Val Leu Asn Thr Thr Ala Gly Ser Thr Val Thr Tyr Trp Ala
65 70 75 80
Asn Pro Asp Val Tyr His Pro Gly Pro Val Gln Phe Tyr Met Ala Arg
85 90 95
Val Pro Asp Gly Glu Asp Ile Asn Ser Trp Asn Gly Asp Gly Ala Val
100 105 110
Trp Phe Lys Val Tyr Glu Asp His Pro Thr Phe Gly Ala Gln Leu Thr
115 120 125
Trp Pro Ser Thr Gly Lys Ser Ser Phe Ala Val Pro Ile Pro Pro Cys
130 135 140
Ile Lys Ser Gly Tyr Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Gln Ile Gly Leu His
145 150 155 160
Val Ala Gln Ser Val Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Cys Ala Gln
165 170 175
Leu Ser Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Glu Pro Pro Asn Lys Val Ala
180 185 190
Phe Pro Gly Ala Tyr Ser Ala Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn Ile
195 200 205
Tyr Tyr Pro Val Pro Thr Ser Tyr Gln Asn Pro Gly Pro Ala Val Phe
210 215 220
Ser Cys Met Leu Ala Asn Gly Ala Ile Val Phe Leu Ala Ala Ala Leu
225 230 235 240
Gly Val Ser Gly His Tyr Thr Trp Pro Arg Val Asn Asp Gly Ala Asp
245 250 255
Trp Gln Gln Val Arg Lys Ala Asp Asn Trp Gln Asp Asn Gly Tyr Val
260 265 270
Gly Asp Val Thr Ser Pro Gln Ile Arg Cys Phe Gln Ala Thr Pro Ser
275 280 285
Pro Ala Pro Ser Val Leu Asn Thr Thr Ala Gly Ser Thr Val Thr Tyr
290 295 300
Trp Ala Asn Pro Asp Val Tyr His Pro Gly Pro Val Gln Phe Tyr Met
305 310 315 320
Ala Arg Val Pro Asp Gly Glu Asp Ile Asn Ser Trp Asn Gly Asp Gly
325 330 335
Ala Val Trp Phe Lys Val Tyr Glu Asp His Pro Thr Phe Gly Ala Gln
340 345 350
Leu Thr Trp Pro Ser Thr Gly Lys Ser Ser Phe Ala Val Pro Ile Pro
355 360 365
Pro Cys Ile Lys Ser Gly Tyr Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Gln Ile Gly
370 375 380
Leu His Val Ala Gln Ser Val Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Cys
385 390 395 400
Ala Gln Leu Ser Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Glu Pro Pro Asn Lys
405 410 415
Val Ala Phe Pro Gly Ala Tyr Ser Ala Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile
420 425 430
Asn Ile Tyr Tyr Pro Val Pro Thr Ser Tyr Gln Asn Pro Gly Pro Ala
435 440 445
Val Phe Ser Cys
450
<210> 3
<211> 326
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 3
Met Lys Ser Phe Thr Ile Ala Ala Leu Ala Ala Leu Trp Ala Gln Glu
1 5 10 15
Ala Ala Ala His Ala Thr Phe Gln Asp Leu Trp Ile Asp Gly Val Asp
20 25 30
Tyr Gly Ser Gln Cys Val Arg Leu Pro Ala Ser Asn Ser Pro Val Thr
35 40 45
Asn Val Ala Ser Asp Asp Ile Arg Cys Asn Val Gly Thr Ser Arg Pro
50 55 60
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65 70 75 80
His Gln Gln Pro Gly Asp Arg Ser Cys Ala Asn Glu Ala Ile Gly Gly
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Ala Asp Gly Ser Ser Gly Trp Phe Lys Val Phe Gln Asp Ser
115 120 125
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130 135 140
Thr Lys Asp Leu Asn Ser Cys Cys Gly Lys Met Asn Val Lys Ile Pro
145 150 155 160
Glu Asp Ile Glu Pro Gly Asp Tyr Leu Leu Arg Ala Glu Val Ile Ala
165 170 175
Leu His Val Ala Ala Ser Ser Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Met Ser Cys
180 185 190
Tyr Gln Leu Thr Val Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Pro Ser Thr Val
195 200 205
Asn Phe Pro Gly Ala Tyr Ser Ala Ser Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn
210 215 220
Ile His Ala Pro Met Ser Thr Tyr Val Val Pro Gly Pro Thr Val Tyr
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Cys Thr Ala Ala Lys Tyr Gln Gln Cys Gly Gly Thr Gly Tyr Thr Gly
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Cys Thr Thr Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Pro Pro
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Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
325
<210> 4
<211> 250
<212> PRT
<213> 金黄色嗜热子囊菌
<400> 4
Met Ser Phe Ser Lys Ile Ile Ala Thr Ala Gly Val Leu Ala Ser Ala
1 5 10 15
Ser Leu Val Ala Gly His Gly Phe Val Gln Asn Ile Val Ile Asp Gly
20 25 30
Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Tyr Leu Val Asn Gln Tyr Pro Tyr Met Ser
35 40 45
Asn Pro Pro Glu Val Ile Ala Trp Ser Thr Thr Ala Thr Asp Leu Gly
50 55 60
Phe Val Asp Gly Thr Gly Tyr Gln Thr Pro Asp Ile Ile Cys His Arg
65 70 75 80
Gly Ala Lys Pro Gly Ala Leu Thr Ala Pro Val Ser Pro Gly Gly Thr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Asp Asn Pro Pro Gly Ile Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile Ala Ala Asn
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Val Thr Ile Pro Thr Thr Ile Ala Pro Gly Asn Tyr
165 170 175
Val Leu Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Gln Asn Gln Asp
180 185 190
Gly Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Leu Gln Val Thr Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Asp Asn Pro Ala Gly Thr Leu Gly Thr Ala Leu Tyr His Asp
210 215 220
Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn Ile Tyr Gln Lys Leu Ser Ser Tyr
225 230 235 240
Ile Ile Pro Gly Pro Pro Leu Tyr Thr Gly
245 250
<210> 5
<211> 863
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 5
Met Arg Phe Gly Trp Leu Glu Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ser Val
1 5 10 15
Ala Asn Ala Gln Glu Leu Ala Phe Ser Pro Pro Phe Tyr Pro Ser Pro
20 25 30
Trp Ala Asp Gly Gln Gly Glu Trp Ala Asp Ala His Arg Arg Ala Val
35 40 45
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50 55 60
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Gly Ile Arg Phe Ser Asp Leu Asn Ser Ala Phe Pro Ala Gly Thr Asn
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ala Ala Gly Pro Leu Gly Lys Tyr Pro Asp Gly Gly Arg Ile Trp Glu
145 150 155 160
Gly Phe Ser Pro Asp Pro Val Leu Thr Gly Val Leu Phe Ala Glu Thr
165 170 175
Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala Gly Val Ile Ala Thr Ala Lys His Tyr
180 185 190
Ile Leu Asn Glu Gln Glu His Phe Arg Gln Val Gly Glu Ala Gln Gly
195 200 205
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210 215 220
Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala
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245 250 255
Gly Cys Gln Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ser Phe Asp Asp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser
305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
Val Gln Arg Ser His Ser Gln Ile Ile Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser
385 390 395 400
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Val Lys Val Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly
420 425 430
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435 440 445
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Val Thr Asp Asn Gly Ala Leu Ser Gln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln
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Ser Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Phe
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Tyr Asp Asn Pro Asn Val Thr Ala Ile Ile Trp Ala Gly Leu Pro Gly
565 570 575
Gln Glu Ser Gly Asn Ser Leu Val Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn
580 585 590
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610 615 620
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
Arg Ile Thr Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Glu
705 710 715 720
Asp Ser Ser Asp Asp Pro Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Glu Tyr Ile
725 730 735
Pro Glu Gly Ala Arg Asp Gly Ser Pro Gln Pro Leu Leu Lys Ala Gly
740 745 750
Gly Ala Pro Gly Gly Asn Pro Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Val Arg Val
755 760 765
Ser Ala Thr Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Tyr Glu Val Pro
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Gln Leu Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Arg Val Val Leu
785 790 795 800
Arg Lys Phe Asp Arg Ile Phe Leu Ala Pro Gly Glu Gln Lys Val Trp
805 810 815
Thr Thr Thr Leu Asn Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Glu Ala
820 825 830
Gln Asp Trp Val Ile Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser
835 840 845
Ser Ser Arg Lys Leu Pro Leu Arg Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr
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<210> 6
<211> 406
<212> PRT
<213> 棘孢曲霉
<400> 6
Met Val Gly Leu Leu Ser Ile Thr Ala Ala Leu Ala Ala Thr Val Leu
1 5 10 15
Pro Asn Ile Val Ser Ala Val Gly Leu Asp Gln Ala Ala Val Ala Lys
20 25 30
Gly Leu Gln Tyr Phe Gly Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Thr Asp
35 40 45
Ile Pro Tyr Val Thr Gln Leu Asn Asn Thr Ala Asp Phe Gly Gln Ile
50 55 60
Thr Pro Gly Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Gly
65 70 75 80
Thr Phe Thr Phe Thr Lys Gly Asp Val Ile Ala Asp Leu Ala Glu Gly
85 90 95
Asn Gly Gln Tyr Leu Arg Cys His Thr Leu Val Trp Tyr Asn Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Trp Val Thr Ser Gly Thr Trp Thr Asn Ala Thr Leu Thr Ala
115 120 125
Ala Leu Lys Asn His Ile Thr Asn Val Val Ser His Tyr Lys Gly Lys
130 135 140
Cys Leu His Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu Asn Asp Asp Gly Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr Thr Thr Ile Gly Glu Ala Tyr Ile Pro
165 170 175
Ile Ala Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe
180 185 190
Tyr Asn Asp Tyr Asn Leu Glu Tyr Gly Gly Ala Lys Ala Ala Ser Ala
195 200 205
Arg Ala Ile Val Gln Leu Val Lys Asn Ala Gly Ala Lys Ile Asp Gly
210 215 220
Val Gly Leu Gln Ala His Phe Ser Val Gly Thr Val Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Ser Leu Val Ser Val Leu Gln Ser Phe Thr Ala Leu Gly Val Glu Val
245 250 255
Ala Tyr Thr Glu Ala Asp Val Arg Ile Leu Leu Pro Thr Thr Ala Thr
260 265 270
Thr Leu Ala Gln Gln Ser Ser Asp Phe Gln Ala Leu Val Gln Ser Cys
275 280 285
Val Gln Thr Thr Gly Cys Val Gly Phe Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp
290 295 300
Lys Tyr Ser Trp Val Pro Ser Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Ala Ala Leu
305 310 315 320
Pro Trp Asp Glu Asn Leu Val Lys Lys Pro Ala Tyr Asn Gly Leu Leu
325 330 335
Ala Gly Met Gly Val Thr Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala
340 345 350
Thr Ala Thr Gly Lys Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ser Thr
355 360 365
Gly Thr Thr Ala Ala His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Leu Asn Trp Ser
370 375 380
Gly Pro Thr Ala Cys Ala Thr Gly Tyr Thr Cys Thr Tyr Val Asn Asp
385 390 395 400
Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
405
<210> 7
<211> 253
<212> PRT
<213> 埃默森青霉菌
<400> 7
Met Leu Ser Ser Thr Thr Arg Thr Leu Ala Phe Thr Gly Leu Ala Gly
1 5 10 15
Leu Leu Ser Ala Pro Leu Val Lys Ala His Gly Phe Val Gln Gly Ile
20 25 30
Val Ile Gly Asp Gln Phe Tyr Ser Gly Tyr Ile Val Asn Ser Phe Pro
35 40 45
Tyr Glu Ser Asn Pro Pro Pro Val Ile Gly Trp Ala Thr Thr Ala Thr
50 55 60
Asp Leu Gly Phe Val Asp Gly Thr Gly Tyr Gln Gly Pro Asp Ile Ile
65 70 75 80
Cys His Arg Asn Ala Thr Pro Ala Pro Leu Thr Ala Pro Val Ala Ala
85 90 95
Gly Gly Thr Val Glu Leu Gln Trp Thr Pro Trp Pro Asp Ser His His
100 105 110
Gly Pro Val Ile Thr Tyr Leu Ala Pro Cys Asn Gly Asn Cys Ser Thr
115 120 125
Val Asp Lys Thr Thr Leu Glu Phe Phe Lys Ile Asp Gln Gln Gly Leu
130 135 140
Ile Asp Asp Thr Ser Pro Pro Gly Thr Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile
145 150 155 160
Ala Asn Asn Asn Ser Trp Thr Val Thr Ile Pro Asn Ser Val Ala Pro
165 170 175
Gly Asn Tyr Val Leu Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Asn
180 185 190
Asn Lys Asp Gly Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Ile Glu Val
195 200 205
Thr Gly Gly Gly Ser Asp Ala Pro Glu Gly Thr Leu Gly Glu Asp Leu
210 215 220
Tyr His Asp Thr Asp Pro Gly Ile Leu Val Asp Ile Tyr Glu Pro Ile
225 230 235 240
Ala Thr Tyr Thr Ile Pro Gly Pro Pro Glu Pro Thr Phe
245 250
<210> 8
<211> 397
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 8
Met Val His Leu Ser Ser Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Leu Pro Leu
1 5 10 15
Val Tyr Gly Ala Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Lys Gly Leu Lys
20 25 30
Tyr Phe Gly Ser Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Thr Asp Ser Ala Tyr
35 40 45
Val Ala Gln Leu Ser Asn Thr Asp Asp Phe Gly Gln Ile Thr Pro Gly
50 55 60
Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Asn Ser Phe Ser
65 70 75 80
Phe Ala Asn Gly Asp Ala Val Val Asn Leu Ala Asn Lys Asn Gly Gln
85 90 95
Leu Met Arg Cys His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Asn Trp
100 105 110
Val Ser Ser Gly Ser Trp Thr Asn Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Lys
115 120 125
Asn His Ile Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Lys Cys Tyr Ala
130 135 140
Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Leu Asn Glu Asp Gly Thr Phe Arg Asn
145 150 155 160
Ser Val Phe Tyr Gln Ile Ile Gly Pro Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe
165 170 175
Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Pro Asp Val Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp
180 185 190
Tyr Asn Ile Glu Tyr Ser Gly Ala Lys Ala Thr Ala Ala Gln Asn Ile
195 200 205
Val Lys Met Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Lys Ile Asp Gly Val Gly Leu
210 215 220
Gln Ala His Phe Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Gln Ser Asp Leu Thr
225 230 235 240
Thr Val Leu Lys Gly Tyr Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Tyr Thr
245 250 255
Glu Leu Asp Ile Arg Met Gln Leu Pro Ser Thr Ala Ala Lys Leu Ala
260 265 270
Gln Gln Ser Thr Asp Phe Gln Gly Val Ala Ala Ala Cys Val Ser Thr
275 280 285
Thr Gly Cys Val Gly Val Thr Ile Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser
290 295 300
Trp Val Pro Ser Val Phe Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Leu Pro Trp Asp
305 310 315 320
Glu Asn Tyr Val Lys Lys Pro Ala Tyr Asp Gly Leu Met Ala Gly Leu
325 330 335
Gly Ala Ser Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Thr
340 345 350
Thr Thr Gly Gly Thr Asp Pro Thr Gly Val Ala Gln Lys Trp Gly Gln
355 360 365
Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr
370 375 380
Thr Cys Gln Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
385 390 395
<210> 9
<211> 792
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 9
Met Ala Val Ala Lys Ser Ile Ala Ala Val Leu Val Ala Leu Leu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Leu Ala Gln Ala Asn Thr Ser Tyr Val Asp Tyr Asn Val Glu
20 25 30
Ala Asn Pro Asp Leu Thr Pro Gln Ser Val Ala Thr Ile Asp Leu Ser
35 40 45
Phe Pro Asp Cys Glu Asn Gly Pro Leu Ser Lys Thr Leu Val Cys Asp
50 55 60
Thr Ser Ala Arg Pro His Asp Arg Ala Ala Ala Leu Val Ser Met Phe
65 70 75 80
Thr Phe Glu Glu Leu Val Asn Asn Thr Gly Asn Thr Ser Pro Gly Val
85 90 95
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100 105 110
Gly Leu Asp Arg Ala Asn Phe Thr Asn Glu Gly Glu Tyr Ser Trp Ala
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Asn Asn Val Gly Arg Tyr Gly Leu Asp Val Tyr Ala Pro Asn Ile Asn
165 170 175
Ala Phe Arg Ser Ala Met Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly Glu
180 185 190
Asp Ala Tyr Cys Leu Ala Ser Ala Tyr Ala Tyr Glu Tyr Ile Thr Gly
195 200 205
Ile Gln Gly Gly Val Asp Pro Glu His Leu Lys Leu Val Ala Thr Ala
210 215 220
Lys His Tyr Ala Gly Tyr Asp Leu Glu Asn Trp Asp Gly His Ser Arg
225 230 235 240
Leu Gly Asn Asp Met Asn Ile Thr Gln Gln Glu Leu Ser Glu Tyr Tyr
245 250 255
Thr Pro Gln Phe Leu Val Ala Ala Arg Asp Ala Lys Val His Ser Val
260 265 270
Met Cys Ser Tyr Asn Ala Val Asn Gly Val Pro Ser Cys Ala Asn Ser
275 280 285
Phe Phe Leu Gln Thr Leu Leu Arg Asp Thr Phe Gly Phe Val Glu Asp
290 295 300
Gly Tyr Val Ser Ser Asp Cys Asp Ser Ala Tyr Asn Val Trp Asn Pro
305 310 315 320
His Glu Phe Ala Ala Asn Ile Thr Gly Ala Ala Ala Asp Ser Ile Arg
325 330 335
Ala Gly Thr Asp Ile Asp Cys Gly Thr Thr Tyr Gln Tyr Tyr Phe Gly
340 345 350
Glu Ala Phe Asp Glu Gln Glu Val Thr Arg Ala Glu Ile Glu Arg Gly
355 360 365
Val Ile Arg Leu Tyr Ser Asn Leu Val Arg Leu Gly Tyr Phe Asp Gly
370 375 380
Asn Gly Ser Val Tyr Arg Asp Leu Thr Trp Asn Asp Val Val Thr Thr
385 390 395 400
Asp Ala Trp Asn Ile Ser Tyr Glu Ala Ala Val Glu Gly Ile Val Leu
405 410 415
Leu Lys Asn Asp Gly Thr Leu Pro Leu Ala Lys Ser Val Arg Ser Val
420 425 430
Ala Leu Ile Gly Pro Trp Met Asn Val Thr Thr Gln Leu Gln Gly Asn
435 440 445
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450 455 460
Asn Ser Asp Phe Asp Val Asn Tyr Ala Phe Gly Thr Asn Ile Ser Ser
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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Ile Asp Gln Leu Ser Gln Leu Gly Lys Pro Leu Ile Val Leu Gln Met
530 535 540
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545 550 555 560
Asn Ser Leu Ile Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln Ser Gly Gly Gln Ala
565 570 575
Leu Leu Asp Ile Ile Thr Gly Lys Arg Ala Pro Ala Gly Arg Leu Val
580 585 590
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595 600 605
Met Ser Leu Arg Pro His Gly Asn Asn Pro Gly Gln Thr Tyr Met Trp
610 615 620
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625 630 635 640
Thr Phe His Ala Ser Leu Pro Gly Thr Gly Lys Asp Lys Thr Ser Phe
645 650 655
Asn Ile Gln Asp Leu Leu Thr Gln Pro His Pro Gly Phe Ala Asn Val
660 665 670
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675 680 685
Lys Val Ala Ser Asp Tyr Thr Ala Met Leu Phe Ala Asn Thr Thr Ala
690 695 700
Gly Pro Ala Pro Tyr Pro Asn Lys Trp Leu Val Gly Phe Asp Arg Leu
705 710 715 720
Ala Ser Leu Glu Pro His Arg Ser Gln Thr Met Thr Ile Pro Val Thr
725 730 735
Ile Asp Ser Val Ala Arg Thr Asp Glu Ala Gly Asn Arg Val Leu Tyr
740 745 750
Pro Gly Lys Tyr Glu Leu Ala Leu Asn Asn Glu Arg Ser Val Val Leu
755 760 765
Gln Phe Val Leu Thr Gly Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Trp Pro Val
770 775 780
Glu Gln Gln Gln Ile Ser Ser Ala
785 790
<210> 10
<211> 532
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 10
Met Leu Ala Ser Thr Phe Ser Tyr Arg Met Tyr Lys Thr Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Ala Leu Leu Gly Ser Gly Gln Ala Gln Gln Val Gly Thr Ser
20 25 30
Gln Ala Glu Val His Pro Ser Met Thr Trp Gln Ser Cys Thr Ala Gly
35 40 45
Gly Ser Cys Thr Thr Asn Asn Gly Lys Val Val Ile Asp Ala Asn Trp
50 55 60
Arg Trp Val His Lys Val Gly Asp Tyr Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn
65 70 75 80
Thr Trp Asp Thr Thr Ile Cys Pro Asp Asp Ala Thr Cys Ala Ser Asn
85 90 95
Cys Ala Leu Glu Gly Ala Asn Tyr Glu Ser Thr Tyr Gly Val Thr Ala
100 105 110
Ser Gly Asn Ser Leu Arg Leu Asn Phe Val Thr Thr Ser Gln Gln Lys
115 120 125
Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr Met Met Lys Asp Asp Ser Thr Tyr Glu
130 135 140
Met Phe Lys Leu Leu Asn Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Val Ser
145 150 155 160
Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Asp
165 170 175
Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr Pro Thr Asn Lys Ala Gly Ala Lys
180 185 190
Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe
195 200 205
Ile Asn Gly Gln Ala Asn Val Glu Gly Trp Gln Pro Ser Ser Asn Asp
210 215 220
Ala Asn Ala Gly Thr Gly Asn His Gly Ser Cys Cys Ala Glu Met Asp
225 230 235 240
Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Thr Ala Phe Thr Pro His Pro Cys
245 250 255
Asp Thr Pro Gly Gln Val Met Cys Thr Gly Asp Ala Cys Gly Gly Thr
260 265 270
Tyr Ser Ser Asp Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp
275 280 285
Phe Asn Ser Phe Arg Gln Gly Asn Lys Thr Phe Tyr Gly Pro Gly Met
290 295 300
Thr Val Asp Thr Lys Ser Lys Phe Thr Val Val Thr Gln Phe Ile Thr
305 310 315 320
Asp Asp Gly Thr Ser Ser Gly Thr Leu Lys Glu Ile Lys Arg Phe Tyr
325 330 335
Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Glu Ser Thr Trp Thr Gly
340 345 350
Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu Tyr Cys Thr Ala Gln Lys Ser
355 360 365
Leu Phe Gln Asp Gln Asn Val Phe Glu Lys His Gly Gly Leu Glu Gly
370 375 380
Met Gly Ala Ala Leu Ala Gln Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp
385 390 395 400
Asp Asp His Ser Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Asn Tyr Pro Thr
405 410 415
Thr Ala Ser Ser Thr Thr Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys Asp Ile
420 425 430
Ser Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ala Asn His Pro Asp Ala Tyr
435 440 445
Val Val Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly Pro Ile Gly Ser Thr Phe Asn
450 455 460
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465 470 475 480
Gln Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Gly Asn Pro Gly Gly Thr Gly
485 490 495
Val Ala Gln His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro
500 505 510
Thr Thr Cys Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Lys Leu Asn Asp Tyr Tyr
515 520 525
Ser Gln Cys Leu
530
<210> 11
<211> 454
<212> PRT
<213> 烟曲霉
<400> 11
Met Lys His Leu Ala Ser Ser Ile Ala Leu Thr Leu Leu Leu Pro Ala
1 5 10 15
Val Gln Ala Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp
20 25 30
Ser Gly Pro Thr Ser Cys Val Ala Gly Ala Ala Cys Ser Thr Leu Asn
35 40 45
Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Ala Thr Ser Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ser Gln Thr Thr Thr Lys
65 70 75 80
Pro Thr Thr Thr Gly Pro Thr Thr Ser Ala Pro Thr Val Thr Ala Ser
85 90 95
Gly Asn Pro Phe Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Ala Asn Pro Tyr Tyr Ser
100 105 110
Ser Glu Val His Thr Leu Ala Met Pro Ser Leu Pro Ser Ser Leu Gln
115 120 125
Pro Lys Ala Ser Ala Val Ala Glu Val Pro Ser Phe Val Trp Leu Asp
130 135 140
Val Ala Ala Lys Val Pro Thr Met Gly Thr Tyr Leu Ala Asp Ile Gln
145 150 155 160
Ala Lys Asn Lys Ala Gly Ala Asn Pro Pro Ile Ala Gly Ile Phe Val
165 170 175
Val Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Leu Ala Ser Asn Gly
180 185 190
Glu Tyr Ser Ile Ala Asn Asn Gly Val Ala Asn Tyr Lys Ala Tyr Ile
195 200 205
Asp Ala Ile Arg Ala Gln Leu Val Lys Tyr Ser Asp Val His Thr Ile
210 215 220
Leu Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Asn
225 230 235 240
Val Ala Lys Cys Ala Asn Ala Gln Ser Ala Tyr Leu Glu Cys Val Asp
245 250 255
Tyr Ala Leu Lys Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp
260 265 270
Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Leu Gly Pro Ala
275 280 285
Ala Thr Leu Phe Ala Lys Val Tyr Thr Asp Ala Gly Ser Pro Ala Ala
290 295 300
Val Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser Leu
305 310 315 320
Ser Thr Cys Pro Ser Tyr Thr Gln Gly Asp Pro Asn Cys Asp Glu Lys
325 330 335
Lys Tyr Ile Asn Ala Met Ala Pro Leu Leu Lys Glu Ala Gly Phe Asp
340 345 350
Ala His Phe Ile Met Asp Thr Ser Arg Asn Gly Val Gln Pro Thr Lys
355 360 365
Gln Asn Ala Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Ile Gly Thr Gly Phe Gly
370 375 380
Val Arg Pro Ser Thr Asn Thr Gly Asp Pro Leu Gln Asp Ala Phe Val
385 390 395 400
Trp Ile Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asn Ser Thr Ser
405 410 415
Pro Arg Tyr Asp Ala His Cys Gly Tyr Ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala
420 425 430
Pro Glu Ala Gly Thr Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr
435 440 445
Asn Ala Asn Pro Ser Phe
450
<210> 12
<211> 620
<212> PRT
<213> 嗜热毁丝霉
<400> 12
Met Lys Ser Phe Ile Ser Ala Ala Thr Leu Leu Val Gly Ile Leu Thr
1 5 10 15
Pro Ser Val Ala Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Glu Gln Arg Asp Leu
20 25 30
Leu Val Pro Ile Thr Glu Arg Glu Glu Ala Ala Val Lys Ala Arg Gln
35 40 45
Gln Ser Cys Asn Thr Pro Ser Asn Arg Ala Cys Trp Thr Asp Gly Tyr
50 55 60
Asp Ile Asn Thr Asp Tyr Glu Val Asp Ser Pro Asp Thr Gly Val Val
65 70 75 80
Arg Pro Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Glu Val Asp Asn Trp Thr Gly Pro
85 90 95
Asp Gly Val Val Lys Glu Lys Val Met Leu Val Asn Asn Ser Ile Ile
100 105 110
Gly Pro Thr Ile Phe Ala Asp Trp Gly Asp Thr Ile Gln Val Thr Val
115 120 125
Ile Asn Asn Leu Glu Thr Asn Gly Thr Ser Ile His Trp His Gly Leu
130 135 140
His Gln Lys Gly Thr Asn Leu His Asp Gly Ala Asn Gly Ile Thr Glu
145 150 155 160
Cys Pro Ile Pro Pro Lys Gly Gly Arg Lys Val Tyr Arg Phe Lys Ala
165 170 175
Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Trp Tyr His Ser His Phe Ser Ala Gln Tyr
180 185 190
Gly Asn Gly Val Val Gly Ala Ile Gln Ile Asn Gly Pro Ala Ser Leu
195 200 205
Pro Tyr Asp Thr Asp Leu Gly Val Phe Pro Ile Ser Asp Tyr Tyr Tyr
210 215 220
Ser Ser Ala Asp Glu Leu Val Glu Leu Thr Lys Asn Ser Gly Ala Pro
225 230 235 240
Phe Ser Asp Asn Val Leu Phe Asn Gly Thr Ala Lys His Pro Glu Thr
245 250 255
Gly Glu Gly Glu Tyr Ala Asn Val Thr Leu Thr Pro Gly Arg Arg His
260 265 270
Arg Leu Arg Leu Ile Asn Thr Ser Val Glu Asn His Phe Gln Val Ser
275 280 285
Leu Val Asn His Thr Met Cys Ile Ile Ala Ala Asp Met Val Pro Val
290 295 300
Asn Ala Met Thr Val Asp Ser Leu Phe Leu Gly Val Gly Gln Arg Tyr
305 310 315 320
Asp Val Val Ile Glu Ala Asn Arg Thr Pro Gly Asn Tyr Trp Phe Asn
325 330 335
Val Thr Phe Gly Gly Gly Leu Leu Cys Gly Gly Ser Arg Asn Pro Tyr
340 345 350
Pro Ala Ala Ile Phe His Tyr Ala Gly Ala Pro Gly Gly Pro Pro Thr
355 360 365
Asp Glu Gly Lys Ala Pro Val Asp His Asn Cys Leu Asp Leu Pro Asn
370 375 380
Leu Lys Pro Val Val Ala Arg Asp Val Pro Leu Ser Gly Phe Ala Lys
385 390 395 400
Arg Ala Asp Asn Thr Leu Asp Val Thr Leu Asp Thr Thr Gly Thr Pro
405 410 415
Leu Phe Val Trp Lys Val Asn Gly Ser Ala Ile Asn Ile Asp Trp Gly
420 425 430
Arg Ala Val Val Asp Tyr Val Leu Thr Gln Asn Thr Ser Phe Pro Pro
435 440 445
Gly Tyr Asn Ile Val Glu Val Asn Gly Ala Asp Gln Trp Ser Tyr Trp
450 455 460
Leu Ile Glu Asn Asp Pro Gly Ala Pro Phe Thr Leu Pro His Pro Met
465 470 475 480
His Leu His Gly His Asp Phe Tyr Val Leu Gly Arg Ser Pro Asp Glu
485 490 495
Ser Pro Ala Ser Asn Glu Arg His Val Phe Asp Pro Ala Arg Asp Ala
500 505 510
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Ser Met Leu
515 520 525
Pro Ala Phe Gly Trp Val Val Leu Ser Phe Arg Ala Asp Asn Pro Gly
530 535 540
Ala Trp Leu Phe His Cys His Ile Ala Trp His Val Ser Gly Gly Leu
545 550 555 560
Gly Val Val Tyr Leu Glu Arg Ala Asp Asp Leu Arg Gly Ala Val Ser
565 570 575
Asp Ala Asp Ala Asp Asp Leu Asp Arg Leu Cys Ala Asp Trp Arg Arg
580 585 590
Tyr Trp Pro Thr Asn Pro Tyr Pro Lys Ser Asp Ser Gly Leu Lys His
595 600 605
Arg Trp Val Glu Glu Gly Glu Trp Leu Val Lys Ala
610 615 620
<210> 13
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 披露于US8586336B中的牛木糖异构酶
<400> 13
Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Phe Thr Gly Lys Ile Pro Phe Glu Gly
1 5 10 15
Lys Asp Ser Lys Asn Val Met Ala Phe His Tyr Tyr Glu Pro Glu Lys
20 25 30
Val Val Met Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ala Met Ala
35 40 45
Trp Trp His Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Gln Phe Gly Gly Gln
50 55 60
Thr Arg Ser Tyr Glu Trp Asp Lys Ala Glu Cys Pro Val Gln Arg Ala
65 70 75 80
Lys Asp Lys Met Asp Ala Gly Phe Glu Ile Met Asp Lys Leu Gly Ile
85 90 95
Glu Tyr Phe Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Glu Glu Ala Pro Thr
100 105 110
Ile Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Met Lys Ala Ile Thr Asp Tyr Ala Gln
115 120 125
Glu Lys Met Lys Gln Phe Pro Asn Ile Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala
130 135 140
Asn Val Phe Gly Asn Lys Arg Tyr Ala Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro
145 150 155 160
Asp Phe Asp Val Val Ala Arg Ala Ile Val Gln Ile Lys Asn Ser Ile
165 170 175
Asp Ala Thr Ile Lys Leu Gly Gly Thr Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly
180 185 190
Arg Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Gln Lys Arg Glu Lys
195 200 205
Glu His Met Ala Thr Met Leu Gly Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Ala
210 215 220
Lys Gly Phe Lys Gly Thr Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro
225 230 235 240
Ser Lys His Gln Tyr Asp Val Asp Thr Glu Thr Val Ile Gly Phe Leu
245 250 255
Lys Ala His Gly Leu Asp Lys Asp Phe Lys Val Asn Ile Glu Val Asn
260 265 270
His Ala Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Glu His Glu Leu Ala Cys Ala
275 280 285
Val Asp Ala Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala
290 295 300
Gln Asn Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ile Asp Asn Phe Glu Leu
305 310 315 320
Thr Gln Ala Met Leu Glu Ile Ile Arg Asn Gly Gly Leu Gly Asn Gly
325 330 335
Gly Thr Asn Phe Asp Ala Lys Ile Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu
340 345 350
Asp Leu Phe Ile Ala His Ile Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala
355 360 365
Leu Met Asn Ala Ala Asp Ile Leu Glu Asn Ser Glu Leu Pro Ala Met
370 375 380
Lys Lys Ala Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe
385 390 395 400
Glu Asp Gly Lys Leu Thr Phe Glu Gln Val Tyr Glu Tyr Gly Lys Lys
405 410 415
Val Glu Glu Pro Lys Gln Thr Ser Gly Lys Gln Glu Lys Tyr Glu Thr
420 425 430
Ile Val Ala Leu His Cys Lys
435
<210> 14
<211> 507
<212> PRT
<213> 雷塞特纳斯踝节菌（Talaromyces leycettanus）
<400> 14
Gln Gln Ala Gly Thr Leu Thr Thr Glu Thr His Pro Ser Leu Thr Trp
1 5 10 15
Gln Gln Cys Ser Ala Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly Lys Val
20 25 30
Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Ser Thr Ser Gly Ser Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Thr Leu Cys Pro Asp Asp
50 55 60
Val Thr Cys Ala Ala Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Arg Leu Asn Phe Val
85 90 95
Thr Gln Ala Ser Gln Lys Asn Val Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Met Glu
100 105 110
Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Asn Gln Glu Phe Thr
115 120 125
Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu
130 135 140
Tyr Leu Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ala Lys Tyr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys
165 170 175
Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Val Glu Gly Trp
180 185 190
Gln Pro Ser Ser Asn Asp Pro Asn Ser Gly Ile Gly Asn His Gly Ser
195 200 205
Cys Cys Ala Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Asn Ala
210 215 220
Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Val Met Cys Thr Gly
225 230 235 240
Asn Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Arg Tyr Ala Gly Thr Cys
245 250 255
Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn His Ser
260 265 270
Phe Tyr Gly Pro Lys Gln Ile Val Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr Val
275 280 285
Val Thr Gln Phe Leu Thr Asp Asp Gly Thr Ser Thr Gly Thr Leu Ser
290 295 300
Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Gln Val Ile Pro Asn Ser
305 310 315 320
Val Ser Thr Ile Ser Gly Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu Phe
325 330 335
Cys Thr Ala Gln Lys Gln Ala Phe Gly Asp Thr Asp Asp Phe Ser Lys
340 345 350
His Gly Gly Leu Ser Gly Met Ser Ala Ala Leu Ser Gln Gly Met Val
355 360 365
Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu
370 375 380
Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Ala Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Ala
385 390 395 400
Arg Gly Thr Cys Asp Ile Ser Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ser
405 410 415
Asn Asp Pro Asn Ala Tyr Val Val Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly Pro
420 425 430
Ile Gly Ser Thr Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Ser Ser
450 455 460
Ala Ser Ser Thr Gly Thr Gly Val Ala Gln His Trp Gly Gln Cys Gly
465 470 475 480
Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Pro Tyr Thr Cys
485 490 495
Gln Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Tyr Gln Cys Leu
500 505
<210> 15
<211> 507
<212> PRT
<213> 雷塞特纳斯踝节菌（Talaromyces leycettanus）
<400> 15
Gln Gln Ala Gly Thr Leu Thr Thr Glu Thr His Pro Ser Leu Thr Trp
1 5 10 15
Gln Gln Cys Ser Ala Gly Gly Ser Cys Thr Thr Gln Asn Gly Lys Val
20 25 30
Val Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Val His Ser Thr Ser Gly Ser Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Thr Leu Cys Pro Asp Asp
50 55 60
Val Thr Cys Ala Ala Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ser Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Gly Val Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Arg Leu Asn Phe Val
85 90 95
Thr Gln Ala Ser Gln Lys Asn Val Gly Ser Arg Leu Tyr Leu Met Glu
100 105 110
Asn Asp Thr Thr Tyr Gln Ile Phe Lys Leu Leu Asn Gln Glu Phe Thr
115 120 125
Phe Asp Val Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Leu
130 135 140
Tyr Leu Val Ala Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ala Lys Tyr Pro Thr
145 150 155 160
Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys
165 170 175
Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Val Glu Gly Trp
180 185 190
Gln Pro Ser Ser Asn Asp Pro Asn Ser Gly Ile Gly Asn His Gly Ser
195 200 205
Cys Cys Ala Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Asn Ala
210 215 220
Val Thr Pro His Pro Cys Asp Thr Pro Gly Gln Val Met Cys Thr Gly
225 230 235 240
Asn Asn Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Thr Arg Tyr Ala Gly Thr Cys
245 250 255
Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn Pro Tyr Arg Met Gly Asn His Ser
260 265 270
Phe Tyr Gly Pro Lys Gln Ile Val Asp Thr Ser Ser Lys Phe Thr Val
275 280 285
Val Thr Gln Phe Leu Thr Asp Asp Gly Thr Ser Thr Gly Thr Leu Ser
290 295 300
Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Gln Val Ile Pro Asn Ser
305 310 315 320
Val Ser Thr Ile Ser Gly Val Ser Gly Asn Ser Ile Thr Thr Glu Phe
325 330 335
Cys Thr Ala Gln Lys Gln Ala Phe Gly Asp Thr Asp Asp Phe Ser Lys
340 345 350
His Gly Gly Leu Ser Gly Met Ser Ala Ala Leu Ser Gln Gly Met Val
355 360 365
Leu Val Met Ser Leu Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met Leu Trp Leu
370 375 380
Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Ala Thr Ser Ser Thr Pro Gly Ala Ala
385 390 395 400
Arg Gly Thr Cys Asp Ile Ser Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ser
405 410 415
Asn Asp Pro Asn Ala Tyr Val Val Tyr Ser Asn Ile Lys Val Gly Pro
420 425 430
Ile Gly Ser Thr Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ser Pro Thr Thr Thr Thr Ser Ser
450 455 460
Ala Ser Ser Thr Gly Thr Gly Val Ala Gln His Trp Gly Gln Cys Gly
465 470 475 480
Gly Gln Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys Val Ser Pro Tyr Thr Cys
485 490 495
Gln Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Tyr Gln Cys Leu
500 505
<210> 16
<211> 385
<212> PRT
<213> 雷塞特纳斯踝节菌（Talaromyces leycettanus）
<400> 16
Ala Gly Leu Asn Thr Ala Ala Lys Ala Ile Gly Lys Leu Tyr Phe Gly
1 5 10 15
Thr Ala Thr Asp Asn Pro Glu Leu Ser Asp Ser Thr Tyr Met Gln Glu
20 25 30
Thr Asp Asn Thr Asp Asp Phe Gly Gln Leu Thr Pro Ala Asn Ser Met
35 40 45
Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Ser Gln Asn Thr Phe Thr Phe Thr Asn
50 55 60
Gly Asp Gln Ile Ala Asn Leu Ala Lys Ser Asn Gly Gln Met Leu Arg
65 70 75 80
Cys His Asn Leu Val Trp Tyr Asn Gln Leu Pro Ser Trp Val Thr Ser
85 90 95
Gly Ser Trp Thr Asn Ala Thr Leu Leu Ala Ala Met Lys Asn His Ile
100 105 110
Thr Asn Val Val Thr His Tyr Lys Gly Gln Cys Tyr Ala Trp Asp Val
115 120 125
Val Asn Glu Ala Leu Asn Asp Asp Gly Thr Tyr Arg Ser Asn Val Phe
130 135 140
Tyr Gln Tyr Ile Gly Glu Ala Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Ala Thr Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr Tyr Asn Asp Tyr Asn Ile
165 170 175
Glu Tyr Pro Gly Ala Lys Ala Thr Ala Ala Gln Asn Ile Val Lys Met
180 185 190
Val Lys Ala Tyr Gly Ala Lys Ile Asp Gly Val Gly Leu Gln Ser His
195 200 205
Phe Ile Val Gly Ser Thr Pro Ser Gln Ser Ser Gln Gln Ser Asn Met
210 215 220
Ala Ala Phe Thr Ala Leu Gly Val Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp
225 230 235 240
Ile Arg Met Thr Leu Pro Ser Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gln Gln Ser
245 250 255
Thr Asp Tyr Gln Ser Thr Val Ser Ala Cys Val Asn Thr Pro Lys Cys
260 265 270
Ile Gly Ile Thr Leu Trp Asp Trp Thr Asp Lys Tyr Ser Trp Val Pro
275 280 285
Asn Thr Phe Ser Gly Gln Gly Asp Ala Cys Pro Trp Asp Ser Asn Tyr
290 295 300
Gln Lys Lys Pro Ala Tyr Tyr Gly Ile Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ser
305 310 315 320
Ala Ser Thr Ser Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Thr Arg Thr Ser
325 330 335
Thr Thr Thr Ser Thr Ser Ala Thr Ser Thr Ser Thr Gly Val Ala Gln
340 345 350
His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Thr Thr Cys
355 360 365
Ala Ser Pro Tyr Thr Cys Gln Glu Leu Asn Pro Tyr Tyr Tyr Gln Cys
370 375 380
Leu
385
<210> 17
<211> 775
<212> PRT
<213> 埃默森踝节菌
<400> 17
Gln Asp Asn Gln Thr Tyr Ala Asn Tyr Ser Ser Gln Ser Gln Pro Asp
1 5 10 15
Leu Phe Pro Arg Thr Val Ala Thr Ile Asp Leu Ser Phe Pro Asp Cys
20 25 30
Glu Asn Gly Pro Leu Ser Thr Asn Leu Val Cys Asn Lys Ser Ala Asp
35 40 45
Pro Trp Ala Arg Ala Glu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Thr Leu Glu Glu
50 55 60
Leu Ile Asn Asn Thr Gln Asn Thr Ala Pro Gly Val Pro Arg Leu Gly
65 70 75 80
Leu Pro Gln Tyr Gln Val Trp Asn Glu Ala Leu His Gly Leu Asp Arg
85 90 95
Ala Asn Phe Ser His Ser Gly Glu Tyr Ser Trp Ala Thr Ser Phe Pro
100 105 110
Met Pro Ile Leu Ser Met Ala Ser Phe Asn Arg Thr Leu Ile Asn Gln
115 120 125
Ile Ala Ser Ile Ile Ala Thr Gln Ala Arg Ala Phe Asn Asn Ala Gly
130 135 140
Arg Tyr Gly Leu Asp Ser Tyr Ala Pro Asn Ile Asn Gly Phe Arg Ser
145 150 155 160
Pro Leu Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly Glu Asp Ala Phe Phe
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Tyr Ala Tyr Glu Tyr Ile Thr Gly Leu Gln Gly Gly
180 185 190
Val Asp Pro Glu His Val Lys Ile Val Ala Thr Ala Lys His Phe Ala
195 200 205
Gly Tyr Asp Leu Glu Asn Trp Gly Asn Val Ser Arg Leu Gly Phe Asn
210 215 220
Ala Ile Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Tyr Thr Pro Gln Phe
225 230 235 240
Leu Ala Ser Ala Arg Tyr Ala Lys Thr Arg Ser Ile Met Cys Ser Tyr
245 250 255
Asn Ala Val Asn Gly Val Pro Ser Cys Ala Asn Ser Phe Phe Leu Gln
260 265 270
Thr Leu Leu Arg Glu Asn Phe Asp Phe Val Asp Asp Gly Tyr Val Ser
275 280 285
Ser Asp Cys Asp Ala Val Tyr Asn Val Phe Asn Pro His Gly Tyr Ala
290 295 300
Leu Asn Gln Ser Gly Ala Ala Ala Asp Ser Leu Leu Ala Gly Thr Asp
305 310 315 320
Ile Asp Cys Gly Gln Thr Leu Pro Trp His Leu Asn Glu Ser Phe Val
325 330 335
Glu Gly Tyr Val Ser Arg Gly Asp Ile Glu Lys Ser Leu Thr Arg Leu
340 345 350
Tyr Ser Asn Leu Val Arg Leu Gly Tyr Phe Asp Gly Asn Asn Ser Glu
355 360 365
Tyr Arg Asn Leu Asn Trp Asn Asp Val Val Thr Thr Asp Ala Trp Asn
370 375 380
Ile Ser Tyr Glu Ala Ala Val Glu Gly Ile Thr Leu Leu Lys Asn Asp
385 390 395 400
Gly Thr Leu Pro Leu Ser Lys Lys Val Arg Ser Ile Ala Leu Ile Gly
405 410 415
Pro Trp Ala Asn Ala Thr Val Gln Met Gln Gly Asn Tyr Tyr Gly Thr
420 425 430
Pro Pro Tyr Leu Ile Ser Pro Leu Glu Ala Ala Lys Ala Ser Gly Phe
435 440 445
Thr Val Asn Tyr Ala Phe Gly Thr Asn Ile Ser Thr Asp Ser Thr Gln
450 455 460
Trp Phe Ala Glu Ala Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ser Asp Val Ile Ile
465 470 475 480
Tyr Ala Gly Gly Ile Asp Asn Thr Ile Glu Ala Glu Gly Gln Asp Arg
485 490 495
Thr Asp Leu Lys Trp Pro Gly Asn Gln Leu Asp Leu Ile Glu Gln Leu
500 505 510
Ser Gln Val Gly Lys Pro Leu Val Val Leu Gln Met Gly Gly Gly Gln
515 520 525
Val Asp Ser Ser Ser Leu Lys Ala Asn Lys Asn Val Asn Ala Leu Val
530 535 540
Trp Gly Gly Tyr Pro Gly Gln Ser Gly Gly Ala Ala Leu Phe Asp Ile
545 550 555 560
Leu Thr Gly Lys Arg Ala Pro Ala Gly Arg Leu Val Ser Thr Gln Tyr
565 570 575
Pro Ala Glu Tyr Ala Thr Gln Phe Pro Ala Asn Asp Met Asn Leu Arg
580 585 590
Pro Asn Gly Ser Asn Pro Gly Gln Thr Tyr Ile Trp Tyr Thr Gly Thr
595 600 605
Pro Val Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Phe Tyr Thr Glu Phe Gln Glu
610 615 620
Ser Ala Ala Ala Gly Thr Asn Lys Thr Ser Thr Phe Asp Ile Leu Asp
625 630 635 640
Leu Phe Ser Thr Pro His Pro Gly Tyr Glu Tyr Ile Glu Gln Val Pro
645 650 655
Phe Ile Asn Val Thr Val Asp Val Lys Asn Val Gly His Thr Pro Ser
660 665 670
Pro Tyr Thr Gly Leu Leu Phe Ala Asn Thr Thr Ala Gly Pro Lys Pro
675 680 685
Tyr Pro Asn Lys Trp Leu Val Gly Phe Asp Trp Leu Pro Thr Ile Gln
690 695 700
Pro Gly Glu Thr Ala Lys Leu Thr Ile Pro Val Pro Leu Gly Ala Ile
705 710 715 720
Ala Trp Ala Asp Glu Asn Gly Asn Lys Val Val Phe Pro Gly Asn Tyr
725 730 735
Glu Leu Ala Leu Asn Asn Glu Arg Ser Val Val Val Ser Phe Thr Leu
740 745 750
Thr Gly Asp Ala Ala Thr Leu Glu Lys Trp Pro Leu Trp Glu Gln Ala
755 760 765
Val Pro Gly Val Leu Gln Gln
770 775
<210> 18
<211> 1644
<212> DNA
<213> 中间假丝酵母
<400> 18
atgtcacaag actctcactc atcaggtgcc gcaaccccag taaatggtag tatattagaa 60
aaggaaaagg aagactctcc agtattgcaa gtagatgccc cacaaaaggg ttttaaggac 120
tacatagtta tctctatctt ctgtttcatg gtagcattcg gtggtttcgt ttttggtttc 180
gatacaggta ccataagtgg tttcgttaac atgtctgatt tcaaagacag attcggtcaa 240
catcacgctg atggtacacc ttacttgagt gacgttagag tcggtttgat gatctctatt 300
ttcaatgttg gttgtgccgt cggtggtatt ttcttgtgca aagtagctga tgtttggggt 360
agaagaatag gtttgatgtt ctctatggct gtttacgttg tcggtatcat catccaaatc 420
tcttcatcca ccaagtggta ccaatttttc atcggtagat taattgccgg tttagctgtc 480
ggtactgtaa gtgtagtttc tccattgttt atatcagaag tttcccctaa acaaatcaga 540
ggtacattgg tctgttgctt ccaattgtgt ataaccttgg gtatcttctt aggttattgc 600
actacatacg gtactaagac atataccgat tctagacaat ggagaatccc attgggttta 660
tgttttgcat gggccatatt gttagtcgta ggcatgttga atatgccaga atcacctaga 720
tatttggttg aaaagcatag aatcgatgaa gcaaagagaa gtatagccag atctaacaaa 780
atcccagaag aagacccttt cgtatacaca gaagttcaat tgatacaagc aggtatagaa 840
agagaagctt tggcaggtca agcctcatgg aaggaattga taacaggtaa acctaagatt 900
tttagaagag ttataatggg tatcatgttg caatctttgc aacaattgac tggtgacaac 960
tatttctttt attacggtac cactatattt caagctgtcg gtttgaaaga ctcattccaa 1020
acctccatca tcttgggtat cgttaacttc gcatcaactt tcgtcggtat ctatgtaatc 1080
gaaagattgg gtagaagatt atgtttgttg acaggtagtg ctgcaatgtt catatgcttc 1140
atcatctatt ctttgatagg tacccaacat ttgtacaagc aaggttacag taacgaaact 1200
tctaacacat acaaggcatc tggtaacgcc atgatcttta ttacttgttt gtacattttc 1260
tttttcgctt ccacatgggc aggtggtgtt tattgcataa tcagtgaatc ttacccatta 1320
agaatcagat caaaggccat gtccattgct actgccgcta actggttgtg gggtttctta 1380
atctcattct ttaccccttt tatcacttcc gctattcact tctattacgg ttttgttttc 1440
actggttgtt tggcattttc tttcttttat gtttacttct ttgtctacga aacaaagggt 1500
ttgtcattgg aagaagtcga tgaaatgtac gcttccggtg tattgccatt aaagtcagca 1560
tcctgggttc cacctaattt ggaacacatg gctcactccg ctggttacgc tggtgctgat 1620
aaggcaactg atgaacaagt ctga 1644
<210> 19
<211> 724
<212> PRT
<213> 金黄色嗜热子囊菌
<400> 19
Ala Cys Pro Tyr Met Thr Gly Glu Leu Pro Arg Ser Phe Ala Glu Asn
1 5 10 15
Pro His Ala Ile Asn Arg Arg Ala Glu Gly Gly Gly Gly Ala Ala Ala
20 25 30
Glu Thr Glu Lys Phe Leu Ser Gln Phe Tyr Leu Asn Asp Asn Asp Thr
35 40 45
Phe Met Thr Thr Asp Val Gly Gly Pro Ile Glu Asp Gln Asn Ser Leu
50 55 60
Ser Ala Gly Asp Arg Gly Pro Thr Leu Leu Glu Asp Phe Ile Leu Arg
65 70 75 80
Gln Lys Ile Gln Arg Phe Asp His Glu Arg Val Pro Glu Arg Ala Val
85 90 95
His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Val Phe Thr Ser Tyr Ala Asp
100 105 110
Trp Ser Asn Ile Thr Ala Ala Ser Phe Leu Ser Ala Ala Gly Lys Glu
115 120 125
Thr Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Ala Gly Ser Arg Gly Ser
130 135 140
Ala Asp Thr Ala Arg Asp Val His Gly Phe Ala Thr Arg Phe Tyr Thr
145 150 155 160
Asp Glu Gly Asn Phe Asp Ile Val Gly Asn Asn Ile Pro Val Phe Phe
165 170 175
Ile Gln Asp Ala Ile Gln Phe Pro Asp Leu Ile His Ala Val Lys Pro
180 185 190
Ser Pro Asn Asn Glu Ile Pro Gln Ala Ala Thr Ala His Asp Ser Ala
195 200 205
Trp Asp Phe Phe Ser Gln Gln Pro Ser Ser Leu His Thr Leu Phe Trp
210 215 220
Ala Met Ala Gly His Gly Ile Pro Arg Ser Tyr Arg Asn Met Asp Gly
225 230 235 240
Phe Gly Ile His Thr Phe Arg Phe Val Thr Asp Asp Gly Ala Ser Lys
245 250 255
Leu Val Lys Phe His Trp Thr Ser Leu Gln Gly Lys Ala Ser Leu Val
260 265 270
Trp Glu Glu Ala Gln Ala Val Ala Gly Lys Asn Ala Asp Tyr His Arg
275 280 285
Gln Asp Leu Trp Asp Ala Ile Glu Ala Gly Arg Tyr Pro Glu Trp Glu
290 295 300
Leu Gly Val Gln Ile Met Asp Glu Glu Asp Gln Leu Arg Phe Gly Phe
305 310 315 320
Asp Leu Leu Asp Pro Thr Lys Ile Val Pro Glu Glu Tyr Val Pro Ile
325 330 335
Thr Lys Leu Gly Lys Met Gln Leu Asn Arg Asn Pro Leu Asn Tyr Phe
340 345 350
Ala Glu Thr Glu Gln Ile Met Phe Gln Pro Gly His Val Val Arg Gly
355 360 365
Ile Asp Phe Thr Glu Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg Leu Phe Ser Tyr
370 375 380
Leu Asp Thr Gln Leu Asn Arg His Gly Gly Pro Asn Phe Glu Gln Ile
385 390 395 400
Pro Ile Asn Arg Pro Arg Thr Pro Ile His Asn Asn Asn Arg Asp Gly
405 410 415
Ala Ala Gln Met Tyr Ile Pro Leu Asn Lys Ala Ala Tyr Thr Pro Asn
420 425 430
Thr Leu Asn Asn Gly Ser Pro Lys Gln Ala Asn Gln Thr Val Gly Lys
435 440 445
Gly Phe Phe Thr Thr Pro Gly Arg Thr Ala Ser Gly Arg Leu Val Arg
450 455 460
Ala Val Ser Ser Thr Phe Ala Asp Val Trp Ser Gln Pro Arg Leu Phe
465 470 475 480
Tyr Asn Ser Leu Val Pro Ala Glu Gln Gln Phe Leu Ile Asn Ala Ile
485 490 495
Arg Phe Glu Thr Ala His Ile Thr Ser Asp Val Val Lys Asn Asn Val
500 505 510
Ile Ile Gln Leu Asn Arg Val Ser Asn Asn Leu Ala Lys Arg Val Ala
515 520 525
Arg Ala Ile Gly Val Ala Glu Pro Glu Pro Asp Pro Thr Leu Tyr His
530 535 540
Asn Asn Lys Thr Ala Asn Val Gly Val Phe Gly Lys Pro Leu Ala Arg
545 550 555 560
Leu Asp Gly Leu Gln Val Gly Val Leu Ala Thr Val Asn Lys Pro Asp
565 570 575
Ser Ile Lys Gln Ala Ala Ser Leu Lys Ala Ser Phe Ala Ala Asp Asn
580 585 590
Val Asp Val Lys Val Val Ala Glu Arg Leu Ala Asp Gly Val Asp Glu
595 600 605
Thr Tyr Ser Ala Ala Asp Ala Val Asn Phe Asp Ala Ile Leu Val Ala
610 615 620
Asn Gly Ala Glu Gly Leu Phe Ala Arg Asp Ser Phe Thr Ala Arg Pro
625 630 635 640
Ala Asn Ser Thr Thr Ala Thr Leu Tyr Pro Ala Gly Arg Pro Leu Gln
645 650 655
Ile Leu Val Asp Gly Phe Arg Tyr Gly Lys Pro Val Gly Ala Leu Gly
660 665 670
Ser Gly Ala Lys Ala Leu Asp Ala Ala Glu Ile Ser Thr Thr Arg Ala
675 680 685
Gly Val Tyr Val Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ser Phe Ile Asn Gly Val
690 695 700
Arg Asp Gly Leu Arg Thr Phe Lys Phe Leu Asp Arg Phe Ala Ile Asp
705 710 715 720
Glu Asp Ala Glu
<210> 20
<211> 1320
<212> DNA
<213> 牛的
<400> 20
atggcaaaag aatattttcc gtttactggt aaaattcctt tcgagggaaa ggatagtaaa 60
aatgtaatgg ctttccatta ttacgagccc gagaaagtcg tgatgggaaa gaagatgaag 120
gactggctga agttcgcaat ggcctggtgg cacacactgg gaggcgcttc tgcagaccag 180
ttcggtggtc aaactcgcag ctatgagtgg gacaaggctg aatgccccgt acagcgtgca 240
aaggataaga tggacgctgg tttcgagatc atggataagc tgggtatcga gtacttctgc 300
ttccacgatg tagacctcgt tgaggaggct cccaccatcg ctgagtacga ggagcgcatg 360
aaggccatca ccgactacgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaatat caagctgctc 420
tggggtaccg caaacgtatt cggcaacaag cgttatgcca atggcgcttc taccaacccc 480
gatttcgatg tggttgctcg tgcgattgtt cagatcaaga actctatcga cgctaccatc 540
aagcttggtg gtaccaacta tgtgttctgg ggtggtcgtg agggctacat gagcctgttg 600
aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggctacga tgctgggtat ggctcgtgac 660
tatgctcgcg ctaagggatt caagggtacg ttcctgattg agccgaagcc gatggagcct 720
tcaaagcacc agtatgatgt ggacacagag accgtgattg gcttcctgaa ggcacatggt 780
ctggataagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ctacattggc tggtcacacc 840
ttcgagcacg aactggcttg tgctgttgac gctggtatgc tgggttctat cgacgctaac 900
cgcggtgatg cccagaacgg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa ctttgagctg 960
acacaggcta tgctggagat catccgcaac ggtggtctgg gcaatggcgg taccaatttc 1020
gacgccaaga tccgtcgtaa ttctaccgac ctcgaggatc tcttcatcgc tcatatcagc 1080
ggtatggatg ccatggcccg cgccctgatg aatgcagccg atattcttga gaactctgaa 1140
ctgcccgcaa tgaagaaggc tcgctacgca agcttcgaca gcggtatcgg taaggacttc 1200
gaggatggca agctgacctt cgagcaggtt tacgagtatg gtaagaaggt tgaagagccg 1260
aagcagacct ctggcaagca ggagaagtac gagacaatcg tcgccctcca ctgcaaataa 1320
<210> 21
<211> 437
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<220>
<221> 成熟肽
<222> (1)..(437)
<400> 21
Gln Gln Pro Gly Thr Ser Thr Pro Glu Val His Pro Lys Leu Thr Thr
1 5 10 15
Tyr Lys Cys Thr Lys Ser Gly Gly Cys Val Ala Gln Asp Thr Ser Val
20 25 30
Val Leu Asp Trp Asn Tyr Arg Trp Met His Asp Ala Asn Tyr Asn Ser
35 40 45
Cys Thr Val Asn Gly Gly Val Asn Thr Thr Leu Cys Pro Asp Glu Ala
50 55 60
Thr Cys Gly Lys Asn Cys Phe Ile Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Thr Thr Ser Gly Ser Ser Leu Thr Met Asn Gln Tyr Met Pro
85 90 95
Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Ser Ser Val Ser Pro Arg Leu Tyr Leu Leu
100 105 110
Asp Ser Asp Gly Glu Tyr Val Met Leu Lys Leu Asn Gly Gln Glu Leu
115 120 125
Ser Phe Asp Val Asp Leu Ser Ala Leu Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ser
130 135 140
Leu Tyr Leu Ser Gln Met Asp Glu Asn Gly Gly Ala Asn Gln Tyr Asn
145 150 155 160
Thr Ala Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp Ala Gln Cys Pro
165 170 175
Val Gln Thr Trp Arg Asn Gly Thr Leu Asn Thr Ser His Gln Gly Phe
180 185 190
Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser Arg Ala Asn Ala
195 200 205
Leu Thr Pro His Ser Cys Thr Ala Thr Ala Cys Asp Ser Ala Gly Cys
210 215 220
Gly Phe Asn Pro Tyr Gly Ser Gly Tyr Lys Ser Tyr Tyr Gly Pro Gly
225 230 235 240
Asp Thr Val Asp Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Ile Thr Gln Phe Asn
245 250 255
Thr Asp Asn Gly Ser Pro Ser Gly Asn Leu Val Ser Ile Thr Arg Lys
260 265 270
Tyr Gln Gln Asn Gly Val Asp Ile Pro Ser Ala Gln Pro Gly Gly Asp
275 280 285
Thr Ile Ser Ser Cys Pro Ser Ala Ser Ala Tyr Gly Gly Leu Ala Thr
290 295 300
Met Gly Lys Ala Leu Ser Ser Gly Met Val Leu Val Phe Ser Ile Trp
305 310 315 320
Asn Asp Asn Ser Gln Tyr Met Asn Trp Leu Asp Ser Gly Asn Ala Gly
325 330 335
Pro Cys Ser Ser Thr Glu Gly Asn Pro Ser Asn Ile Leu Ala Asn Asn
340 345 350
Pro Asn Thr His Val Val Phe Ser Asn Ile Arg Trp Gly Asp Ile Gly
355 360 365
Ser Thr Thr Asn Ser Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr
370 375 380
Thr Phe Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser
385 390 395 400
Cys Thr Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly
405 410 415
Cys Lys Thr Cys Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr
420 425 430
Tyr Ser Gln Cys Leu
435
<210> 22
<211> 397
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<220>
<221> 成熟肽
<222> (1)..(397)
<400> 22
Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro
1 5 10 15
Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr
20 25 30
Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Thr Ile Thr Thr Ser Thr Arg Pro
35 40 45
Pro Ser Gly Pro Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser
50 55 60
Thr Pro Pro Thr Ser Ser Gly Val Arg Phe Ala Gly Val Asn Ile Ala
65 70 75 80
Gly Phe Asp Phe Gly Cys Thr Thr Asp Gly Thr Cys Val Thr Ser Lys
85 90 95
Val Tyr Pro Pro Leu Lys Asn Phe Thr Gly Ser Asn Asn Tyr Pro Asp
100 105 110
Gly Ile Gly Gln Met Gln His Phe Val Asn Asp Asp Gly Met Thr Ile
115 120 125
Phe Arg Leu Pro Val Gly Trp Gln Tyr Leu Val Asn Asn Asn Leu Gly
130 135 140
Gly Asn Leu Asp Ser Thr Ser Ile Ser Lys Tyr Asp Gln Leu Val Gln
145 150 155 160
Gly Cys Leu Ser Leu Gly Ala Tyr Cys Ile Val Asp Ile His Asn Tyr
165 170 175
Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala
180 185 190
Gln Phe Thr Ser Leu Trp Ser Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Ala Ser Gln
195 200 205
Ser Arg Val Trp Phe Gly Ile Met Asn Glu Pro His Asp Val Asn Ile
210 215 220
Asn Thr Trp Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Val Thr Ala Ile Arg Asn
225 230 235 240
Ala Gly Ala Thr Ser Gln Phe Ile Ser Leu Pro Gly Asn Asp Trp Gln
245 250 255
Ser Ala Gly Ala Phe Ile Ser Asp Gly Ser Ala Ala Ala Leu Ser Gln
260 265 270
Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Val His
275 280 285
Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Thr Thr
290 295 300
Asn Asn Ile Asp Gly Ala Phe Ser Pro Leu Ala Thr Trp Leu Arg Gln
305 310 315 320
Asn Asn Arg Gln Ala Ile Leu Thr Glu Thr Gly Gly Gly Asn Val Gln
325 330 335
Ser Cys Ile Gln Asp Met Cys Gln Gln Ile Gln Tyr Leu Asn Gln Asn
340 345 350
Ser Asp Val Tyr Leu Gly Tyr Val Gly Trp Gly Ala Gly Ser Phe Asp
355 360 365
Ser Thr Tyr Val Leu Thr Glu Thr Pro Thr Gly Ser Gly Asn Ser Trp
370 375 380
Thr Asp Thr Ser Leu Val Ser Ser Cys Leu Ala Arg Lys
385 390 395

Claims (25)

1.一种用于生产乙醇的方法，该方法包括：
(a)用一种纤维素分解酶组合物使一种纤维素材料糖化；
(b)用一种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料，以产生发酵产物；其中该发酵生物是酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(Agricultural Research Culture Collection,NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)或具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物。
2.如权利要求1所述的方法，该方法包括从该发酵中回收该发酵产物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该纤维素材料经过预处理。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中该纤维素分解酶组合物包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：纤维素酶、AA9多肽、半纤维素酶、CIP、酯酶、扩张蛋白、木质素分解酶、氧化还原酶、果胶酶、蛋白酶、以及膨胀蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其中该纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β-葡糖苷酶。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中该半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡萄糖醛酸酶。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在同时糖化和发酵(SSF)中同时进行步骤(a)和(b)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中顺序进行(SHF)步骤(a)和(b)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在糖化之前，对该纤维素材料进行预处理。
10.如权利要求9所述的方法，其中该预处理是一种稀酸预处理。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物具有以下特性中的一个或多个：
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，与BSGX001相比更高的木糖消耗；
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，与BSGX001相比更高的葡萄糖消耗；
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，与BSGX001相比更高的乙醇生产。
12.具有与酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)的一样的特性的一种重组发酵生物，或具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的一种发酵生物。
13.如权利要求12所述的发酵生物，其中具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性的发酵生物具有以下特性中的一个或多个，例如所有的：
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，与BSGX001相比更高的木糖消耗；
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，与BSGX001相比更高的葡萄糖消耗；
-在1g DWC/L、35℃、pH 5.5下，48小时发酵后，与BSGX001相比更高的乙醇生产。
14.如权利要求12或13所述的发酵生物，它具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性，在实例3的方法条件下即，1g DCW/L、35℃、pH 5.5下，通过48小时发酵，提供完全的木糖消耗。
15.如权利要求12-14中任一项所述的发酵生物，它具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性，通过24小时发酵，提供完全的葡萄糖消耗。
16.如权利要求12-15中任一项所述的发酵生物，它具有与酿酒酵母CIBTS1260的大致一样的特性，48小时发酵后，提供多于30g/L乙醇，例如多于40g/L乙醇、例如多于45g/L乙醇、例如大约47g/L乙醇。
17.如权利要求12-16中任一项所述的发酵生物，它是酿酒酵母CIBTS1260(在美国伊利诺伊州(Illinois)61604农业研究机构培养物保藏中心(NRRL)登录号NRRL Y-50973下保藏)。
18.如权利要求12-17中任一项所述的发酵生物，其中该发酵生物包含编码具有木糖异构酶活性的在此的SEQ ID NO:13中示出的氨基酸序列，或编码与在此的SEQ ID NO:13至少80％，例如至少90％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％一致的氨基酸序列的一个基因(例如，在此的SEQ ID NO:20)。
19.如权利要求12-18中任一项所述的发酵生物，其中该发酵生物包含一个戊糖转运体基因。
20.如权利要求12-19中任一项所述的发酵生物，其中该戊糖转运体基因是一个GFX基因，特别是来自中间假丝酵母的GFX1，特别是在此SEQ ID NO:18中示出的一个基因。
21.如权利要求12-20中任一项所述的发酵生物，其中该发酵生物过量表达一个木酮糖激酶基因(XKS)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
22.如权利要求12-20中任一项所述的发酵生物，其中该发酵生物过量表达一个核酮糖5磷酸3-差向异构酶基因(RPE1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
23.如权利要求12-22中任一项所述的发酵生物，其中该发酵生物过量表达一个核酮糖5磷酸异构酶基因(RKI1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
24.如权利要求12-23中任一项所述的发酵生物，其中该发酵生物过量表达一个转酮酶基因(TKL1)并且过量表达一个转醛醇酶基因(TAL1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
25.如权利要求12-24中任一项所述的发酵生物，其中该发酵生物具有以下遗传修饰中的一个或多个，例如所有的：
-从牛瘤胃液获得的木糖异构酶基因(Ru-XI)，特别是在此SEQ ID NO:20中示出的一个，编码在此SEQ ID NO:13中示出的木糖异构酶；
-任选地来自中间假丝酵母的一个戊糖转运体基因(GXF1)，特别是在此SEQ ID NO:18中示出的一个；
-木酮糖激酶基因(XKS)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-核酮糖5磷酸3-差向异构酶基因(RPE1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-核酮糖5磷酸异构酶基因(RKI1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株；
-转酮酶基因(TKL1)和转醛醇酶基因(TAL1)，特别是来自酿酒酵母的一个模式株。
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