JP5020070B2 - 補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド - Google Patents

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Description

本発明は、新規な補酵素結合型グルコース脱水素酵素（以下「ＧＬＤ」と記載することがある）、これをコードするポリヌクレオチド、その取得法、該ＧＬＤの製造方法、およびこのＧＬＤの利用に関するものである。
血中グルコース量は糖尿病の重要なマーカーである。糖尿病の検査は、病院検査室等での臨床検査の他、診療スタッフ等による簡易検査や患者自身による自己検査といった簡易測定（Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ：ＰＯＣＴ）が実施されている。
この簡易測定は、グルコース診断キットやバイオセンサ等の測定装置（ＰＯＣＴ装置）によって実施されているが、従来、これらのＰＯＣＴ装置にはグルコース酸化酵素が用いられてきた。しかし、グルコース酸化酵素は溶存酸素濃度の影響を受け、計測値に誤差が生じるため、酸素の影響を受けないグルコース脱水素酵素の使用が推奨されている。
グルコース脱水素酵素には、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を補酵素とするＮＡＤ補酵素非結合型グルコース脱水素酵素と、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）等を補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素があるが、補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、ＮＡＤ補酵素非結合型グルコース脱水素酵素に比べ夾雑成分の影響を受けにくいこと、測定感度が高いこと、更に原理上、ＰＯＣＴ装置を安価に製造することが可能であるという利点を有している。
しかしながら、従来のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）型グルコース脱水素酵素は安定性が低く、しかもマルトースやガラクトースにも反応してしまうという欠点を有している。マルトースは輸液に用いられる糖であり、ＰＱＱグルコース脱水素酵素がマルトースと反応すると血糖ＰＯＣＴ装置は実際より高い血糖値を表示してしまう。このため、患者が不必要なインシュリン注射を行ってしまう結果、意識障害や昏睡状態に陥る等の低血糖事故が発生し、大きな問題となっている。
特に現在の血糖ＰＯＣＴ装置の用途としては、単に簡易的に血糖を測る目的から、さらに患者の自己管理および治療の一手段としての重要性が高まっており、そのために使用される自己血糖測定装置（Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ：ＳＭＢＧ）の家庭への普及は拡大の一途を辿っていることから、測定精度への要求性は非常に高いと考えられる。
現に、２００５年２月には、日本において、厚生労働省よりマルトース輸液を投与中の患者に対して、補酵素としてＰＱＱを利用している酵素を用いた血糖測定器の使用に関し、注意を喚起する通達が出されている（２００５年２月７日；薬食安発第０２０７００５号など）。
一方、グルコースの脱水素反応を触媒し、ＦＡＤを補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素としては、Agrobacterium tumefaciens由来(J. Biol. Chem. (1967) 242 : 3665-3672)、Cytophaga marinoflava由来(Appl. Biochem. Biotechnol. (1996) 56 : 301-310)、Halomonas sp.α-15由来(Enzyme Microb. Technol. (1998) 22 : 269-274)、Agaricus bisporus由来(Arch. Microbiol.(1997)167:119-125、Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999)51:58-64)およびMacrolepiota rhacodes由来(Arch. Microbiol.(2001)176:178-186)の酵素が報告されているが、これらの酵素はグルコースの２位及び／または３位の水酸基を酸化し、いずれもマルトースに対する作用性が高く、グルコースに対する選択性が低い。また、同じくマルトースへの作用性が高い、ブルクホルデリア・セパシア（Burkhorderia cepacia）由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素も知られているが、これは本来の天然型の酵素がα、β、γの３種のサブユニットからなるヘテロオリゴマー酵素で、膜結合性酵素として知られている。したがって、酵素を得るには可溶化の処理が必要であったり、クローニングで十分な活性を発現させる為には、必要なサブユニットを同時にクローニングしなければならない等の課題があった。
更に、日本生物工学会大会（２００２年１０月２８日−３０日）での発表によれば、基質特異性（対グルコース活性を１００％とした場合の対マルトース活性、対ガラクトース活性）は、ＳＭ４株が４０％、１０５％、ＪＣＭ５５０６株が４３％、１３２％、ＪＣＭ５５０株が５７％、１２３％、ＪＣＭ２８００株が８３％、１０８％、ＪＣＭ２８０１株が７４％、１１７％、ＩＦＯ１４５９５株が３８％、１０４％、ＩＦＯ１５１２４株が７４％、１４８％であり、演者によれば、マルトースへの作用性が高いため、自己血糖測定器に使うには問題があり、今後配列を変えて基質特異性を改良したいとの発表内容だった。
これに対して、本発明者らは、ＦＡＤを補酵素とする、膜結合型ではない新規な可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を発明し、特許出願している（特許文献１）。この特許文献１の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、グルコースの１位の水酸基を酸化し、グルコースに対する基質認識性に優れ、溶存酸素の影響を受けず、しかもマルトースに対する作用性が低い（対グルコース活性を１００％とした場合の対マルトース活性は５％以下、対ガラクトース活性も５％以下）というこれまでに無い優れた特性を有するものである。
しかしながら、この特許文献１の補酵素結合型グルコース脱水素酵素は、野生の微生物（例えばアスペルギルス属微生物など）の液体培養物から単離、抽出されたものであり、その生産量には限りがあった。また、酵素生産量が極微量である上に、糖が多量に酵素に結合し、通常の酵素に結合しているＮ型やＯ型糖鎖とは異なる種類の糖に覆われた‘糖包埋型酵素’とでも言うべき形態となっていることにより、その活性を検出しにくいこと（酵素活性が低い）、糖鎖を酵素的あるいは化学的に除去できないこと、その結果、電気泳動において、通常のタンパク質染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０等による）によりほとんど染色されず、遺伝子取得に必要な情報である酵素のアミノ末端や内部のアミノ酸配列を解読することも通常の精製酵素からでは難しく、これまで酵素遺伝子のクローニングに成功し、本酵素活性の発現を確認した事例は無かった。
アスペルギルス・オリゼ由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素については１９６７年にその存在が示唆されたことがあったが（非特許文献１）、部分的に酵素学的性質が明らかにされたのみで、マルトースに作用しないという特性は示唆されていたにも関わらず、それ以降はアスペルギルス・オリゼ由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素に関する詳細な報告はもちろんその他微生物由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素についても、グルコースの１位の水酸基を酸化する酵素については続報が無く、補酵素結合型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列や遺伝子に関する報告も全く知られていなかった。
また、グルコースデヒドロゲナーゼＥＣ １．１．９９．１０をグルコース測定に用いるアイデアは知られていたが（特許文献１５参照）、補酵素結合型グルコース脱水素酵素が実用的なレベルで生産されたことはなく、実際にセンサに利用され実用化されるには至っていなかった。その理由は、本酵素の菌体内での活性は微弱であり、菌体外に分泌されてもその量は極僅かで、しかも多量の糖に覆われており活性が弱く、検出するのさえ困難であったために、遺伝子をクローニングできなかったためと推察される。
また、グルコース酸化酵素を用いたセンサにおいて、酵素の糖鎖がグルコース測定時に影響を与え、糖鎖の多いカビ由来酵素のグルコースセンサへの利用は困難であることが知られていた（非特許文献２）が、アスペルギルス属微生物の固体培養において産生酵素の糖含量が液体培養時に比べて増加する（非特許文献３）など、一般的に、液体培養より固体培養の方が糖鎖がより多くなることが知られていた。このため、培養条件などを検討しても、カビ由来グルコース脱水素酵素の糖鎖を減らしてグルコースセンサへの利用を可能にすることは困難だったことも、これまでに補酵素結合型グルコース脱水素酵素が実用化されなかった理由であると推察される。
現に我々も、アスペルギルス・テレウス由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素を精製したが、その酵素は多量の糖に覆われ、‘アラビノガラクタン包埋型酵素’とでも言うべき形態となっていることにより、それを電極上に塗布、乾燥させて固定化酵素電極を作成する際には、乾燥性が悪いという問題が生じることに加え、糖がグルコースセンサとしての反応性を低下させる原因になっていることを見いだした。
酵素等のタンパク質を大量に生産するためにはタンパク質をコードする遺伝子材料を用いた遺伝子工学的方法が知られているが、グルコース脱水素酵素の遺伝子工学的作成に関しては特許文献２〜１４の従来技術が知られている。これらの従来技術は、主にＰＱＱグルコース脱水素酵素の改変に関するものであり、基質特異性の低さや安定性の低さといった従来のＰＱＱグルコース脱水素酵素の欠点を改良するための改変型ＰＱＱグルコース脱水素酵素と、それを遺伝子工学的に作成するための改変型遺伝子材料を提供している。
ＷＯ２００４／０５８９５８号パンフレット 特開２０００−３１２５８８号公報 特開２０００−３５０５８８号公報 特開２０００−３５４４９５号公報 特開２００１−１９７８８８号公報 特開２００１−３４６５８７号公報 特開２００１−３７４８３号公報 特開２００４−１７３５３８号公報 特開２００４−３１３１７２号公報 特開２００４−３１３１８０号公報 特開２００４−３４４１４５号公報 特開平１０−２４３７８６号公報 特表２００４−５１２０４７号公報 ＷＯ２００２／０７２８３９号パンフレット 特開昭５９−２５７００号広報 Biochem.Biophys.Acta.,139,277-293,1967 Appl Environ Microbiol., 64(4), 1405-1411, 1998 Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(10), 1938-1946, 1998
しかしながら、改変型遺伝子材料を用いて作成した改変型ＰＱＱグルコース脱水素酵素の場合には、依然としてグルコースに対する作用性を１００％とした際のマルトースへの作用性が概ね１０％以上と高かったり、あるいはマルトースへの反応性を低くさせた結果として、本来のグルコースへの反応性（比活性）までもが落ちてしまい、基質十分量の条件で電気化学的な測定法で活性を見るとグルコースセンサとしての機能は不充分で、ＰＯＣＴ装置等への使用には至っていないのが実情である。
また、ＰＱＱグルコース脱水素酵素の活性発現に必要な補酵素ＰＱＱは、広く一般的に組換え宿主として用いられる大腸菌では作られず、ＰＱＱを生産する宿主微生物（シュードモナス等）に限定して組換え体を作らなければならないという問題もあった。
本発明は、以上のとおりの従来技術における問題点に鑑みてなされたものであり、酵素に付加した多量の糖の問題を解決し、且つ、グルコースに対する反応性、熱安定性、基質認識性に優れ、しかもマルトースに対する作用性が低いという優れた特性を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれを大量にかつ簡単に製造する方法、該酵素をコードするポリヌクレオチド及びその取得法、該酵素を用いたグルコース測定方法、グルコース測定試薬組成物、グルコース測定用バイオセンサを提供することを課題としている。
本発明者らは、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を広く産業上利用するためには、酵素に付加した多量の糖鎖をグルコース測定に応用できるレベルにまで減らすことに加えて、実用的なコストで提供できる、マルトースに作用しないグルコース脱水素酵素の遺伝子クローニングによる大量生産が必要であると考えた。遺伝子クローニングを行うには、酵素のアミノ末端及び内部のアミノ酸の配列を解読し、遺伝子取得に必要な情報を得ることが不可欠であり、その為にはこれまで遺伝子クローニングの成功を妨げていた、通常のＮ型、Ｏ型糖鎖とは異なる、酵素を包埋している多量の糖を除去し、タンパク質の染色性を改善するとともにＨＰＬＣにより分析を可能にする必要があると考え、タンパク質の染色およびＨＰＬＣによる分析を困難にしていた原因である、酵素を包埋している糖を除去した精製酵素の取得に鋭意取り組んだ。その結果、固体培養を行うことにより、目的とする酵素を包埋している糖を低減し、そのアミノ酸配列を明らかにして遺伝子を取得できることを見いだした。
本発明は、前記の課題を解決するものとして、電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とする可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）をコードするポリヌクレオチド（以下、「ＧＬＤポリヌクレオチド」と記載することがある）を提供する。
このポリヌクレオチドは、さらに具体的には、下記（１）〜（７）のポリヌクレオチドである。
（１）配列番号１で表される塩基配列からなり、かつ
電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
（２） 配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ
電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
（３） 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ
電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
（４） 配列番号２のアミノ酸配列からなり、かつ電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
（５） 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
（６） 配列番号２の第２０−５９２番目のアミノ酸配列からなり、かつ電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
（７） 配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
その他のポリヌクレオチドとして、以下が挙げられる。
（８） 電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号８−１２に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記１）から４）の性質：
１）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、
２）酸素を電子受容体としない、
３）グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である、および
４）グルコースの１位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードし、かつ配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同一性が６０％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（９） 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同一性が７０％以上の塩基配列からなる前記（８）に記載のポリヌクレオチド。
（１０） 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同一性が８０％以上の塩基配列からなる前記（８）に記載のポリヌクレオチド。
（１１） 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る前記（８）に記載のポリヌクレオチド。
（１２） 電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号８−１２に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記１）から４）の性質：
１）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、
２）酸素を電子受容体としない、
３）グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である、および
４）グルコースの１位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
（１３） 前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる前記（１２）に記載のポリヌクレオチド。
（１４） 前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる前記（１２）に記載のポリヌクレオチド。
（１５） 電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、配列番号２の第２０−５９２番目のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号８−１２に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列を有し、かつ下記１）から４）の性質：
１）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、
２）酸素を電子受容体としない、
３）グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である、および
４）グルコースの１位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する、
を有する可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
（１６） 前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号２の第２０−５９２番目のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
（１７） 前記補酵素結合型グルコース脱水素酵素が、配列番号２の第２０−５９２番目のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
また、（Ｅ）配列番号５〜７に記載の、補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする塩基配列のコンセンサス配列から選ばれる１種又は２種以上の部分塩基配列を有し、かつ以下のａ〜ｄの性質を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドである。
ａ．サブユニット分子量：約６３ｋＤａ
ｂ．補酵素：ＦＡＤ
ｃ．グルコースの１位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する
ｄ．グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である
ただし、性質ａのサブユニット分子量とは、シグナルペプチド部分を含む、あるいは含まないＧＬＤポリヌクレオチドを組み込んだ原核細胞由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した際のサブユニット分子量であり、５８ｋＤａから６３ｋＤａを示す。また、同様に真核細胞由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素では、５８ｋＤａから１５０ｋＤａを示す。
また、（Ｆ）配列番号８−１２に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列から選ばれる１種又は２種以上の部分アミノ酸配列を有し、かつ以下のａ−ｄの性質を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドである。
ａ．サブユニット分子量：約６３ｋＤａ
ｂ．補酵素：ＦＡＤ
ｃ．グルコースの１位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する
ｄ．グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である
ただし、性質ａのサブユニット分子量とは、シグナルペプチド部分を含む、あるいは含まないＧＬＤポリヌクレオチドを組み込んだ原核細胞由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した際のサブユニット分子量であり、５８ｋＤａから６３ｋＤａを示す。また、同様に真核細胞由来の補酵素結合型グルコース脱水素酵素では、５８ｋＤａから１５０ｋＤａを示す。
このＧＬＤポリヌクレオチドによりコードされるＧＬＤは、フラビン化合物（フラビンアデニンジヌクレオチド）を補酵素とし、電子受容体存在下でグルコースの１位の水酸基を酸化する反応を触媒するという理化学的性質を有する酵素である。またこのＧＬＤはマルトースへの作用性が５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下であり、終濃度５ｍＭの１，１０−フェナントロリンで５０％以上阻害され、好ましくは２ｍＭの１，１０−フェナントロリンで５０％以上阻害され、より好ましくは１ｍＭの１，１０−フェナントロリンで５０％以上阻害される。サブユニット構造はホモ２量体であるが、単量体でも活性型の場合がある。
また、このＧＬＤポリヌクレオチドによりコードされるＧＬＤは、含有するガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノースの合計含有量が、野生型とは異なり、タンパク質１ μｇあたり合計８０ μｇ以下、好ましくは１０ μｇ以下、より好ましくは２ μｇ以下、さらにより好ましくは０．５ μｇ以下である。
さらにこのＧＬＤポリヌクレオチドよりコードされるＧＬＤは、含有するガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノースの合計含有量が、野生型とは異なり、酵素活性１ ｕｎｉｔあたり合計４０ μｇ以下、好ましくは１０ μｇ以下、より好ましくは２ μｇ以下、さらにより好ましくは０．５ μｇ以下である。
また、このＧＬＤポリヌクレオチドによりコードされるＧＬＤは、サブユニット分子量は約６３ｋＤａであり、補酵素はフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）であり、グルコースの１位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である。
かかるＧＬＤポリヌクレオチドは、具体的には、糸状菌、または担子菌、例えばアスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、またはガノデルマ（Ganoderma）属の微生物、特に、アスペルギルス・テレウス（A.terreus）から単離されたポリヌクレオチドである。
本発明のＧＬＤポリヌクレオチドの具体的な態様は、配列番号１の塩基配列、または配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤをコードするポリヌクレオチドである。
また、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相同性が６０％以上の塩基配列からなり、かつ補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤをコードするポリヌクレオチドを提供する。
なお「配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相同性が６０％以上の塩基配列」とは、配列番号１の塩基配列において、その全長にわたり、配列番号１の塩基配列に対して少なくとも６０％の同一性を示し、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列をいう。このような塩基配列の同一性パーセンテージは、基準配列（本発明では配列番号１）を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開または市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）などを用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
また、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤをコードするポリヌクレオチドを提供する。
このヌクレオチド配列がコードするＧＬＤのうち、最初のＭｅｔから１９番目のアミノ酸Ｌｅｕまではシグナルペプチドであり、この部分をコードするポリヌクレオチドは、生物種、又は、用いる宿主ベクター系により、それぞれ適切なものに置換するか、もしくは除去されたポリヌクレオチドであってもよい。
また、かかるポリヌクレオチドの取得法であって、ＧＬＤ産生能を有する微生物を固体培養し、得られる酵素の情報をもとに遺伝子をクローニングするＧＬＤをコードするポリヌクレオチドの取得法を提供する。用いる微生物は、アスペルギルス属に属する１以上の菌株であること、特にアスペルギルス・テレウス（A.terreus）であることが好ましい。
さらに、本発明は、上記いずれかのポリヌクレオチド塩基配列によってコードされるＧＬＤを提供する。本発明のＧＬＤのより具体的な態様は、電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性のＧＬＤである。
また、下記１）から４）の性質を有する。
１）フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする。
２）サブユニット構造がホモ２量体である。
３）酸素を電子受容体としない。
４）グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下である。
あるいは、下記１）から３）の性質を有する。
１）フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする。
２）酸素を電子受容体としない。
３）グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下である。
あるいは、下記１）から４）の性質を有する。
１）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、
２）酸素を電子受容体としない、
３）グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である、および
４）含有するガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノースの含有量がタンパク質1 μgあたり合計で８０ μｇ以下である
あるいは、下記１）から４）の性質を有する。
１）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、
２）酸素を電子受容体としない、
３）グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である、および
４）含有するガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノースの含有量が酵素活性１ ｕｎｉｔあたり合計で４０ μｇ以下である、
あるいは、下記の性質を有する。
ａ．サブユニット分子量：約６３ｋＤａ
ｂ．補酵素：ＦＡＤ
ｃ．グルコースの１位の水酸基を酸化し、グルコースをグルコノ−δ−ラクトンに変換する反応を触媒する
ｄ．グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である
かかるＧＬＤは、糸状菌、好ましくはアスペルギルス属に属する１以上の菌株、特に好ましくはアスペルギルス・テレウスから単離されたものである。
本発明のＧＬＤのさらに具体的な態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなり、かつ補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素するＧＬＤである。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤを提供する。
その他、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤを提供する。従来、ショウジョウバエの補酵素結合型グルコース脱水素酵素は公知であったが（Proc. Natl. Acad. Sci. 1983 October; 80: 6286-6288. "Biphasic expression and function of glucose dehydrogenase in Drosophila melanogaster."）、配列番号２で表されるアミノ酸配列との相同性は２８〜２９％であった。また、かかる昆虫由来の酵素は昆虫細胞以外では発現し難く、生産性が極めて悪いため、産業上利用することは困難であった。配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる酵素は、大腸菌等での発現が可能であるため、容易に産業用酵素として用いることができる。
また、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＧＬＤをコードするポリヌクレオチドを提供する。
なお「配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２のアミノ酸配列において、その全長にわたり、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の同一性を示し、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をいう。このようなアミノ酸配列の同一性パーセンテージは、基準配列（本発明では配列番号２）を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開または市販されているソフトウェアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）などを用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
また、本発明は、小麦フスマまたはオートミールなどを培地成分に用いた固体培養物中に、上記いずれかのＧＬＤを産生する微生物を存在せしめ、それにより該培養物中に当該ＧＬＤを産生させ、採取することを特徴とする当該ＧＬＤの製造方法および当該方法により製造されたＧＬＤを提供する。
本発明は、さらに、前記のように本発明によって提供されるポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドを保有する組換えベクター、組換えベクターを用いることによって作成された形質転換細胞、形質転換細胞を培養し、培養物からグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤを採取することを特徴とする当該ＧＬＤの製造方法、および当該方法によって得られたＧＬＤを提供する。
かかる方法により得られるＧＬＤは、これに糖鎖が結合していないか、結合している場合でもそれは通常のＮ型、Ｏ型糖鎖であり、その結合量も野生型の糖結合量と比較して少なく、糖鎖の除去も容易で高い活性を示すものである。
また、本発明は、配列番号２の第２０−５９２番目のアミノ酸配列、またはこのアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、上記ＧＬＤと同等の機能を有し、かつペプチド合成法又は遺伝子組換え法によって得られるＧＬＤを提供する。
本発明は、さらにまた、前記のように、本発明によって提供されるＧＬＤを使用することを特徴とするグルコースの測定方法、本発明によって提供されるＧＬＤを含有することを特徴とするグルコース測定試薬組成物、並びに本発明によって提供されるＧＬＤを使用することを特徴とするグルコース測定用のバイオセンサをそれぞれ提供する。これらの発明は、使用に際し、電子受容体、特にフェリシアン化物を終濃度２ｍＭ−５００ｍＭで用いることを好ましい態様としている。
なお、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン三リン酸）；またはｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸））が１００個以上結合した分子を言い、具体的にはＧＬＤをコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ及び、それらを鋳型としてＰＣＲ増幅したポリヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド」とはヌクレオチドが２−９９個連結した分子を言う。また「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）または非天然の残基連結によって互いに結合した３０個以上のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、さらには、これらに糖鎖が付加したものや、人工的に化学的修飾がなされたもの等も含む。
この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ， １９９５などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法に基づき実施可能である。さらに、この発明における用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
本発明の酵素は、天然型酵素における多量の糖をグルコースセンサに利用できるレベルにまで減らし、グルコースに対する基質認識性に優れ、しかもマルトースに対する作用性が低いという優れた特性を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素（ＧＬＤ）である。また、本発明の酵素の製造方法を用いれば、かかる酵素を均質かつ大量に生産することが可能となる。
また、このように人工生産されたＧＬＤは、ＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する補酵素結合型グルコース脱水素酵素で問題となっていた糖の量を目的に応じてコントロールできるため、糖含量を減らした酵素を調製することで、血糖測定などにおいて、試料中の糖（グルコースなど）に対する作用性を変えることも可能である。
本発明におけるＧＬＤは、血糖の測定において実質的にマルトースに作用しないことから、より高精度なＳＭＢＧ装置にも利用することができ、糖尿病患者の自己管理・治療に大きく資する。
酵素を糖鎖切断し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、糖鎖染色した図である。 酵素を糖鎖切断し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した図である。 酵素を糖鎖切断し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによる電気泳動を行い、活性染色を行った図である。 電子受容体としてオスミウム錯体を使用し、酵素のセンサ特性（二分子反応速度定数）を測定した結果を示す。 電子受容体としてキノン化合物を使用し、酵素のセンサ特性（二分子反応速度定数）を測定した結果を示す。 酵素固定化電極を用い、Ｄ−グルコースを定量した結果を示す。
本発明のＧＬＤポリヌクレオチド（遺伝子）は、電子受容体存在下で、グルコースを酸化する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下であることを特徴とする可溶性のＧＬＤをコードするポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、さらに具体的には、上記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかの性質を有することを特徴とするＧＬＤポリヌクレオチドである。
本発明のＧＬＤポリヌクレオチドの最も具体的な態様は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは糸状菌、例えばアスペルギルス属の、特にアスペルギルス・テレウス（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７８）由来のＧＬＤポリヌクレオチドであり、配列番号２のアミノ酸配列を有するＧＬＤをコードしている。
このＧＬＤポリヌクレオチドは、例えばアスペルギルス・テレウス（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７８）からｃＤＮＡライブラリーを調製し、当該ＧＬＤのＮ末端及び内部配列のアミノ酸をエドマン法等によって決定し、このアミノ酸配列に基づいて作成した複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。
なお、小麦フスマ、オートミール等を含有する固体培養物中に、本発明のＧＬＤを産生し得る微生物、例えばアスペルギルス属に属するアスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ジャポニカス（A.japonicus）、アスペルギルス・オリゼー（A.oryzae）等１種以上の菌株を添加し、該培養物中からＧＬＤを採取したものは、ＧＬＤに結合した糖鎖の量が少なく、容易に糖鎖を除去してＧＬＤを精製できることから、ＧＬＤのＮ末端及び内部配列を決定するにあたって、固体培養して得られるＧＬＤを用いることが好ましい。
小麦フスマを用いる場合、例えば、小麦フスマ４０〜７０質量％含有液を滅菌した後、種培養液０．５〜２質量％を添加して、室温付近で培養し、得られた培養菌体からＧＬＤ粗酵素を抽出すればよい。また、オートミールを用いる場合、例えば、オートミール４０〜７０質量％含有液を滅菌した後、種培養液０．５〜２質量％を添加して、室温付近で培養し、得られた培養菌体からＧＬＤ粗酵素を抽出すればよい。
またプローブの標識は、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法または非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ ＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することができる。
あるいはまた、アスペルギルス・テレウス（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７８）のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記で作成したオリゴヌクレオチドプライマー（プローブ）のセットを用いたＰＣＲ法によって、もしくはアスペルギルス・テレウス（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７８）から抽出した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても目的のＧＬＤ遺伝子を得ることができる。また、配列番号１の５’側の１プライマーを用いた５’ＲＡＣＥ法によってｃＤＮＡの上流を、配列番号１の３’側の１プライマーを用いた３’ＲＡＣＥ法によってｃＤＮＡの下流部分をＰＣＲ増幅することもできる。なお、プライマーを設計する場合には、プライマーのサイズ（塩基数）は鋳型ＤＮＡとの間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、１５−４０塩基、望ましくは１５−３０塩基である。ただし、ＬＡ（ｌｏｎｇ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ）ＰＣＲを行う場合には、少なくとも３０塩基が効率的である。センス鎖（５’末端側）とアンチセンス鎖（３’末端側）からなる一組あるいは一対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けるようにする。さらに、鋳型ＤＮＡとの安定な結合を確保するためＧＣ含量を約５０％にし、プライマー内においてＧＣ−ｒｉｃｈあるいはＡＴ−ｒｉｃｈが偏在しないようにする。アニーリング温度はＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に依存するので、特異性の高いＰＣＲ産物を得るため、Ｔｍ値が５５−６５℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１から約１μＭになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウエア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることもできる。
なお、前記のオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーセットは、例えば前記ＧＬＤ ｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断して作成することもでき、あるいは文献（例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ４７：４１１−４１８； Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５：６６１； Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２５：３４４０−３４４４； Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９：３７３−３８０； Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６； Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０； Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９； Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９； 米国特許第４，４５８，０６６号）に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。
本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号１と６０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、上記補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤをコードするものであってもよい。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１における１または複数個の塩基が欠失、置換又は付加されており、かつ上記補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤをコードするものであってもよい。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に示した塩基配列に相補的なＤＮＡ、配列番号１に示した塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ上記補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤをコードするものであってもよい。
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号５〜７に記載の、補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする塩基配列のコンセンサス配列から選ばれる１種又は２種以上の部分塩基配列を有するものであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号８−１２に記載の補酵素結合型グルコース脱水素酵素コンセンサス配列から選ばれる１種又は２種以上の部分アミノ酸配列を有する酵素をコードするものであってもよい。かかるコンセンサス配列（アミノ酸配列）を有する酵素は、本発明のＧＬＤの活性を有する場合が多く、かかる部分が本発明酵素の活性中心を形成しているものと推測される。
なお、配列番号８の３つのＸａａにおいて、一番左側のＸａａはＡｌａ又はＧｌｙを表し、左から２番目のＸａａはＡｌａ又はＶａｌを表し、一番右側のＸａａはＩｌｅ又はＶａｌを表す。また、配列番号９の４つのＸａａにおいて、一番左側のＸａａはＡｌａ又はＶａｌを表し、左から２番目のＸａａはＩｌｅ又はＬｅｕを表し、左から３番目のＸａａはＡｌａ又はＳｅｒを表し、一番右側のＸａａはＧｌｕ又はＧｌｎを表す。また、配列番号１０の３つのＸａａにおいて、一番左側のＸａａはＡｌａ又はＬｅｕを表し、左から２番目のＸａａはＩｌｅ又はＬｅｕを表し、一番右側のＸａａはＩｌｅ又はＶａｌを表す。また、配列番号１２の３つのＸａａにおいて、一番左側のＸａａはＡｌａ又はＳｅｒを表し、左から２番目のＸａａはＡｓｎ又はＳｅｒを表し、一番右側のＸａａはＩｌｅ又はＶａｌを表す。
このようなＧＬＤ類似酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、前記のアスペルギルス・テレウス由来のＧＬＤ ｃＤＮＡを、公知のミューテーション導入法や変異導入ＰＣＲ法等によって改変して作成することができる。あるいはまた、アスペルギルス・テレウス以外の微生物等のゲノムＤＮＡやそのｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１のヌクレオチド配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドを用いるプローブハイブリダイゼーション法によって取得することができる。ハイブリダイゼーションに際して、ストリンジェント条件を様々に変化させることによって、前記のとおりのＧＬＤ類似酵素をコードするポリヌクレオチドを取得することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によって規定され、例えば、米国特許Ｎｏ．６，１００，０３７等に開示されているような、当業者らに周知の様々な条件を採用することができる。
より具体的なハイブリダイゼーションの条件としては、たとえば５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）溶液、０．１％ ＳＤＳ、１０％ デキストラン硫酸および１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、ついでフィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄するなどを例示することができる。
ＧＬＤ類似酵素をコードするポリヌクレオチドを取得するための微生物等としては、微生物の種や属に限定されず、野生株または変異株のいずれの微生物でもあり得る。例えば、特許文献１に開示されている微生物等を例示することができる。
本発明の組換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡまたはそのＯＲＦ領域をインサートとしてＧＬＤやその類似酵素を生産する場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。
本発明の形質転換細胞は、例えば、ＧＬＤやその類似酵素を大量製造する場合には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。組換えベクターおよび形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示した組換えベクターｐＣＧＬＤと、このベクターによる形質転換大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＧＬＤ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２４３）が挙げられる。
本発明のＧＬＤは、上記ＧＬＤポリヌクレオチドの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。具体的には、電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素であり、さらに、上記（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかの性質を有することが好ましい。
本発明のＧＬＤのより具体的な態様は、含有する糖（ガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノース）の含有量がタンパク質１μgあたり合計で８０μｇ以下であるか、又は含有する糖（ガラクトース、グルコース、マンノース、アラビノース）の含有量が酵素活性１ ｕｎｉｔあたり合計で４０μｇ以下である。これらの糖は、縮重合して多糖類を形成し、酵素の周囲を被覆している。したがって、これら糖類の含有量がタンパク質１μgあたり合計で８０μｇ以下であるか、又は酵素活性１ ｕｎｉｔあたり合計で４０μｇ以下であれば、高活性の酵素が得られるため好ましい。
また、本発明のＧＬＤのより具体的な態様は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる。さらに、本発明のＧＬＤは、配列番号２と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤ類似酵素であってもよい。さらに、本発明のＧＬＤは、配列番号２における１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ補酵素、特にＦＡＤと結合してグルコースを脱水素する作用を有するＧＬＤ類似酵素であってもよい。さらに、本発明のＧＬＤは、配列番号２の第２０−５９２番目のアミノ酸配列、またはこのアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有し、上記のポリペプチドと同等の機能を有し、かつペプチド合成法又は遺伝子組換え法によって合成されたポリペプチドである。
このようなＧＬＤは、例えば配列番号２のアミノ酸配列またはその類似配列に基づいて、公知のペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｒ．Ｂ． Ｊ． Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉ． Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ． Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５， ２１４９−２１５４， １９６３； Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｃｈａｎ， Ｗ．Ｃ． ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ， Ｐ．Ｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２０００）によって作成することができる。また、これらのペプチドは天然のアミド結合以外の残基連結からなるものであってもよい。天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−に対する−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ （１９８３） ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． ７， ｐｐ ２６７−３５７， “Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，” Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ， ＮＹを参照）。
また、ＧＬＤは、前記のＧＬＤポリヌクレオチド（ｃＤＮＡまたはその翻訳領域）を用いた組換えＤＮＡ技術によって取得できる。例えば前記のポリヌクレオチドを有するベクターからｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を行うことによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＧＬＤを作成することができる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしているＧＬＤを大量に発現させる事ができる。糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができる。
ＧＬＤをｉｎ ｖｉｔｒｏ発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加すれば、ＧＬＤをｉｎ ｖｉｔｒｏで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６などが例示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。
ＧＬＤを大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、ＧＬＤを微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含むＧＬＤ断片を得ることもできる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによっても目的とするＧＬＤを取得することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。
ＧＬＤを、真核細胞で発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、ＧＬＤを真核細胞内で生産することができる。プラスミドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組みこませて維持することもできる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質としてＦＡＤ−ＧＬＤポリペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ−７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カビ、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、ＧＬＤを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
ＧＬＤを原核細胞や真核細胞で発現させた後、培養物（菌体、もしくは菌体外に分泌された酵素を含む培養液、培地組成物等）から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、熱処理、ｐＨ処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法およびＵＫＣ１に特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含む）、などが挙げられる。
以上のとおりの方法によって作成された本発明のＧＬＤは、以下の特性を有している。
（１）作用：国際生化学連合（ＩＵＢ）の分類でＥＣ １．１．９９．１０に該当する酵素であり、電子受容体存在下でグルコースの１位の水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応（グルコース ＋ 電子受容体 → グルコノ−δ−ラクトン ＋ 還元型電子受容体）を触媒する。
なお、電子受容体として例えばフェナジンメトサルフェート、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、フェリシアン化合物、オスミウム化合物、キノン化合物などが挙げられ利用できる。
（２）基質特異性：Ｄ−グルコースには強く作用し、Ｄ−マンノース、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、Ｄ−セロビオース、Ｄ−トレハロース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−フルクトースには弱く作用する。また、Ｌ−アラビノース、ラクトース、Ｄ−ソルビトール、グルコン酸、スクロース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ソルボース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−ラフィノース、エタノール、グリセロールにはほとんど作用しない。
（３）阻害剤：１，１０−フェナントロリンで６０％以上阻害される。
（４）補酵素：フラビンアデニンジヌクレオチド
（５）至適ｐＨ：７．０〜９．０
（６）安定ｐＨ：４．５〜８．５
（７）至適温度：５５℃付近
（８）温度安定性：約５０℃以下で安定
なお、上記分子量については、本酵素には元来糖鎖が付加している為、培養条件や精製条件により糖鎖の付き方が変われば分子量は異なるし、組換え体においてはその宿主、ベクター系の種類などによっても糖鎖や付加するアミノ酸が変わり分子量は異なってくる。
等電点についても同様に異なることを確認している。
以上のとおりの本発明のＧＬＤは、電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒する酵素であるから、この反応による変化が利用できる用途であれば、特に制限されない。例えば、生体物質を含む試料中のグルコースの測定及び測定用試薬、消去用試薬へ使用するなどの医療分野、臨床分野への使用が可能であり、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した物質生産においても使用可能である。
本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のＧＬＤを含む反応層に使用し、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサである。例えば、絶縁性基板上にスクリーン印刷などの方法を利用して作用極、その対極および参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体とを含む酵素反応層を形成することによって作製される。このバイオセンサの酵素反応層上に基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。また、この他に、発色強度或いはｐＨ変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。
バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた化学物質を用いることができる。電子の授受能に優れた化学物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質であり、これらに該当する化学物質として、例えば、特表２００２−５２６７５９に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤などを利用してもよい。具体的には、オスミウム化合物、キノン化合物、フェリシアン化合物等が上げられる。
バイオセンサは、安価なフェリシアン化カリウム（ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム）を電子受容体として用いることが多く、一般に終濃度１ｍＭ以下で用いられる。しかし本発明のＧＬＤはフェリシアン化カリウムを２−５００ｍＭ、より好ましくは３０−１００ｍＭと高濃度で用いる事で、より感度良くＤ−グルコースを測定する事が可能である。本発明の測定方法、測定試薬、測定化合物、バイオセンサなどの好ましい態様は、それにかかる測定反応系にフェリシアン化カリウムを終濃度２−５００ｍＭで用いることである。
本酵素の活性測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．１〜１．０ｕｎｉｔ／ｍｌになるように適宜希釈して用いる。なお、該酵素の酵素活性単位（ｕｎｉｔ）は１分間に１μｍｏｌのグルコースを酸化する酵素活性である。本発明の補酵素結合型グルコース脱水素酵素の酵素活性は、次の方法で測定できる。
（ｉ） 酵素活性測定法−１
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌ、１．０Ｍ Ｄ−グルコース１．０ｍｌ、３ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１ｍｌ、３ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト０．２ｍｌ、水０．６５ｍｌを３ｍｌ石英セル（光路長１ｃｍ）に添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして３７℃で５分間インキュベート後、酵素溶液０．０５ｍｌを添加後、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡＢＳ／ｍｉｎ）を測定する。ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数を１６．３×１０３ｃｍ−１Ｍ−１とし、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性が実質的に該酵素活性１ｕｎｉｔと等価であることから、吸光度変化より該酵素活性を次式に従って求めた。
（ｉｉ） 酵素活性測定法−２
１．０Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ３．４μｌ、１．０Ｍ Ｄ−グルコース０．１ｍｌ、２０ｍＭ ＤＣＩＰ ８６．６μｌを３７℃で５分間インキュベート後、酵素溶液０．０１ｍｌを添加して攪拌し、５分間反応後１００℃で３分間インキュベートし反応を停止した。さらに１００ｍＭ グリシン・ナトリウム緩衝液（ｐＨ１３．０） ０．１９ｍｌ、２．０Ｎ 水酸化カリウム０．０１ｍｌを添加し３７℃で１０分間インキュベートし、溶液中のＤ−グルコン酸をＤ−グルコノ−δ−ラクトンに変換した後、１００ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．３９ｍｌ、１．０Ｎ 塩酸０．０１ｍｌを添加し、ｐＨを中性にした。溶液中のＤ−グルコン酸をＤ−グルコン酸／Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン定量キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により定量した。１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコノ−δ−ラクトンを生成する酵素活性が実質的に該酵素活性１ｕｎｉｔと等価であることから、Ｄ−グルコノ−δ−ラクトンの生成量から該酵素活性を同定した。
本酵素のタンパク濃度の測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．２〜０．９ ｍｇ／ｍｌ になるように適宜希釈して用いる。本発明におけるタンパク濃度は、日本バイオ・ラッド（株）から購入できるタンパク濃度測定キットであるＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用い、取扱説明書に従って、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，和光純薬工業（株）製，生化学用）を標準物質として作成した検量線から換算して求めることができる。
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
１−１（種培養）
グルコース１％（和光純薬工業社製）（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆２％（日本食販社製）（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）および水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１００ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、綿栓をし、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５７８株を接種し、２８℃で４８時間振とう培養したものを種培養液とした。
１−２（液体培養による粗酵素溶液の取得）
グルコース（和光純薬工業社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（日本食販社製）２％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライテスク社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）、消泡剤、水からなる液体培地４ＬをｐＨ６．０に調整し、５Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌した。冷却したこの液体培地に、上記１−１（種培養）に記載した培養液４０ｍＬを接種し、４１時間、通気撹拌の条件で菌体を培養した。培養液をろ過して得た培養上清を粗酵素溶液１として用いた。
１−３（固体培養（フスマ培養）による粗酵素溶液の取得）
小麦フスマ（陽和製粉株式会社製）３００ｇと水道水２４０ｇを５Ｌ容の三角フラスコに入れ、良くかき混ぜてから、綿栓をし、１２１℃で２５分間滅菌した。
上記１−１（種培養）に記載した種培養液を５ｍＬ接種し、２６℃にて静置培養を行った。時々撹拌して通気しながら２週間の培養を行い、フスマに生育した培養菌体に対して５Ｌの２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）を用いて抽出を行い、ろ過して得た上清を粗酵素溶液２として用いた。
１−４（固体培養（オートミール培養）による粗酵素溶液の取得）
オートミール（雪印乳業製）３００ｇと水道水２４０ｇを５Ｌ容の三角フラスコに入れ、良くかき混ぜてから、綿栓をし、１２１℃で２５分間滅菌した。
上記１−１（種培養）で調整した種培養液を５ｍＬ接種し、２５℃にて時々撹拌して通気しながら４日間静置培養を行い、オートミールに生育した培養菌体に対して５Ｌの２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）にて抽出を行い、ろ過して得た上清を粗酵素溶液３として用いた。
１−５（酵素の精製）
上記の粗酵素溶液１ないし３について、以下のステップ（１）〜（５）により酵素精製を行い、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を単離精製した。
（１）濃縮・脱塩
粗酵素溶液を分画分子量１００００の限外濾過膜「ペリコン２モジュール」（ミリポア社製）で濃縮し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に置換して、粗酵素濃縮液を得た。
（２）Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー社製）による精製（第１回）
前記粗酵素濃縮液を、６５％硫酸アンモニウム飽和（ｐＨ７．５）になるように調整後、遠心分離し上清を得た。６５％飽和硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍカラムに、この粗酵素液を通液して酵素を吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄したのち、３０％硫酸飽和アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で酵素を溶出させて活性画分を集めた。さらに、同緩衝液から２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて前記活性画分とあわせた。
（３）ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００（生化学工業社製）による精製
前記活性画分を分画分子量１００００の限外濾過膜「ペリコン２モジュール」で濃縮し、脱塩後１５ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化させた。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００カラムにこの画分を通液し、活性画分を集めた。
（４）Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー社製）による精製（第２回）
前記活性画分を、６５％硫酸アンモニウム飽和（ｐＨ７．５）になるように調整後、遠心分離し上清を得た。６５％飽和硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍカラムに、この上清を通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄したのち、３０％飽和硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で酵素を溶出させて活性画分を集めた。
（５）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）による精製
前記活性画分を分画分子量１３０００のペンシル型膜濃縮モジュール「ＡＣＰ−００１３」（旭化成工業社製）で濃縮し、脱塩後０．２Ｍ 塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と平衡化させた。前記緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（直径２．１５ｃｍ×高さ６０ｃｍ）に、この画分を通液し、同緩衝液で酵素を溶出させ活性画分を分取した。活性画分をセントリプラス１０（アミコン社製）で濃縮し、脱塩後５０ｍＭ クエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に置換した。 粗酵素溶液１から得られた精製酵素（以下、精製酵素１とする）の比活性は約１，８００ ｕｎｉｔｓ／ｍｇであり、粗酵素溶液２から得られた精製酵素（以下、精製酵素２とする）の比活性は約１，０１０ｕｎｉｔｓ／ｍｇであった。粗酵素溶液３から得られた酵素（以下、精製酵素３とする）についてもそれらと同等であり、いずれの酵素もその精製倍率は粗酵素溶液に対し１００倍以上であった。
（インサートＤＮＡを含むベクターの調製）
（１）全ＲＮＡの単離
実施例１の１−１（種培養）に記載の方法によって培養した湿菌体２ｇを液体窒素により凍結した後、ＥＡＳＹＰｒｅｐ ＲＮＡ（タカラバイオ社製）を用いて１．５ｍｇの全ＲＮＡを抽出した。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの調製
全ＲＮＡから、逆転写酵素およびアダプター配列付きオリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡライブラリーを調製した。反応試薬は、「３’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ」（タカラバイオ株式会社製）を使用し、反応条件は説明書記載のプロトコールに準じて行った。
（３）ＧＬＤ遺伝子のクローニング
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマーは、上記実施例１の１−３（固体培養（フスマ培養）による粗酵素溶液の取得）記載のフスマ培養由来の粗酵素溶液２を実施例１の１−５（酵素の精製）記載の方法によって精製して得た、包埋している糖を含まない精製酵素２のＮ末端および内部配列のアミノ酸をエドマン法によって決定し、このアミノ酸配列に基づいて複数のオリゴヌクレオチドを合成した。最終的にＫｐｎＦ（配列番号３）、ＰｓｔＲ（配列番号４）以下のプライマーセットを用いて目的のＧＬＤ遺伝子を取得した。
なお、ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ株式会社）を使用し、反応条件は［９４℃／３０秒→５５℃／１分→７２℃／２分］×２５サイクルとした。
次いで、ｐＣｏｌｄＩＩＩベクター（タカラバイオ株式会社）を制限酵素ＰｓｔＩとＫｐｎＩで開裂し、同制限酵素処理したＰＣＲ増幅断片をベクターにライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α株に導入して形質転換した。得られた形質転換体のうち６クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＰｓｔＩとＫｐｎＩで処理したところ全てのクローンで目的のサイズの断片が確認できた。そのうち４クローンについてプラスミドを調製してそのインサートの配列決定を行ったところ、全てのプラスミドにおいて目的の遺伝子が確認された。
（宿主の形質転換と酵素の精製）
実施例２で作成した組換えベクター（ｐＣＧＬＤ）で宿主大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で形質転換体を選択した。次いで５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地に形質転換体を植菌し、３７℃で振とう培養した。培養液のＯＤ６００が約０．４〜０．５となった時点で培養液を１５℃に冷却し、３０分間放置後、ＩＰＴＧを１ｍＭ添加し、さらに１５℃で２４時間振とう培養を行った。培養終了後、菌体を遠心により集め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。超音波破砕装置を用いて菌体を破砕後、遠心して無細胞抽出液を調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性測定で目的の発現を確認したところ、予想する分子量の酵素発現が確認された。また、培養液当たり、０．０９Ｕ／ｍＬの酵素活性の発現が確認された。
さらに以下のステップ（１）〜（５）により補酵素結合型グルコース脱水素酵素を単離精製した。
（１）濃縮
上記無細胞抽出液を分画分子量１００００の限外濾過膜「ペリコン２モジュール」（ミリポア社製）で濃縮し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に置換し、粗酵素液を得た。
（２）Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー社製）による精製（第１回）
前記粗酵素液を、６５％飽和硫酸アンモニウム液（ｐＨ７．５）になるように調整後、遠心分離し上清を得た。６５％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍカラムに、この粗酵素液を通液して酵素を吸着させた。このカラムを同緩衝液で洗浄したのち、３０％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で酵素を溶出させて活性画分を集めた。さらに、同緩衝液から２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて前記活性画分とあわせた。
（３）ＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００（生化学工業社製）による精製
前記活性画分を分画分子量１００００の限外濾過膜「ペリコン２モジュール」で濃縮し、脱塩後１５ｍＭ トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）と平衡化させた。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００カラムにこの画分を通液し、溶出液を集めた。
（４）Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍ（東ソー社製）による精製（第２回）
前記溶出液を、６５％飽和硫酸アンモニウム液（ｐＨ７．５）になるように調整後、遠心分離し上清を得た。６５％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ６５０Ｍカラムに、この上清を通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄したのち、３０％硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で酵素を溶出させて活性画分を集めた。
（５）ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）による精製
前記活性画分を分画分子量１３０００のペンシル型膜濃縮モジュール「ＡＣＰ−００１３」（旭化成工業社製）で濃縮し、脱塩後０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．５）と平衡化させた。前記緩衝液で平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（直径２．１５ｃｍ×高さ６０ｃｍ）に、この画分を通液し、同緩衝液で酵素を溶出させ活性画分を分取した。活性画分をセントリプラス１０（アミコン社製）で濃縮し、脱塩後５０ｍＭクエン酸・リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に置換した。得られた酵素（以下、精製酵素４とする）は、比活性約２，４５０ｕｎｉｔｓ／ｍｇであり、その精製度は粗酵素液に対し約５０倍であった。
（カビの形質転換と酵素の精製）
使用する宿主としては、A.oryzae ＮＳ４株を使用した。本菌株は、公知文献１（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、分譲されているものが入手可能である。
本菌株に対し、公知文献２（Aspergillus属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、Ｐ８３１−８３８、２０００）に記載してある、A.oryzae 由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用し、ＧＬＤ遺伝子が発現可能なベクターを調製した。
形質転換は、基本的には公知文献２及び公知文献３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、Ｐ４９４−５０２，２０００）に記載の方法に準じて実施した。形質転換・活性株の選別を繰り返し実施することで、ＧＬＤ生産能を有するAspergillus oryzae を取得した。
本菌株について、ペプトン１％、ショ糖２％、リン酸水素ニカリウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０５％を含む培養液で、３０℃、５日間振盪培養することで、ＧＬＤ活性を有する培養液を取得した。
精製方法は、実施例３に記載の方法に準じて実施し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一の酵素標品を取得した。これを精製酵素５とする。
（酵母の形質転換と酵素の精製）
使用する宿主としては、高タンパク質生産酵母として知られている、Candida boidinii S2 AOU-１株を、公知文献４（遺伝子発現実験マニュアル−高発現システムによる有用タンパク質の生産、石田功・安東民衛編、講談社サイエンティフィク、Ｐ１００−１２９、１９９４）の方法で、異種遺伝子導入用に改良した菌株を使用した。なお、S2 AOU-１株はCandida boidinii SAM1958と命名され、工業技術院生命工学技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３７６６として１９９２年２月２５日に寄託されている。
改良した菌株に対し、公知文献５（メタノール資化性酵母による異種遺伝子発現系、由里本博也・阪井康能、化学と生物、３８、８、Ｐ５３３−５４０、２０００）に記載してある、Ｓ２ ＡＯＵ−１株由来のメタノール誘導性プロモーターを使用して、ＧＬＤ遺伝子が発現可能なベクターを調製し、公知文献４，５の方法で形質転換・菌株の選定を行う事で、ＧＬＤ生産能を有するCandida boidiniiを取得した。
本菌株について、ペプトン２％、酵母エキス１％、グリセロール２％、メタノール１％を含む培養液で、２８℃、２日間振盪培養することで、ＧＬＤ活性を有する培養液を取得した。
精製方法は、実施例３に記載の方法に準じて実施し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動でほぼ単一の酵素標品を取得した。これを精製酵素６とする。
（酵素分解）
上記実施例１の１−２（液体培養による粗酵素溶液の取得）で調製した粗酵素溶液１を一部取り、スミチームＰＸ、スミチームＡＲＳを０．１％（ｖ／ｖ）添加し、４０℃で２時間反応させた。反応終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、糖鎖染色キット（Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製））を使用して所定の方法で糖鎖染色を実施したが、糖鎖の分解は確認できなかった。
（過ヨウ素酸による酸化、還元、酸加水分解）
アルミホイルで覆った１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに、粗酵素溶液１をタンパク質量として２０μｇとなるように加え、８分の１量の０．８Ｎ メタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）水溶液を添加し（最終濃度：０．１Ｎ）、２５℃で２４時間の酸化反応を行った。次に、この溶液に対して１０分の１量の０．４Ｎ ＮａＢＨ４水溶液を添加し、室温で１０時間還元反応させた。さらにこの溶液に対して１０分の１量の１Ｎ 硫酸水溶液を添加し、２５℃で２４時間の加水分解を行った。本試料についても、上記（酵素分解）試験における確認試験と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、糖鎖染色キットを用いて糖鎖染色を実施したが、糖鎖の分解は確認できなかった。
（電気泳動（糖鎖染色、クマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色、活性染色））
実施例１ないし５で得られたそれぞれの酵素溶液（精製酵素１、２、４、５、および６）に対して、タンパク質０．１ｍｇあたりグリコペプチダーゼＦ（和光純薬社製）１ユニットを添加し、３７℃で１５時間反応させ糖鎖切断処理を行った後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そのゲルを糖鎖染色することによって糖鎖の量および糖鎖が切断されているかどうかの確認を行った。糖鎖染色は糖鎖染色キット（Ｇｅｌｃｏｄｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製））を使用して所定の方法で実施した（図１）。その結果、液体培養上清から精製した酵素である精製酵素１には多量の糖が確認され、糖鎖切断処理前後で差が見られず、グリコペプチダーゼＦが作用していないと推察された。一方、固体培養から精製した酵素である精製酵素２、５及び６は糖鎖切断処理後に分子量が小さくなり、グリコペプチダーゼＦにより糖鎖が一部切断されていた。
また、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色すると、精製酵素１はＣＢＢ染色されにくく、精製酵素２、４、５及び６は、ＣＢＢにより良く染色された（図２）。以上の結果から、液体培養により得られた精製酵素に比べて、固体培養又は遺伝子組換え法により得られた精製酵素は、結合している糖含量が減少しており、ＣＢＢ染色もされやすいことが判明した。
また、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用の電気泳動ゲルＮＰＵ−７．５Ｌ（ＡＴＴＯ株式会社製）を用いて、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによる電気泳動分析を行い、活性染色を行った。結果を図３に示す。なお、レーン７は液体培養し、酵素活性を２０ｍＵに調整したときのものである。また、レーン８はフスマ培養し、酵素活性を２０ｍＵに調整したときのものであり、レーン９はオートミール培養し、酵素活性を２０ｍＵに調整したときのものである。レーン７は精製酵素１を表し、レーン８は精製酵素２を表し、レーン９は精製酵素３を表す。
液体培養上清から精製した精製酵素１に比べて、固体培養から精製した酵素である精製酵素２及び精製酵素３の泳動位置はいずれもより下方の位置に見られた。以上の結果から、液体培養から固体培養に変えることによって、得られる酵素の糖含量が少なくなり、ＣＢＢ染色されやすくなったことが判明した。
上記実施例の結果より、精製酵素１とその他精製酵素は糖の含量および組成に違いがあるものと推測し、酵素の糖分析を行った。
（ＡＢＭＥ標識−ＨＰＬＣ分析による糖組成の分析）
まず、試験管にｐ−アミノ安息香酸メチル（ＡＢＭＥ）３５ｍｇと水素化シアノホウ素ナトリウム３．５ｍｇをはかりとり、メタノール３５０μｌと酢酸４１μｌを加えて撹拌し、調整した。
上記実施例１ないし５にて得られた各々の精製酵素溶液を、タンパク濃度として１．０ｍｇ／ｍＬ濃度となるよう調整した後、１００μＬをネジ口試験管にはかりとり、窒素気流下で乾固した後、４Ｎ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を０．２ｍＬ加えて１００℃で４時間反応させた。反応後、チューブエバポレーターで減圧乾固し、さらに２００μＬのイオン交換水を加え、減圧乾固する操作を３回繰り返し、ＴＦＡを完全に除去した。ドラフト内で、メタノール２００μＬとピリジン２０μＬおよび無水酢酸２０μＬを加え、室温に２時間以上放置してＮ−アセチル化反応を行った。反応溶液を窒素気流下で乾固し、イオン交換水１ｍＬに溶解し、あらかじめ洗浄したＰＲＥ−ＳＥＰ Ｃ１８カートリッジカラム（日本ウォーターズ株式会社製）にかけ、イオン交換水１５ｍＬで溶出させた。溶出液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、さらにネジ口試験管に移してチューブエバポレーターで減圧乾固した。残渣をイオン交換水２０μＬに溶解させＡＢＭＥ試薬８０μＬを加えて、８０℃で４５分間反応させた。反応終了後の溶液を窒素気流下で乾固した後、イオン交換水２ｍＬとジエチルエーテル２ｍＬを加えて撹拌した。これを遠心分離し、未反応のＡＢＭＥを含むエーテル層を除去した。このエーテル抽出を５回繰り返し、得られた水層はチューブエバポレーターで減圧乾固し、ＡＢＭＥ誘導体化糖を得た。これを２ｍＬの高純水に溶解してＨＰＬＣ分析を行った。
ＨＰＬＣの分析カラムとしてはＷａｋｏｓｉｌ ５Ｃ１８−２００（４．０×２５０ｍｍ；和光純薬工業株式会社製）を用い、カラム温度４０℃、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、溶媒には５％アセトニトリル／０．１Ｍ 酢酸溶液（溶媒Ａ）、１５％アセトニトリル／０．１Ｍ 酢酸溶液（溶媒Ｂ）を用いた。溶出は、試料注入後から２０分間Ａ：Ｂ＝１００：０で溶出を行った後、８０分でＡ：Ｂ＝０：１００になるような直線濃度勾配で行った。検出はＵＶ３０４ｎｍで行った。
その結果、液体培養由来の精製酵素１については、ガラクトース、マンノース、アラビノース、ラムノース、Ｎ−アセチルグルコサミンが検出され、グルコースは検出できなかった。一方、フスマ培養由来の精製酵素２については、マンノースとＮ−アセチルグルコサミンが検出され、グルコース、ガラクトース、アラビノース、ラムノースは検出されなかった。その他、各精製酵素の糖含量は表１の通りであった。
（補酵素結合型グルコース脱水素酵素の性質試験）
上記の実施例１ないし５によって単離した精製酵素１ないし６について、作用性、基質特異性、阻害剤および補酵素を調べた。なお、酵素活性は、ＷＯ２００４／０５８９５８の明細書３６頁及び３７頁の、酵素活性測定法−１、酵素活性測定法−２の記載に従って測定した。
１）作用性
各精製酵素を、８．６６ｍＭ ＤＣＩＰ存在下で５００ｍＭ Ｄ−グルコースと反応させ、反応産物をＤ−グルコン酸／Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン定量キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で定量した。その結果、いずれの精製酵素についてもＤ−グルコン酸の生成が確認され、これより本発明の精製酵素２ないし６は、精製酵素１と同様にＤ−グルコースの１位の水酸基を酸化する反応を触媒する酵素であることが明らかになった。
２）至適ｐＨ：
酵素活性測定法−２の緩衝液を、それぞれリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４〜８．０）もしくはグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６〜９．１）（各緩衝液とも終濃度で１７ｍＭ）に適宜置き換えて、酵素活性測定法−２と同様の方法で様々なｐＨ域における該精製酵素の酵素活性を測定した。その結果、精製酵素４、５及び６の至適ｐＨは、７．０〜９．０であった。
３）安定ｐＨ
該精製酵素を、それぞれ５０ｍＭ濃度の緩衝液、すなわち酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．６〜５．３）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０〜６．８）、トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．７）およびグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６〜１０．０）に溶解し、４０℃で６０分間保持した後に、活性測定方法−１で酵素活性を測定し、酵素活性の残存率を分析した。精製酵素５の安定ｐＨは、４．５〜８．５であった。
４）至適温度
補酵素結合型グルコース脱水素酵素を５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、上記の活性測定方法−１により３０℃〜６２℃までの範囲で酵素活性を測定した。その結果、精製酵素５の至適温度は、５５℃付近であった。
５）温度安定性
補酵素結合型グルコース脱水素酵素を５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、０℃より５５℃までのいくつかの温度で１５分間保持したのち、活性測定方法１で酵素活性を測定し、酵素活性の残存率を分析した。ここで、酵素活性の残存率は、０℃で１５分間保持した時の酵素活性値を１００％として算出した。その結果、精製酵素５は、５０℃においても８９％の酵素活性が保持され、約５０℃以下で安定であった。
６）サブユニット分子量：
１２．５％ ポリアクリルアミドゲルを使用しＬａｅｍｍｌｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ （１９７０）２２７：６８０−６８５）に従い、該精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に掛けた。泳動後にクマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色し、移動度を分子量マーカー（ＬＭＷ Ｍａｒｋｅｒ；アマシャムファルマシアバイオテク社製）のそれと比較した結果、各酵素のサブユニット分子量は、精製酵素２が約７１ｋＤａ、精製酵素４が約５８ｋＤａ、精製酵素５が約８１ｋＤａ、精製酵素６が約１２８ｋＤａであった。
７）基質特異性
活性測定方法−１における活性測定用反応液の基質を、Ｄ−グルコースおよび他の各基質（いずれも終濃度３３３ｍＭ、Ｄ−セロビオースは１９３ｍＭ、Ｄ−トレハロースおよびＤ−ラフィノースは１２１ｍＭ）を使用し、酵素活性測定法−１に則り精製酵素１ないし６の酵素活性を測定した。Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％として、各基質に対する活性値をそれに対する相対値として換算した。
また同様に、Ｄ−グルコースおよびマルトースについてそれぞれ終濃度５５０ｍＭおよびｌ００ｍＭの２種類を設定し、相対反応性（酵素活性）を測定した。結果はＤ−グルコースの値を基準に相対値として換算した。
これより、本発明の精製酵素２ないし６は、精製酵素１と同様に、Ｄ−グルコースには強く作用し、Ｄ−マンノース、１、５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、Ｄ−セロビオース、Ｄ−トレハロース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース−６−リン酸、Ｄ−フルクトースには弱く作用した。また、Ｌ−アラビノース、ラクトース、Ｄ−ソルビトール、グルコン酸、スクロース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ゾルボース、Ｄ−リボース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−グルコース−１−リン酸、Ｄ−ラフィノース、エタノール、グリセロールにはほとんど作用しなかった。
８）阻害剤
活性測定方法−１の反応系において、それぞれ終濃度がｌｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、 ２５ｍＭおよび５０ｍＭになるようにメタノールに溶解した１，１０−フェナントロリンをそれぞれ加え、精製酵素１ないし６の活性を活性測定方法−１に従い測定した。なお、反応系に対するメタノールはいずれも終濃度１０％（ｖ／ｖ）であった。対照区は、活性測定方法−１に、終濃度が１０％（ｖ／ｖ）になるようにメタノールを添加して測定を行った。その結果、１，１０−フェナントロリンを最終濃度１ｍＭ以上に加えた場合の阻害率はいずれも６０％以上と高かった。
９）補酵素
精製酵素１ないし６にＤ−グルコースを添加し、吸光分析を行ったところ、いずれも３８５ｎｍ及び４６５ｎｍに認められた吸収極大が該添加により消失したことから、補酵素がＦＡＤであることが明らかとなった。なお、これらの吸収極大はＦＡＤに特有であり、ＦＡＤのみ加えない対照反応系を構築した場合に観測されないものであった。
（センサ特性の比較）
実施例１において得られた精製酵素１、および実施例３ないし５において得られた精製酵素４ないし６を使用し、電気化学アナライザーＣＨＩ６１１Ａ（ビー・エー・エス社製）で各々二分子反応速度定数を求めた。なお、補助電極には白金、作用電極にはカーボン、参照電極には銀／塩化銀を使用した。ｐＨ７．０のモップス緩衝液中に終濃度１４２ｍＭグルコース及び精製酵素４を０．４５μＭ、精製酵素５を０．７６μＭ、精製酵素６を１．９μＭ、あるいは精製酵素１を１．１μＭを添加し、終濃度０ｍＭから０．５７ｍＭになるまでオスミウム錯体である[Os(4-Methyl-imidazole)2(4-dimethyl-bipyridine)2](PF6)2を順次添加し、各濃度（図４参照）でサイクリックボルタモグラムを測定した結果、精製酵素４の二分子反応速度定数は８．１５×１０４ｓ−１Ｍ−１、精製酵素５の二分子反応速度定数は７．３６×１０４ｓ−１Ｍ−１、また精製酵素６の二分子反応速度定数は９．３８×１０４ｓ−１Ｍ−１だった。精製酵素１は定常電流値が見られないほどに低く、二分子反応速度定数は算出できなかった（図４）。
また、同様にｐＨ７．０のモップス緩衝液中に終濃度１４２ｍＭグルコース及び精製酵素４を０．４５μＭ、精製酵素５を０．７６μＭ、精製酵素６を０．５５μＭ、あるいは精製酵素１を１．１μＭを添加し、終濃度０ｍＭから０．２２ｍＭになるまでキノン化合物である2,3-dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinoneを順次添加し、各濃度（図５参照）におけるサイクリックボルタモグラムを測定した結果、精製酵素４の二分子反応速度定数は１．１４×１０８ｓ−１Ｍ−１、精製酵素５の二分子反応速度定数は５．２９×１０７ｓ−１Ｍ−１、また精製酵素６の二分子反応速度定数は２．４９×１０７ｓ−１Ｍ−１だった。精製酵素１の二分子反応速度定数は５．６９×１０４ｓ−１Ｍ−１と低かった。
これらの結果から、遺伝子を組換えた細胞から得られた酵素は、野生株から得られた酵素より反応性が向上したことが分かった（図５）。
実施例１で得られた精製酵素１および２を使用し、電気化学アナライザーＣＨＩ６１１Ａ（ビー・エー・エス社製）で各々の二分子反応速度定数を求めた。なお、補助電極には白金、作用電極にはカーボン、参照電極には銀／塩化銀を使用した。ｐＨ７．０のモップス緩衝液中に終濃度１４２ｍＭのグルコース及び精製酵素１を０．９４μMまたは精製酵素２を３．３μＭ添加し、終濃度０ｍＭから０．６７１ｍＭになるまでフェリシアン化カリウムを順次添加し、各フェリシアン化カリウム濃度（０、０．０１９、０．０４８、０．０９５、０．１４２、０．１８８、０．２３４、０．２８０、０．３２５、０．３７０、０．４１４、０．４５８、０．５０１、０．５４４、０．５８７、０．６２９、０．６７１ｍＭ）でサイクリックボルタモグラムを測定した結果、精製酵素２の二分子反応速度定数は２．８４×１０３ｓ−１Ｍ−１だった。精製酵素１は定常電流値が見られないほどに低く、二分子反応速度定数は算出できなかった。精製酵素１は糖包埋型酵素のため反応性が弱いが、精製酵素２は包埋している糖のない、通常の糖鎖を持つ酵素であるため、反応性が改善されたと推察される。
（酵素固定化電極によるグルコースの測定）
精製酵素１、２、４、５、及び６を使用し、酵素固定化電極によるＤ−グルコースの測定を行った。各々の酵素１．０Ｕを固定化したグラッシーカーボン（ＧＣ）電極を用いて、グルコース濃度に対する応答電流値を測定した。電解セル中に、５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）１．８ｍｌおよび１Ｍ ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍｌを添加した。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、４０℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加した。これらの系に１Ｍ Ｄ−グルコース溶液を２０μｌ添加し、定常状態の電流値を測定した。更に同量の１Ｍ Ｄ−グルコース溶液を添加し電流値を測定するという作業を、各々３回繰り返した。この電流値を既知のグルコース濃度（約１０、２０、３０、４０ｍＭ）に対してプロットしたところ、検量線が作成できた（図６）。これより本発明のＧＬＤを使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能であることが示された。
配列番号１より複数のオリゴヌクレオチドを合成し、最終的に配列番号１３及び配列番号１４のプライマーセットを用いて、FADを補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素生産株であるアスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＩＦＯ４４０８、ペニシリウム・シアニウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙａｎｅｕｍ）ＩＦＯ５３３７及びガノデルマ・アプラナツム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ａｐｐｌａｎａｔｕｍ）ＩＦＯ６４９８のＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。なお、ＤＮＡは実施例１記載の条件で各株を培養し、得られた湿菌体を液体窒素により凍結後粉砕し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）（ニッポンジーン社製）で抽出した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を使用し、サーマルサイクラー（ストラタジーン社製）を用いて、［９４℃／３０秒→４２℃／３０秒→７２℃／１．５分］×３５サイクルの反応条件で行った。約１．６ｋｂｐの各増幅産物の配列を解析しイントロンを除いたｃＤＮＡ配列と、配列番号１、あるいは公知のグルコース酸化酵素及びソルボース脱水素酵素の配列と比較したところ、FADを補酵素とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素に特有の塩基配列（配列番号５−７）及び、アミノ酸配列（配列番号８−１２）が明らかになった。特に配列番号８のアミノ酸配列はFADの結合サイトであり、活性中心の一部であると思われる。
本発明は、糖尿病検査の分野で利用が可能である。

Claims (13)

  1. 配列番号１で表される塩基配列からなり、かつ
    電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
  2. 配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ
    電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
  3. 配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ
    電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
  4. 配列番号２のアミノ酸配列からなり、かつ電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
  5. 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
  6. 配列番号２の第２０−５９２番目のアミノ酸配列からなり、かつ電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド。
  7. 配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ電子受容体存在下で、グルコースを脱水素する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の補酵素結合型グルコース脱水素酵素をコードする、ポリヌクレオチド。
  8. 糸状菌、または担子菌から単離された請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  9. アスペルギルス（Aspergillus）属、ペニシリウム（Penicillium）属、またはガノデルマ（Ganoderma）属の微生物から単離された請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  10. アスペルギルス・テレウス（A.terreus）から単離された請求項１〜９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
  12. 請求項１１記載の組換えベクターを用いることによって作成された形質転換細胞。
  13. 請求項１２記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から、グルコースを脱水素する作用を有する補酵素結合型グルコース脱水素酵素を採取することを特徴とする補酵素結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
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