JP2002223772A - カタラーゼａ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 麹菌由来のカタラーゼＡ遺伝子のクロー
ニングが行われ、その塩基配列も決定された。また、こ
のクローニングされた上記の新規遺伝子をベクターに挿
入することにより宿主（麹菌）を形質転換した。 【効果】 形質転換体を培養することにより上記酵素を
大量に生産することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カタラーゼ遺伝子
に関するものであり、詳細には、麹菌由来の新規カタラ
ーゼ遺伝子及びその利用に関するものである。更に詳細
には、本発明は、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅ
ｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）より新規に単離したカ
タラーゼ遺伝子を用いて、カタラーゼを大量に生産さ
せ、過酸化水素分解など様々な産業分野に利用するこ
と、またはアスペルギルス症予防ワクチンの製造など
医薬分野への応用を可能にするものである。

【０００２】

【従来の技術】大気中の主要成分を担う酸素は、我々人
類を含め多くの生物が生存するために必要不可欠である
が、そのラジカル供与体である「活性酸素」は生体にと
って非常に有毒である。通常生体内では、カタラーゼ、
スーパーオキシドディスムターゼ、ペルオキシダーゼな
どの活性酸素分解酵素により活性酸素を無毒化してい
る。中でもカタラーゼは、活性酸素によって生じた過酸
化水素を水に分解する反応を触媒し、活性酸素の無毒化
に大きく貢献している。

【０００３】一方、過酸化水素水はその毒性を利用し
て、消毒剤・殺菌剤として使用されている。過酸化水素
は殺菌終了後、水で簡単に除去が可能で、また時間経過
とともに自然分解される特徴を持っているため、食品な
どの殺菌剤として広く利用されている。しかし、近年残
存する過酸化水素から発生する活性酸素が細胞の老化や
ガンを引き起こす可能性が指摘され、過酸化水素の完全
な分解・除去が求められるようになってきた。この過酸
化水素の分解にはカタラーゼが非常に有効である。カタ
ラーゼによる酵素分解は、新たな化学物質を添加するこ
となく、比較的穏和な条件で分解できるため、食品中の
残存過酸化水素の分解・除去に非常に有効であることが
示されている。カタラーゼおよびその遺伝子は、動物
（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ、ｍｏｕｓｅ）、植物（Ｏｒ
ｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、微生物（Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ｈ
ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）など様々な生物種で単離されて
いるが、いずれの酵素も、その生産性や溶解性の面で問
題があり、残存過酸化水素の分解の実用化には至ってい
ない。

【０００４】他方、近年になってエイズ（ＡＩＤＳ）患
者や臓器移植患者など免疫能力が低下した患者は、ます
ます増加の傾向にあるが、これらの患者は各種感染症に
かかりやすく、なかでも真菌症は死亡率が高いため、非
常に問題となっている。そして、これら真菌症のなかで
も特にアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）が主な原因となるアスペ
ルギルス症は最も発症率が高く、早急な対策が求められ
ている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した目
的を達成するためになされたものであって、上記したよ
うにカタラーゼが有する有用性に鑑み、カタラーゼを効
率よく生産するためになされたものであり、本発明者ら
が解決しようとする課題は、固形物である食品中の残
存過酸化水素の分解にも利用できる溶解性の高いカタラ
ーゼを、真核生物を用いて効率よく生産させることであ
る。

【０００６】更に本発明者らは、近年の真菌症の研究か
ら、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓの感染にはカタラーゼやス
ーパーオキシドディスムターゼが関与していることが報
告されており(Med, Mycol., 1999, 37(6):375-89)、ま
たアスペルギルス症の患者がカタラーゼに対して抗体を
持つことも知られている点に改めて着目し(Infect, Imm
un., 1997, Nov:65(11):4718-24.)、そこで、感染機構
に関与しているカタラーゼに対して、あらかじめ免疫
（抗体）を作りカタラーゼを分解することができれば、
真菌による感染症を未然に防ぐことができるとの新しい
観点にたち、しかも麹菌（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）とＡ．ｆ
ｕｍｉｇａｔｕｓとは近種であり、麹菌カタラーゼの
Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのワクチンとしての利用にはじ
めて着目した。

【０００７】そこで、本発明者らが解決しようとする課
題は、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓと同じＡｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ属の菌であるＡ．ｏｒｙｚａｅは安全性が認め
られた菌である点にも着目して、本菌の産生するカタラ
ーゼ及び／又はカタラーゼを含む醸造産物を用い安全性
の高いワクチンを製造することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、各方面から検討の
結果、麹菌アスペルギルス・オリゼに着目した。麹菌ア
スペルギルス・オリゼは、清酒醸造で長年使用されてき
た微生物で、非常に高いタンパク質分泌能を有する。こ
の麹菌のカタラーゼ遺伝子を単離し、麹菌で発現させる
ことができれば、非常に大量の酵素を生産させることが
できる。また麹菌は蛋白生産の宿主としての安全性は非
常に高く、麹菌を用いて生産させたカタラーゼの食品へ
の利用は非常に有効である。また麹菌が固体培養で生産
する菌体外蛋白は非常に糖鎖含量が高いことも報告され
ており、麹菌を用いれば糖含量が高い溶解性の優れたカ
タラーゼの生産も期待できる。

【０００９】そこで本発明者らは、鋭意研究の結果、カ
タラーゼをコードする遺伝子の取得、及びその塩基配列
の決定に成功し、さらに該遺伝子を含有した形質転換体
の作成、該遺伝子の発現（しかも真核生物による高発
現）、該形質転換体の培養によるカタラーゼ又はカタラ
ーゼ活性を有するタンパク質の製造（しかも大量製
造）、そしてこの酵素（又は酵素活性を有するタンパク
質）の利用を現実に確認するのに成功し、本発明の完成
に至ったものである。以下、本発明について詳述する。

【００１０】カタラーゼ遺伝子をクローニングするた
め、フスマ培養を行ったＡ．ｏｒｙｚａｅの菌体よりｍ
ＲＮＡを調製し、このｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡラ
イブラリーを構築する。このライブラリーの塩基配列を
網羅的に決定し、各配列と既知遺伝子データーベースと
のホモロジーを検索する。これらのｃＤＮＡクローンか
らカタラーゼ遺伝子と高いホモロジーを示すクローンを
検索し、本クローンからＡ．ｏｒｙｚａｅのカタラーゼ
遺伝子を単離する。

【００１１】単離した遺伝子はカタラーゼ遺伝子であっ
て、本遺伝子は、カタラーゼをコードする遺伝子、カタ
ラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、こ
れらの遺伝子の少なくともひとつを含有する遺伝子、か
ら選ばれる少なくともひとつを指すものである（以下、
単にカタラーゼ遺伝子ということもある。）。本発明に
おいては、このようにして単離したカタラーゼ遺伝子
は、これを宿主に導入して発現せしめ、カタラーゼ又は
カタラーゼ活性を有するタンパク質を製造するものであ
る。なお、本発明において、カタラーゼ活性を有するタ
ンパク質にはカタラーゼも包含されるものである。

【００１２】宿主としては、各種微生物が適宜使用可能
であるが、本発明においては真核生物を利用することが
可能であって、目的酵素を効率よく大量に生産できると
いう特徴を有する。真核生物、例えば麹菌Ａ．oｒｙｚ
ａｅは清酒、醤油、味噌などの我が国の伝統的発酵産業
で使用されてきた糸状菌である。本菌株の特徴は、上記
発酵産業で有用なタンパク質を非常に大量に生産するこ
とである。本菌株が持つ高い蛋白生産能と醸造微生物と
しての安全性から、異種蛋白生産の宿主として注目され
ている（Biotechnology, 6, 1419 (1988)、特開昭６２
−２７２９８８）。本発明者らの研究から、Ａ．ｏｒｙ
ｚａｅを用いた異種蛋白生産においては、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ属などの近種の遺伝子であれば、その生産能
はさらに増大することが認められた。特にＡ．ｏｒｙｚ
ａｅの遺伝子を、Ａ．ｏｒｙｚａｅの高発現プロモータ
ー制御下で発現させた場合、非常に大量のタンパク質が
生産されることを見いだした（特願平１１−１５４２７
１、特願２０００−３６７５４）。本発明は、この系を
利用することによって、カタラーゼ遺伝子を麹菌で効率
的に発現せしめ、カタラーゼ遺伝子を大量生産すること
にはじめて成功したものである。

【００１３】上記により単離したカタラーゼ遺伝子は、
単独で、あるいは麹菌のチロシナーゼ遺伝子（ｍｅｌＯ
遺伝子：Biochem. Biophys. Acta., 1261(1), p.151, 1
995）のプロモーターや固体培養において特異的に大量
発現する麹菌由来のグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａ
Ｂ）のプロモーター（特願平１１−１５４２７１、特開
平１１−２４３９６５）のような高発現プロモーターと
共に、Ａ．ｏｒｙｚａｅにて発現させて、高純度な目的
蛋白を大量に生産させるものである。

【００１４】遺伝子導入方法としては、常法が適宜利用
されるが、例えば宿主としては、ｎｉａＤ変異株（硝酸
を資化できない麹菌変異株：Ｎｉｔｒａｔｅ Ｒｅｄｕ
ｃｔａｓｅ欠損株、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏ
ｒｙｚａｅ １０１３−ｎｉａＤ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７
７０７）を用いる公知方法により、目的遺伝子であるカ
タラーゼ遺伝子と形質転換用マーカー遺伝子であるｎｉ
ａＤ遺伝子（S.UnkleらMol．Gen. Genet., 218, p.99-1
04, 1989）を同時に導入する。この遺伝子導入の際に、
ベクター配列などの異種遺伝子を排除することにより、
異種遺伝子を全く含まないセルフクローニング株の形質
転換体を得ることができる。そしてこの形質転換体を培
養することにより、目的蛋白を菌体内又は菌体外に大量
に分泌させることができる。

【００１５】このように本発明によれば、カタラーゼ遺
伝子をＡ．ｏｒｙｚａｅから単離するのに成功し、目的
蛋白をＡ．ｏｒｙｚａｅによって大量に生産させること
に成功したものである。そのうえ更に、該異種遺伝子を
導入する場合、Ａ．ｏｒｙｚａｅ以外の異種ＤＮＡが混
入しない方法を採用することにより、セルフクローニン
グ株となり、組換え微生物の規制からも除外されるとい
う著効が奏される。以下、本発明を更に具体的に説明す
る。

【００１６】ｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を網羅的
に決定したデータベースより、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ
のカタラーゼＡ遺伝子と相同性を示すクローンを抽出し
た。このｃＤＮＡクローンをプローブとして、Ａ．ｏｒ
ｙｚａｅのＥＭＢＬ３ファージライブラリーより、染色
体のカタラーゼ遺伝子を含むポジティブクローンを選択
した。その結果、カタラーゼ遺伝子（ｃａｔＡ）が得ら
れた。（なお、以下において、本遺伝子を単にカタラー
ゼ遺伝子ということもあり、それに係るタンパク質であ
るカタラーゼＡを単にカタラーゼということもあ
る。）。

【００１７】得られたポジティブクローンをテンペレー
トとして、カタラーゼのコーディング領域、プロモータ
ー領域、ターミネーター領域を含む全長３．２ｋｂにつ
いてその全塩基配列を決定した。その結果、カタラーゼ
遺伝子は２つのイントロンに切断された３つのエキソン
として存在していることが明らかとなった。また、遺伝
子から推定されるタンパク質のアミノ酸配列は、７４７
残基であり、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのカタラーゼ遺伝
子Ａとのホモロジーはアミノ酸レベルで８１．２％であ
った。また本遺伝子のプロモーター領域には、−１３９
ｂｐにＴＡＴＡ−ｂｏｘ（実際の配列：ＴＡＴＡＡ）が
存在していた。

【００１８】次に、この遺伝子のコーディング領域を、
Ａ．ｏｒｙｚａｅでの高発現プロモーターであるｍｅｌ
Ｏプロモーター下流に連結し、カタラーゼの麹菌での高
生産を検討した。Ａ．ｏｒｙｚａｅの遺伝子発現ベクタ
ーにカタラーゼ遺伝子のコーディング領域（ＡＴＧ下流
２．４ｋｂ）を連結し（図１０）、Ａ．ｏｒｙｚａｅの
ｎｉａＤ変異株に導入した。その結果、ｍｅｌＯプロモ
ーター制御下においてカタラーゼが培地中に分泌され、
親株の２−３倍活性が高いことが判明した。また、この
酵素蛋白を精製し、過酸化水素に対する反応を検討した
結果、分解活性が認められた。

【００１９】以上の結果より、クローニングした遺伝子
断片には、カタラーゼ活性を有する蛋白がコードされて
いることが確認できた。またこの遺伝子を用いて、カタ
ラーゼ蛋白を高生産させることが可能であり、生産され
たタンパク質は残存過酸化水素の分解の他、様々な産業
分野で応用が可能であることも確認した。

【００２０】得られた形質転換体の内、好適なもののひ
とつを、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に
ＦＥＲＭ Ｐ−１７９４４として寄託した。なお、ｍｅ
ｌＯプロモーターの塩基配列は、配列番号５（図９）に
示す。

【００２１】以上の結果より、クローニングした遺伝子
断片には、カタラーゼ活性を有する蛋白がコードされて
いることが確認された。また、該遺伝子を用いてカタラ
ーゼ活性を有する蛋白を高生産することが可能であり、
生産されたタンパク質は、酵素自体が試薬として有用で
あるだけでなく、様々な産業分野での利用が可能であ
る。

【００２２】上記により決定した該遺伝子の全塩基配列
を、配列番号２（図５、図６）に示し、その塩基配列か
ら推定されるタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１
（図１、図２、図３、図４）に示した。

【００２３】カタラーゼは、過酸化水素を分解して無害
な酸素と水を生産する。しかも本発明に係るカタラーゼ
は、多量の糖鎖が付加しており、溶解度が高いという特
徴をも有していることから、高濃度で使用することが可
能となり、したがって、食品工業、医薬品工業その他の
産業分野において消毒剤として使用した後の残留過酸化
水素の無毒化にきわめて有効である。したがって、本発
明は、本発明に係るカタラーゼを使用する過酸化水素の
分解ないし無毒化方法を提供するものであり、また、本
カタラーゼを有効成分として含有する過酸化水素の分解
剤ないし無毒化剤を提供するものである。

【００２４】更にまた、本発明に係るカタラーゼは、ア
スペルギルス症患者の血中の抗体と結合することが確認
された。アスペルギルス症の発症、感染にはアスペルギ
ルス・フミガタス由来のカタラーゼが関与していること
が報告されているところから、本発明に係るカタラーゼ
由来の抗体をヒトや動物体内に存在せしめておけば、上
記のカタラーゼと本抗体とが結合して、カタラーゼを分
解ないし不活性化ないし低活性化することが可能とな
り、結果的にアスペルギルス症の発症、感染が阻止ない
し抑制されることとなる。つまり、本発明に係る麹菌由
来のカタラーゼは、アスペルギルス・フミガタスのワク
チンとして利用することができるのである。

【００２５】ワクチンは、通常、全菌体、全ウイルス粒
子が用いられるが、本発明に係るワクチンは、カタラー
ゼを用いるポリペプチドワクチンであって、感染防御抗
原のみを含む（ないしはその含有率が非常に高い）コン
ポーネントワクチンの１種であり、ワクチンにおいては
しばしば大きな問題となる副作用がきわめて少ないとい
う著効を奏するものである。以下、本発明の実施例につ
いて述べる。

【００２６】

【実施例１】カタラーゼ遺伝子のクローニング 液体培養から得られたｍＲＮＡによるｃＤＮＡライブラ
リー（ＥＳＴライブラリー）の中より、Ａ．ｆｕｍｉｇ
ａｔｕｓのｃａｔＡに相同性の高いクローンａｃ６００
３を選択した。次に、このクローンをプローブとしてラ
ムダＥＭＢＬ３ファージを用いたアスペルギルス・オリ
ゼーＯ−１０１３株（産業技術総合研究所工学工業技術
研究所寄託 ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）の染色体ジー
ンライブラリーより、プラークハイブリダイゼーション
法によりカタラーゼ遺伝子をクローニングした。

【００２７】プローブとしては、下記に示す２種類のオ
リゴＤＮＡを合成し、次いでアスペルギルス・オリゼー
Ｏ−１０１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８）の染色体
ＤＮＡをテンペレートとしてＰＣＲを行い、反応生成物
をランダムプライムラベリング法により蛍光標識してプ
ローブとした。

【００２８】上記２種類のオリゴＤＮＡの内、一方は、
オリゴＤＮＡ＃ｃａ１であって、その塩基配列は配列番
号３（図７）に示され、他方は、オリゴＤＮＡ＃ｃａ２
であって、その塩基配列は配列番号４（図８）に示され
る。この方法により約１００００個のファージクローン
の中から、上記のプローブとハイブリダイズするクロー
ンλＣＴ１５を単離した。上記のオリゴＤＮＡをプライ
マーとしてジデオキシ法によりＤＮＡ塩基配列を決定
し、本クローンが確かに目的のカタラーゼＡ遺伝子（ｃ
ａｔＡ）であることを確認した。

【００２９】

【実施例２】カタラーゼ遺伝子の塩基配列の決定 ポジティブクローンλＣＴ１５株をテンペレートとして
カタラーゼ遺伝子の全塩基配列の決定を行った。プロモ
ーター部分、コーディング領域、ターミネーター部分を
あわせて３．２ｋｂの配列を決定した（配列番号２：図
５〜６）。上記配列の内、１の位置から５５０の位置ま
でがプロモーター部分、５５１の位置から２９１２の位
置までの領域がコーディング領域、２９１３の位置から
３２１０の位置までがターミネーター部分である。

【００３０】また、アスペルギルス・フミガタス（Ａ．
ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）のｃａｔＡとのホモロジー検索の
結果から、カタラーゼには２つのイントロンが存在し、
そのコーディング領域は２．４ｋｂｐであり、塩基配列
から推定されるタンパク質は７４７残基であることが明
らかとなった（配列番号１：図１〜４）。

【００３１】

【実施例３】アスペルギルス・オリゼーのカタラーゼを
多量に分泌生産するアスペルギルス・オリゼー形質転換
体の作成 実施例２に記載のカタラーゼ遺伝子（ｃａｔＡ）のコー
ディング領域を麹菌の高発現プロモーターであるｍｅｌ
Ｏプロモーター（その塩基配列を配列番号５（図９）に
示す）の下流に連結した。さらにこの融合遺伝子を麹菌
発現ベクターであるｐＩＮ９３のＰｓｔＩサイトに連結
したカタラーゼ発現プラスミドｐＣＡＥを作製した（図
１０）。

【００３２】このようにして構築した発現ベクターｐＣ
ＡＥをＡ．ｏｒｙｚａｅのｎｉａＤ変異株（産業技術総
合研究所生命工学工業技術研究所寄託 ＦＥＲＭ Ｐ−
１７７０７）に常法に従い導入した。硝酸資化能が回復
した株を遺伝子導入株として選択した。得られた遺伝子
導入株を、ＤＰＹ培地にて液体培養を行い、培地中のカ
タラーゼ活性を測定した（表１）。カタラーゼ活性の測
定はSchonbaumらの方法に従って行った(Schonbaum, G.
R. & Chance, B.(1976)The Enzymes(Third ed.)13, 363
-408)。

【００３３】 （表１） カタラーゼ（ｃａｔＡ）の活性測定 ──────────────────────────────── 株 培地中のカタラーゼの比活性（Ｕ／ｍｇ） ──────────────────────────────── 親株 １１４ ──────────────────────────────── 形質転換体Ｎｏ．２ ２３４ ──────────────────────────────── 形質転換体Ｎｏ．５ ３３２ ──────────────────────────────── 形質転換体Ｎｏ．９ １８１ ────────────────────────────────

【００３４】その結果、カタラーゼ遺伝子を導入した形
質転換体は、培地中に非常に高いカタラーゼ活性が認め
られた。この結果、単離したカタラーゼ遺伝子には、カ
タラーゼ活性を有する蛋白がコードされていることが確
認できた。これらの形質転換体の内、好適なもののひと
つを選び、これをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａ
ｅ ＭＥＬ−ＣＡＴＡと命名し、産業技術総合研究所生
命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１７９４４とし
て寄託した。

【００３５】

【実施例４】組み換えカタラーゼの利用 カタラーゼは、過酸化水素を分解する。以下に反応式を
示す。 ２Ｈ₂Ｏ₂ → Ｏ₂＋２Ｈ₂Ｏ

【００３６】反応式から明らかな様に、毒性のある過酸
化水素を分解して無害な酸素と水を生成する。このよう
に、消毒剤としての過酸化水素水を無毒化する事ができ
る。

【００３７】

【実施例５】高溶解性の利用 組み換えカタラーゼは、多量の糖鎖が付加しており、溶
解性が向上していた。現在市販されているカタラーゼ
は、６０％飽和硫安溶液中で大半が沈殿する。他方、本
組み換えカタラーゼは、８０％飽和硫安溶液中でも溶解
しており、高濃度でのあるいは、有機溶媒など難溶解の
溶媒に利用する事ができる。

【００３８】

【実施例６】ワクチンとして利用 本組み換えカタラーゼを精製し、イムノアッセイを行っ
た。具体的には精製した本カタラーゼと、Ａ．ｆｕｍｉ
ｇａｔｕｓのカタラーゼをＰＶＤＦ膜等に固定化し、１
次抗体としてアスペルギルス症の患者の血中の抗体を用
いた。その結果、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓのカタラーゼ
のおよそ３分の１程度の強さで、本組み換えカタラーゼ
とも結合することが判明した。抗原としての類似性が高
いことから、アスペルギルス症のワクチンに利用でき
る。

【００３９】

【発明の効果】本発明により、麹菌のカタラーゼを大量
に生産することがはじめて可能となり、過酸化水素分解
など様々な産業分野に利用すること、またアスペルギル
ス症予防ワクチンの製造など医薬分野への応用等産業上
広く利用することを可能にするものである。また本発明
は麹菌の酵素を麹菌で生産させるため、生産される酵素
蛋白は非常に安全性が高く、食品、医薬品、化粧品産業
などへも応用が可能な画期的な技術である。

【００４０】

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> Gekkeikan Inc., Ltd. <120> Catalase A Encoding Gene <130> 6368 <141> 2001-2-1 <160> 5 <210> 1 <211> 747 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 1 Met Ala Asn Ile Val Ala Gly Gly Leu His Lys Val Gln Glu Ala Val 1 5 10 15 Gln Gly Ala Ala Ser Lys Asp Lys Lys Leu Val Asp Leu Ala Pro Asp 20 25 30 Thr His Asn Val Gln Ser Ser Lys Glu Pro Leu Thr Thr Asp His Gly 35 40 45 Val Arg Ile Ser Asp Thr Asp His Trp Leu Lys Glu Val Asn Asp Asn 50 55 60 His Thr Gly Pro Met Met Leu Glu Asp Gln Ile Ala Arg Glu Lys Ile 65 70 75 80 His Arg Phe Asp His Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val His Ala Arg 85 90 95 Gly Thr Ala Ala Phe Gly Asn Phe Lys Leu His Glu Ser Ala Glu Asp 100 105 110 Val Ser Tyr Ala Gly Ile Leu Thr Asp Thr Ser Arg Asn Thr Pro Val 115 120 125 Phe Leu Arg Phe Ser Thr Val Gln Gly Ser Lys Gly Ser Ala Asp Thr 130 135 140 Val Arg Asp Val Arg Gly Phe Ala Val Lys Phe Tyr Thr Asp Glu Gly 145 150 155 160 Asn Trp Asp Leu Val Gly Asn Asn Ile Pro Val Phe Phe Ile Gln Asp 165 170 175 Ala Ile Lys Phe Pro Asp Phe Val His Ala Val Lys Pro Glu Pro His 180 185 190 Asn Glu Val Pro Gln Ala Gln Thr Ala His Asn Asn Phe Trp Asp Phe 195 200 205 Val Tyr Leu His Pro Glu Ala Thr His Met Phe Met Trp Ala Met Ser 210 215 220 Asp Arg Ala Ile Pro Arg Ser Tyr Arg Met Met Gln Gly Phe Gly Val 225 230 235 240 Asn Thr Phe Ser Leu Ile Asn Lys Glu Gly Lys Arg His Phe Val Lys 245 250 255 Phe His Phe Ile Pro His Leu Gly Val His Ser Leu Val Trp Asp Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Leu Ala Gly Gln Asp Pro Asp Phe His Arg Lys Asp Leu 275 280 285 Met Glu Ala Ile Asp Asn Gly Ala Tyr Pro Lys Trp Asp Phe Ala Ile 290 295 300 Gln Val Ile Pro Glu Glu Lys Gln Asp Asp Phe Glu Phe Asp Ile Phe 305 310 315 320 Asp Ala Thr Lys Ile Trp Pro Glu Glu Leu Val Pro Leu Arg Val Ile 325 330 335 Gly Glu Leu Glu Leu Asn Arg Asn Val Asp Glu Phe Phe Pro Gln Thr 340 345 350 Glu Gln Val Ala Phe Cys Thr Ser His Ile Val Pro Gly Ile Asp Phe 355 360 365 Ser Asp Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg Asn Phe Ser Tyr Phe Asp Thr 370 375 380 Gln Ile Ser Arg Leu Gly Ile Asn Trp Glu Glu Ile Pro Ile Asn Arg 385 390 395 400 Pro Val Cys Pro Val Leu Asn His Asn Arg Asp Gly Ala Lys Arg His 405 410 415 Arg Ile Ala Gln Gly Thr Val Thr Thr Trp Ser Asn Arg Ser Glu Ala 420 425 430 Gly Pro Pro Ala Pro Val Glu His Gly Gly Phe Ala Ser Tyr Pro Ala 435 440 445 Lys Leu Asn Gly Ile Lys Lys Arg Gly Leu Ser Pro Lys Phe Arg Glu 450 455 460 His His Asn Gln Ala Gln Leu Phe Tyr Asn Ser Leu Ser Glu His Glu 465 470 475 480 Lys Val His Val Lys Lys Ala Phe Gly Phe Glu Leu Asp His Cys Asp 485 490 495 Asp Pro Ile Val Tyr Glu Arg Leu Ala Gly His Arg Leu Ala Glu Ile 500 505 510 Asp Leu Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Glu Leu Val Gly Ala Pro Ile 515 520 525 Pro Asp Lys Ala Leu Arg Pro Asn His Gly Lys Arg Ser Lys His Leu 530 535 540 Ser Gln Thr Glu Phe Pro Gly Lys Gln Pro Thr Ile Ala Ser Arg Arg 545 550 555 560 Ile Ala Ile Ile Ile Gly Asp Gly Tyr Asp Pro Val Ala Phe Asn Gly 565 570 575 Leu Lys Gly Ala Ile Thr Ala Val Gly Ala Leu Pro Phe Val Ile Gly 580 585 590 Thr Lys Arg Ser Pro Ile Tyr Ala Asp Gly Glu Asp Lys Ser Ser Ser 595 600 605 Lys Gly Val Ile Ala Asp His Gln Tyr Asp Gly Gln Arg Ser Thr Met 610 615 620 Phe Asp Ala Thr Phe Ile Pro Gly Gly Pro His Val Glu Ser Leu Lys 625 630 635 640 Ala Asn Gly Gln Ile Arg Tyr Trp Ile Ile Glu Thr Phe Gly His Leu 645 650 655 Lys Ala Leu Gly Ala Thr Gly Glu Ala Ala Ala Phe Ile Lys Glu Ala 660 665 670 Leu Gly Ser Ala Leu Asp Val Lys Val Ala Thr Ser Asp Asn Pro Gln 675 680 685 Pro Val Glu Trp Tyr Gly Val Val Thr Ala Gly Lys Ile His Lys Pro 690 695 700 Glu Ser Phe Lys Glu Gly Ile Gln Ile Val Lys Asp Ala Lys Asp Phe 705 710 715 720 Ile Ser Thr Phe Phe Tyr Gln Ile Ser Gln His Arg Asn Tyr Lys Arg 725 730 735 Glu Leu Asp Gly Leu Ala Ser Thr Val Ala Phe 740 745 <210> 2 <211> 3210 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 2 ccccccagaa gggtccaaag gcccagtccc ttccccttcg gtcttaacaa aagacggacc 60 tttacgacgg aatttcgaag taaggggcca gggcattcgt tccctggaaa gaagagcgag 120 cttctggtgg agactctcga taagcccgat aagaaaagca ctcgactctc cttcccgatg 180 acgaagttca taaacaagga acataatcag taagaagata ttctgaccaa taccaatgga 240 ttcgaataat cattactcat catcttgtat tcttcataag agaaaacagt atcagaaaaa 300 gaaaaaaaac cagttcgatg tcaacgtgac gttcatcaac cctgcgacgt cattttgacg 360 tgcgggaccc atcacaacat ccattcagaa gtttttcatt actggaaaag ctataagaag 420 ctgaagaata atacatttct tgttctcatg caagtaatga ccgtttcatg aacatagcct 480 cgatcccacc ttaatctatc tccgactatc ttatcgtccc cataatcatc atatccatca 540 gaccccaatc atggccaata ttgtggctgg gggcctccac aaggttcaag aagcagtgca 600 gggcgctgct tccaaggata agaagctagt tgacctagca cccgacaccc ataatgtaca 660 gtccagcaag gagccactga ccaccgacca tggtgtgcgt atcagcgata cggaccactg 720 gctgaaggag gtgaatgaca accacaccgg tcctatgatg cttgaggacc agattgcacg 780 agagaaggta tgattccccg aatcggtatg ggtcagaacc atagattgaa cgaatcgcaa 840 cccagattca tcgtttcgat catgagcgca ttcccgagag agtcgtccat gcgcgtggca 900 ccgctgcatt cggaaacttc aagctccatg agagcgctga agatgtatcc tacgctggta 960 tcttgacgga tacctcaagg aacactccgg ttttccttcg tttctccacg gtccagggca 1020 gtaaaggaag tgccgacacc gtccgtgacg ttcgtgggtt tgccgtgaaa ttctacaccg 1080 acgaaggaaa ttgggatctg gttggaaaca acatccccgt tttctttatc caagatgcga 1140 ttaagttccc ggattttggt acgtacctcc tcccaactat gagtccaaaa ctctagagct 1200 aacgagtgta gtccatgctg ttaagcccga gccgcacaac gaggtaccac aggcccaaac 1260 tgctcacaac aacttctggg actttgtcta tcttcacccg gaagccaccc atatgttcat 1320 gtgggccatg tctgatcggg ccattcctcg gtcataccgt atgatgcagg gtttcggtgt 1380 caacacattc agtctcatca acaaggaagg aaagcgccat tttgtcaagt tccatttcat 1440 cccccacctg ggagtgcact ctttggtgtg ggacgaggct ctgaaactgg ctggccagga 1500 ccccgatttc catcgcaagg atctcatgga ggccattgat aacggcgcat acccgaaatg 1560 ggacttcgcc atccaggtca tccctgagga gaaacaggat gacttcgaat ttgacatttt 1620 cgacgcgacg aagatctggc ccgaggagct cgtgcctctg cgcgtgatcg gcgaactgga 1680 actgaaccgc aacgtcgacg agttcttccc tcaaaccgag caagtcgcct tctgcaccag 1740 ccacatcgtc cccggcattg acttcagtga cgacccgctt ctccagggcc gtaacttctc 1800 ctacttcgac actcagatca gtcgactggg catcaactgg gaagaaatcc ccatcaaccg 1860 ccccgtctgc cccgttctga accacaaccg agacggcgcc aaacgccacc gcatcgccca 1920 gggcactgtc actacttggt cgaaccggtc cgaggccgga ccacccgcac cagtagaaca 1980 tggtggcttc gcgtcctacc ctgcgaaact gaacggtatc aagaagcgcg gcctgagccc 2040 caagttccgc gagcaccaca accaggctca actcttctac aactctctct ccgagcacga 2100 gaaggtccac gtcaagaagg ccttcggctt cgaactggac cactgcgacg accccatcgt 2160 ctacgagcgc ctcgccggcc accgtctcgc cgagatcgat ctcactctcg cccaggaagt 2220 cgccgagctc gtcggcgccc cgatcccaga caaggcactt cgcccgaacc atggaaagcg 2280 cagcaagcat ctttcgcaga ccgagttccc gggtaagcag ccgacgatcg ccagtcgccg 2340 aatcgccatc attatcggcg acggatacga ccccgtcgct ttcaatggcc tcaagggcgc 2400 catcacggcg gttggagcct taccgttcgt cattggcacc aagcggtcac ctatctacgc 2460 cgacggtgag gacaaatcat cttccaaggg cgtgatcgcc gaccaccagt atgacggaca 2520 gcgttcgacg atgtttgacg ctaccttcat ccctggcggt ccgcacgtcg aaagcctcaa 2580 ggccaatggc cagatccggt actggatcat tgagacattc ggtcatctca aggctctggg 2640 cgccactggt gaagcggcgg ctttcatcaa ggaagccctg ggctccgcgc ttgatgtgaa 2700 ggtcgctacg tctgataacc cccagccggt tgagtggtat ggtgttgtca cggctggaaa 2760 gatccacaaa cctgagagct tcaaggaggg tatccagatt gtcaaggatg cgaaggattt 2820 cattagcacc ttcttctacc agatcagtca gcatcggaac tacaagcgtg aactggatgg 2880 cctcgcctcg acagttgcat tctaaatgct ttcgtgattg gttgaggaca tggaggcttg 2940 tgttaacgca aaagtggcat tttagttaat gtcatccttg taatgaatta tgtctctaac 3000 tgtggatggc cagaatgtac gctaatatga atcatgaaaa tactctattc taattgtgaa 3060 tgtgaaagtg aaacggcgtc gaaaggtagt tatcaatgtt atcctgaggt atctaatata 3120 caacatcttt gatattgtag gaaagaaacg taagaaagga tcgtacatag tggggtatca 3180 taatctggta cagcgtccaa ggctcggctt 3210 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 ccaagatccc aatttccttc gtcgg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 4 tatcgtcccc ataatcatca tatcc 25 <210> 5 <211> 1173 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 5 gcttgccttg gctcaaatcg ttcatgacac ccatctaggc catggcgcct gtagagcagg 60 ttacatttca tggccggtta atccgaatcc agtgcttgca catgtagcgc cacatggtct 120 gtgctattct attctgtgtt ataatagtgt gatttattgc gtttgggcgt ttcagttgat 180 tcgactggcc ttgcacatta ctctcgcatt ccacagctgg ctggaggagt tatctttact 240 tcttctttgt gactgtggct gcatgaggcg cttagtatac tatcagctga tactatgttg 300 aaactgaatc acggtgcttg aaggtctgcg tgaagtggtt cattgggctg tgatattaac 360 cgcagcctgt ctagaactat gactagacgg agcgccaaga atggacgaca acaggaatac 420 tgcccagcta gccacagctg aatcctaaag aagtttgcca gccctcgtat tcctatcctg 480 catggacggc aacattgccc tgacgagcta aattaggccg cagcgctagt attagaatga 540 actacggtag caatgagggg aacgcccaca agccaattaa cagcgctagt cttgatatga 600 cgggcctagc cttaattacg gggtactgtg aggacgttgt gcctgctgca attgtctatc 660 cgtgccgacg gtgttgacag ccactagcca ttcagctcgc cacactttca accccacacc 720 tcaaagtaag acctaaactt attttggact tccttgcagc tactatgctg tcactgttat 780 ttgactggac atgacatgca gtatcatggc gccaataaag agagtatctc gagagtttca 840 ttgcatcgta ggaaaggctt gcattccggt gttgccggga aagggatcat tggtaatgcg 900 tagttgtttt gtctagctgt gatgccgggc tttgatggac ggaggacctg gagtgcagct 960 cttcatgcaa agcccgagat agactgattt gtaacatgtg tgatgcgtat cattcattat 1020 caatacgtct cgtggatatt taagaagggc gacagtcgtg tgaatatccg ctacttcaag 1080 ttcaaaacat cattcctacg aaaaggaaaa ccacagcttc cgcttcaaag ccctagtcaa 1140 cactagttca tcttctgatt actttggttc aca 1173

【図面の簡単な説明】

【図１】カタラーゼＡのアミノ酸配列を示す。

【図２】同上続きを示す。

【図３】同上続きを示す。

【図４】同上続きを示す。

【図５】カタラーゼＡ遺伝子の塩基配列を示す。

【図６】同上続きを示す。

【図７】オリゴＤＮＡ＃ｃａ１を示す。

【図８】オリゴＤＮＡ＃ｃａ２を示す。

【図９】ｍｅｌＯプロモーターの塩基配列を示す。

【図１０】発現プラスミドｐＣＡＥの構築及びその制限
酵素地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:69） Ｃ１２Ｒ 1:69） (72)発明者 川戸 章嗣 京都市伏見区下鳥羽小柳町24 月桂冠株式 会社総合研究所内 (72)発明者 安部 康久 京都市伏見区片原町300 月桂冠株式会社 内 (72)発明者 後藤 邦康 広島県東広島市鏡山３丁目７番１号 国税 庁醸造研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA08 CA04 DA11 GA11 HA01 HA03 4B050 CC01 CC03 DD03 LL01 LL02 4B065 AA63X AA63Y AB01 BA02 CA28 CA41 CA45 CA54 4C085 AA03 BB11 CC07 DD62

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列
   を有するカタラーゼＡ活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 配列番号２の塩基配列で示される、請求
   項１に記載のタンパク質をコードする遺伝子ｃａｔＡの
   ＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡの内、少なくと
   もコーディング領域を含んでなる組換えベクター。
4. 【請求項４】 組換えベクターｐＣＡＥ。
5. 【請求項５】 請求項３及び４に記載の少なくともひと
   つの組換えベクターを麹菌に導入してなる形質転換体。
6. 【請求項６】 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ
   ＭＥＬ−ＣＡＴＡ（ＦＥＲＭ Ｐ−１７９４４）。
7. 【請求項７】 請求項５又は６に記載の少なくともひと
   つの形質転換体を利用すること、を特徴とするカタラー
   ゼＡ活性を有するタンパク質を生産する方法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のタンパク質を使用する
   こと、を特徴とする過酸化水素を分解する方法。
9. 【請求項９】 請求項１に記載のタンパク質を使用する
   こと、を特徴とするアスペルギルス症ワクチンを製造す
   る方法。