JPH10239273A - グルコースセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物を利用したグルコースセンサでありな
がらグルコースに対する基質特異性が高く、しかも試料
溶液中の溶存酸素濃度変化に影響を受けないグルコース
センサを提供する。 【解決手段】 グルコースセンサを金属又は炭素からな
る電極並びにこの電極に当接された微生物菌体を含有す
る薄膜からなる微生物電極と、対極とを有する構成と
し、前記微生物菌体を膜酵素としてグルコースデヒドロ
ゲナーゼを含む微生物の乾燥菌体とした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はグルコースセンサに
関し、詳しくは、グルコースに対する基質特異性が高
く、かつ試料溶液中の溶存酸素濃度変化に影響を受けな
い微生物利用のグルコースセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】グルコースセンサは試料中のグルコース
量を測定するセンサであり、従来より、医療臨床検査、
食品分析、食品の品質管理、微生物の培養プロセスのモ
ニタリングやコントロール等の用途や目的で用いられて
いる。

【０００３】この様なグルコースセンサとしてこれまで
に報告されているものを大別すると、酵素反応を利用し
たグルコースセンサと微生物の機能を利用したグルコー
スセンサを挙げることができる。また、上記酵素利用の
グルコースセンサにおいては、酵素としてグルコースオ
キシダーゼが、微生物利用のグルコースセンサにおいて
は、微生物としてシュードモナス・フルオレセンスが報
告されている。

【０００４】ここで、現在利用されているグルコースセ
ンサの大部分は酵素センサであるが、酵素はグルコース
のみに反応するという基質特異性は高いが、微生物の細
胞から分離精製する必要があり高価であった。一方、微
生物をそのまま生体触媒としてグルコースセンサに利用
する場合は、酵素の分離精製が不要のため安価に利用可
能であるが、基質特異性が低いという問題があった。ま
た、これまでの微生物利用によるグルコースセンサは、
微生物の呼吸活性の変化を酸素電極により測定するとい
う原理を利用しているため、試料溶液中の溶存酸素濃度
の影響を受けやすいという点で問題があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、微生物を利用したグルコースセン
サでありながらグルコースに対する基質特異性が高く、
しかも試料溶液中の溶存酸素濃度変化に影響を受けない
グルコースセンサを提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は上記課題を解
決するために、グルコースセンサを以下の構成とした。

【０００７】すなわち本発明は、金属又は炭素からなる
電極並びにこの電極に当接された微生物菌体を含有する
薄膜からなる微生物電極と、対極とを有し、前記微生物
菌体が膜酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを含む
微生物の乾燥菌体であるグルコースセンサである。

【０００８】また、本発明は上記構成に加えてさらに参
照電極を有するグルコースセンサを提供する。本発明の
グルコースセンサに用いる膜酵素としてグルコースデヒ
ドロゲナーゼを含む微生物の乾燥菌体として、具体的に
は凍結乾燥により得られる乾燥菌体が挙げられる。

【０００９】本発明のグルコースセンサに用いる膜酵素
としてグルコースデヒドロゲナーゼを含む微生物とし
て、具体的には、グルコノバクター（Glconobacter）
属、アシネトバクター（Acinitobacter）属、シュード
モナス（Pseudomonas）属またはアスペルギルス（Asper
gillus）属に属する微生物等を挙げることができる。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のグルコースセンサは、金属又は炭素からなる電
極並びにこの電極に当接された微生物菌体を含む薄膜か
らなる微生物電極と、対極とを有し、前記微生物菌体に
は、膜酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを含む微
生物の乾燥菌体が用いられる。また、本発明の他の態様
のグルコースセンサは、上記構成に加えてさらに参照電
極を有する。

【００１１】膜酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼ
を有する微生物を乾燥すると、菌体中に含有する水分が
除去されて、グルコース以外の有機化合物の資化に関与
する酵素を含む菌体内酵素の大部分や膜酵素の一部は失
活するが、膜酵素のうちでも前記グルコースデヒドロゲ
ナーゼは安定であるため、乾燥による失活はほとんど起
こらない。この様な微生物乾燥菌体をグルコースを含む
試料溶液に存在させると、微生物乾燥菌体が有するグル
コースデヒドロゲナーゼの酵素作用によりグルコースか
らグルコノラクトンを生成する反応が起こる。この反応
過程において、電子の移動が起こるが、試料溶液中のグ
ルコース濃度と前記反応により移動する電子の量には相
関がある。したがって、この移動する電子の量を測定す
ることによって微生物乾燥菌体のまわりに存在するグル
コース濃度を測定することができる。

【００１２】しかし、この電子の移動量を直接計測する
ことは困難であるので、本発明においては、グルコース
センサを上記構成として、これをグルコース含有溶液に
浸漬し、センサの微生物電極（以下、「作用電極」とい
うこともある）と対極もしくは参照電極との間に、電子
が移動しやすいように一定の電位差を負荷し、両電極間
に流れる電流を計測することでグルコース濃度を測定す
るものとした。

【００１３】以下に、本発明のグルコースセンサに用い
る微生物電極についてまず説明し、次いで本発明のグル
コースセンサ全体の構成について説明する。

【００１４】（１）微生物電極 本発明のグルコースセンサにおける微生物電極は、金属
又は炭素からなる電極（以下、単に「電極」ともいう）
とこの電極に当接された微生物菌体を含む薄膜（以下、
単に「微生物膜」ともいう）とからなり、前記微生物菌
体は膜酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを含む微
生物の乾燥菌体で構成される。

【００１５】上記微生物膜は、これが含有する膜酵素と
してグルコースデヒドロゲナーゼを含む微生物の乾燥菌
体を、電極表面又はその近傍に存在させるためのもので
あり、薄膜状のものであれば、特に形態は問わない。例
えば、上記微生物乾燥菌体を、アルギン酸ゲル膜、カラ
ギーナンゲル膜、アガロースゲル膜、カードランゲル
膜、キトサンゲル膜等のゲルマトリックス中に封入した
ものや光架橋性ポリビニルアルコール膜などの光硬化性
樹脂膜、ポリアクリルアミド膜等の三次元架橋構造体中
に組み込んだもの等が挙げられる。また、高分子膜に上
記微生物乾燥菌体を固定してもよい。さらには、上記電
極と電気的に接続されるかたちに、グルタルアルデヒド
等を用いて上記微生物乾燥菌体を膜状に固定化したもの
でもよい。更に、これらの方法を組み合わせて上記微生
物乾燥菌体を固定することも可能である。

【００１６】上記微生物電極の微生物膜に乾燥菌体の状
態で含有される微生物は、膜酵素としてグルコースデヒ
ドロゲナーゼを含む微生物であれば特に制限されない。
この様な微生物として、具体的には、グルコノバクター
（Glconobacter）属やアシネトバクター（Acinitobacte
r）属あるいはシュードモナス（Pseudomonas）属に属す
る細菌や、アスペルギルス（Aspergillus）属に属する
真菌等を挙げることができる。

【００１７】また、より具体的には、グルコノバクター
属に属する細菌として、グルコノバクター・サブオキシ
ダンス（Gluconobacter suboxydans）等が、アシネトバ
クター属に属する細菌として、アシネトバクター・カル
コアセティカス（Acinitobacter calcoaceticus）等
が、シュードモナス属に属する細菌として、シュードモ
ナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等が、
アスペルギルス属に属する真菌として、アスペルギルス
・オリザエ（Aspergillus oryzae）等がそれぞれ挙げら
れる。本発明のグルコースセンサには、これらの微生物
の１種を単独で用いることも可能であり、あるいは２種
以上を混合して用いることも可能である。

【００１８】本発明のグルコースセンサが有する微生物
電極においては、上述の膜酵素としてグルコースデヒド
ロゲナーゼを含む微生物を乾燥菌体にして、これを薄膜
に含有させた微生物膜を有する。本発明に用いる上記微
生物の乾燥菌体を得るには、例えば、上記微生物を通常
の方法により培養して得られる培養物から菌体を適宜分
離して、これを適当な方法により乾燥すればよい。

【００１９】上記培養の方法として、微生物としてシュ
ードモナス・フルオレセンスを用いる場合についていえ
ば、この菌の増殖に適した培地、例えば、ガラクトー
ス；０．１％、ラクトース；０．１％、サッカロース；
０．１％、グルタミン酸；０．００１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄；
０．０１％、ＫＨ₂ＰＯ₄；０．０３％、Ｍｇ₂ＳＯ₄；
０．００３％、酵母エキス；０．０５％、（ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄；０．５％含有、ｐＨ６〜７の培地等を用いて大凡
２５〜３０℃で、１０〜２４時間程度の培養を行う等の
培養方法が挙げられる。さらに、得られた菌体培養物を
必要に応じてリン酸緩衝液等で洗浄した後、この培養物
から通常遠心分離等の方法で微生物菌体を分離して乾燥
に供する。

【００２０】ついで行われる上記菌体の乾燥には、微生
物菌体を乾燥させるのに通常用いられる方法が特に制限
されずに用いられるが、この様な方法として、具体的に
は、凍結乾燥法や自然乾燥（風乾）法、あるいは、Ｌ−
乾燥保存法、ゼラチンディスク乾燥保存法（Stamp
法）、ディスクインバッグ（Disc-in-bag）乾燥保存法
等で用いられる乾燥法等が挙げられる。さらに、これら
のうちでも本発明においては凍結乾燥による乾燥方法
が、乾燥処理の効率のよさやグルコースセンサとしたと
きのグルコース特異性の高さの点で好ましい。

【００２１】ここで、本発明のグルコースセンサにおい
て、用いる微生物菌体の乾燥が十分でないとグルコース
以外の基質に対しても応答することになりグルコースに
対する高い基質特異性が得られないことがあり、また、
乾燥の条件によってはいかなる基質に対しても応答性が
得られないことがある。従って、微生物菌体を乾燥する
際には、乾燥後の菌体がグルコースに対して高い基質特
異性を示す様な乾燥条件が選択される。具体的には、凍
結乾燥の場合を例にすると、用いる微生物の種類や量に
もよるが、微生物菌体を概ね−３０℃以下の温度で凍結
後、１０μｍＨｇ程度で約５〜２４時間の減圧処理を施
す等の乾燥条件を挙げることができる。また、自然乾燥
においては、やはり用いる微生物の種類や量にもよる
が、適当な溶液、例えば、リン酸緩衝液等で湿潤させた
微生物菌体を、４〜２０℃、３０〜７０％程度の温湿度
下で約１〜７日間放置する等の乾燥条件が挙げられる。

【００２２】本発明のグルコースセンサが有する微生物
電極における、金属又は炭素からなる電極は、上記微生
物乾燥菌体が含有するグルコースデヒドロゲナーゼの触
媒作用により測定試料中のグルコースがグルコノラクト
ンを生成する際に生じる電子を受け取る。電極の素材と
しては、安定であり、かつ、導電性が大きく、微生物乾
燥菌体に実質的に無害なものであればよく、例えば、白
金、金、銀等の金属、又はグラファイト、カーボン等の
炭素素材、もしくは前記白金、金、銀、カーボン等の導
電性素材の粉末とバインダーとを含む混合物等が挙げら
れる。また、その形状としては、特に制限はないが、棒
状、筒状、シート状が挙げられ、好ましくは、微生物膜
との接触面積が大きくなるような形状とする。

【００２３】本発明のグルコースセンサが有する微生物
電極（作用電極）は、上記電極に微生物膜を当接させた
ものである。電極と微生物膜との距離が離れすぎると、
微生物膜で生じた電子が電極に移動することができな
い。この意味で、「当接」とは必ずしも完全に接してい
る必要はなく、溶液中で電子が移動可能な程度に近接し
ていればよい。

【００２４】上記微生物電極（作用電極）の具体的構造
としては、電極表面上に官能基を介して微生物乾燥菌体
を固定したもの、微生物乾燥菌体を含むゲル膜を電極に
接着したもの、電極端に透析膜を被せ、電極と透析膜の
間に微生物乾燥菌体を入れたものなどが挙げられる。ま
た、微生物乾燥菌体の懸濁液をアセチルセルロース等の
薄膜上で吸引濾過し、この薄膜上に微生物乾燥菌体を膜
状に集菌し、アセチルセルロース膜の外側から透析膜で
覆うようにして電極に被せてもよい。

【００２５】なお、電極と微生物膜とを上記の様にして
当接させる際に、微生物乾燥菌体を効果的に固定化する
ために、電極表面を処理したり、電極表面と微生物膜と
の間にこの両者の作用に影響を与えない様な高分子素材
のメッシュ等を介在させることも可能である。さらに、
電極の形状及び微生物膜の形状は、これらの接触面積が
大きくなるようにするとよい。また、上記微生物電極の
電極においては、微生物膜と当接する部分を除く試料液
浸漬部分は通常適当な材料で絶縁される。

【００２６】この様にして得られる微生物電極を用いた
本発明のグルコースセンサ全体の構成及び使用方法につ
いて次に説明する。

【００２７】（２）本発明のグルコースセンサ 本発明のグルコースセンサは、作用電極として働く上記
微生物電極の他に対極を有し、必要に応じてさらに参照
電極を有する。対極の素材としては、白金、銀、金、カ
ーボン等が挙げられる。また、グルコースセンサを測定
試料液に浸漬し、作用電極（微生物電極）と対極との間
に電位差を負荷したときに、電極反応が進行するにつれ
て、作用電極表面の試料液中のグルコース濃度は減少
し、また生成物であるグルコノラクトンの濃度が増加す
るなどして電極電位が設定した電位からずれてしまうこ
とがある。そこで、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極等の参照電極を
試料液に浸漬し、参照電極を電位設定の基準として作用
電極（微生物電極）の電位を設定することが好ましい
（３極法）。

【００２８】本発明のグルコースセンサにおいては、作
用電極（微生物電極）と対極及び必要に応じて参照電極
とを別体としてもよいし、また一体構造としてもよい。
さらに本発明のグルコースセンサを試料浸漬型のセンサ
としてもよいし、試料滴下型のセンサ、例えば特開平８
−２２６９１０号公報に記載の試料滴下型センサ等、と
することも可能である。

【００２９】本発明のグルコースセンサを用いて試料溶
液中のグルコース濃度の測定するには、例えば、試料浸
漬型のグルコースセンサでは、まず有機物を含有しない
緩衝液に上記グルコースセンサを浸漬し、作用電極（微
生物電極）と対極との間に電位差を負荷して両電極間に
流れる電流を計測し、あるいは、３極法においては、作
用電極（微生物電極）と参照電極との間に電位差を負荷
して両電極間に流れる電流を計測し、続いてグルコース
を含有する溶液（測定試料液）あるいは前記緩衝液で希
釈した測定試料液を用いて同様に電流を測定し、これら
の電流の差を、標準試料を用いたときの電流の差と比較
することにより行えばよく、これにより上記試料溶液中
のグルコース濃度を測定することができる。ここで、上
記測定における電位差の負荷及び電流の計測には、ポテ
ンシオスタットや定電圧発生装置等を用いるとよい。

【００３０】また、グルコース濃度測定に際して試料液
にメディエータを添加しておくと、上記グルコースデヒ
ドロゲナーゼが触媒として作用する反応により発生する
電子が電極に移行するのを促進し、より高感度な測定が
可能となるので好ましい。あるいは、微生物膜の内部、
表面又は微生物膜と電極との間等、試料液接触部のいず
れかにメディエータを含ませてもよい。なお、この様に
メディエータを微生物電極上に固定した場合、試料液の
グルコース濃度測定時に微生物電極中のメディエータが
試料液中に溶け出すので、１回使用したセンサは使い捨
てにするか、あるいは、使用後に再度メディエータを添
加すれば、再使用が可能である。

【００３１】上記メディエータとしては、微生物乾燥菌
体から電極に電子が移行するのを促進するものであれば
よく、具体的には、１−メトキシ−５−メチルフェナジ
ニウムメチルスルフォネート（１−Ｍ−ＰＭＳ）、メチ
ルフェナジニウムメチルスルフォネート（ＰＭＳ）、
２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）、９−
ジメチルアミノベンゾ−α−フェナゾキソニウムクロラ
イド、メチレンブルー、インジゴトリスルホン酸、フェ
ノサフラニン、チオニン、ニューメチレンブルー、２，
６−ジクロロフェノール、インドフェノール、アズレ
Ｂ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−ｐ−フェニレ
ンジアミンジヒドロクロリド、レゾルフィン、サフラニ
ン、ソディウムアントラキノンβ−スルフォネート、イ
ンジゴカーミン等の色素、

【００３２】リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、フラ
ビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチ
ド、ニコチンアデニンジヌクレオチド、ルミクロム、ユ
ビキノン、ハイドロキノン、２，６−ジクロロベンゾキ
ノン、２−メチルベンゾキノン、２，５−ジヒドロキシ
ベンゾキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノ
ン、グルタチオン、パーオキシダーゼ、チトクロムＣ、
フェレドキシン等の生体酸化還元物質又はその誘導体、
その他Ｆｅ−ＥＤＴＡ、Ｍｎ−ＥＤＴＡ、Ｚｎ−ＥＤＴ
Ａ、メソスルフェート、２，３，５，６−テトラメチル
−ｐ−フェニレンジアミン、フェリシアン化カリウム等
が挙げられる。これらのメディエータの濃度は、４０ｎ
Ｍ以上程度が好ましい。

【００３３】さらに上記の化合物の中では、１−Ｍ−Ｐ
ＭＳ、ＰＭＳ、ＤＣＩＰ、フェリシアン化カリウム等が
本発明においては好ましい。また、上記グルコース濃度
の測定においてグルコースセンサを流れる電流は、微生
物の種類、電極と微生物膜との接触面積、メディエータ
の種類及び濃度、作用電極と対極あるいは参照電極との
間に負荷する電位差、グルコース濃度等に依存するの
で、これらは予備実験を行って適宜設定するとよい。

【００３４】本発明のグルコースセンサにおいて微生物
電極が有する微生物膜は、膜酵素としてグルコースデヒ
ドロゲナーゼを有する微生物の乾燥菌体を含有する。膜
酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを有する微生物
を乾燥すると、菌体中に含有する水分が除去されて、グ
ルコース以外の有機化合物の資化に関与する酵素を含む
菌体内酵素の大部分や膜酵素の一部は失活するが、膜酵
素のうちでも前記グルコースデヒドロゲナーゼは安定で
あるため、乾燥による失活はほとんど起こらない。この
グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースからグルコ
ノラクトンが生成される反応を触媒する酵素であり、こ
の反応過程においては電子の移動が起こる。

【００３５】本発明のグルコースセンサは、原理的には
グルコースデヒドロゲナーゼが触媒する前記反応によっ
て移動する電子の量を測定することでグルコース濃度を
測定するものであって、前記微生物乾燥菌体においては
膜酵素のグルコースデヒドロゲナーゼが活性を有する以
外は有機化合物の資化に関与する酵素はほとんど活性を
示さないことから、これまでのグルコースオキシダーゼ
利用のグルコースセンサと同程度にグルコースに対する
高い基質特異性を有するものである。

【００３６】また、本発明のグルコースセンサにおいて
は、上記グルコースデヒドロゲナーゼ触媒反応によって
移動する電子量を測定する具体的手段として、グルコー
ス含有の試料液にグルコースセンサを浸漬し、センサの
微生物電極（作用電極）と対極もしくは参照電極との間
に電子が移動しやすいように一定の電位差を負荷して両
電極間に流れる電流を計測し、電子が発生しないとき、
例えば、グルコースを含有しない緩衝液等にセンサを浸
漬したときに同様にして計測して得られる電流とを比較
する手段を用いているため、グルコースの濃度測定に際
して、溶存酸素濃度変化に影響を受けることがなく、溶
存酸素の少ない試料液中でのグルコース濃度測定も可能
である。

【００３７】さらに、本発明のグルコースセンサにおい
ては、上記の様に酵素利用のグルコースセンサと同等の
グルコースに対する高い基質特異性を持ちながらも、用
いる微生物乾燥菌体は微生物菌体を乾燥するという簡単
な処理のみで得られるため、酵素を分離精製するのに労
力やエネルギーを費やす酵素利用のグルコースセンサに
比べて、生産効率がよいといえる。

【００３８】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。

【００３９】

【実施例１】 グルコースセンサ グルコースセンサを構成する微生物電極の一例、および
この微生物電極を有するグルコースセンサの一例を、図
１、２に基づいて説明する。

【００４０】（１）微生物電極の作製 まず、膜酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを含む
微生物としてシュードモナス・フルオレッセンス（biov
arV）を用いて乾燥菌体を作製した。

【００４１】シュードモナス・フルオレッセンス（biov
arV）を、培地（ガラクトース；０．１％、ラクトー
ス；０．１％、サッカロース；０．１％、グルタミン
酸；０．００１％、Ｋ₂ＨＰＯ₄；０．０１％、ＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄；０．０３％、Ｍｇ₂ＳＯ₄；０．００３％、酵母エ
キス；０．０５％、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；０．５％含有、
ｐＨ６）に植菌し、３０℃で２４時間、振盪培養した。
培養後、得られた培養物をリン酸緩衝液で洗浄後、遠心
して菌体を分離した。分離された菌体を液体窒素で凍結
後、６０分間の真空乾燥を行って乾燥菌体を得た。

【００４２】また、端部を除いて絶縁部材６により絶縁
被覆されている市販の金電極１（１．６ｍｍφ、ＢＡＳ
製）の一方の端部をテトロンメッシュ４で覆いこれをＯ
−リング５で止めた。前記金電極１のテトロンメッシュ
で覆った方の端部にテトロンメッシュ４を介して、上記
で得られたシュードモナス・フルオレッセンスの乾燥菌
体を光架橋性ポリビニルアルコール（ＰＶＡ−ＳｂＱ：
polyvinyl alcohol stilbazole quaternized）溶液に適
量混合した液体を、均一に塗布し、この後、蛍光灯を照
射し、ＰＶＡ−ＳｂＱを架橋させて上記金電極１に当接
するかたちで微生物膜２を形成させて微生物電極３を作
製した（図１）。

【００４３】（２）グルコースセンサ 上記の様に構成された微生物電極３、参照電極７（Ａｇ
／ＡｇＣｌ電極）および対極（白金電極）８のそれぞれ
をリード線によりポテンシオスタット９に接続し、緩衝
液を入れた試料槽１０に浸漬して、グルコースセンサと
した（図２）。試料槽１０は、マグネチックスターラー
１１上に設置され、試料槽１０の緩衝液中にはスターラ
ーバー１２を入れた。グルコース濃度の測定中、試料液
はマグネチックスターラーにより撹拌される。また、ポ
テンシオスタット９にはレコーダ１３が接続され、これ
により測定値が記録される。

【００４４】上記グルコースセンサを用いてグルコース
濃度測定を行うには、３極法に従いまず参照電極と微生
物電極との間に定電圧を負荷し流れる電流を計測する。
次に測定試料を添加し同様に電流値を測定して、電流値
の差を算出する。この電流値の差を、標準試料を用いて
同様に測定、算出された電流値の差と比較することによ
り上記測定試料中のグルコース濃度を測定することがで
きる。

【００４５】

【比較例１】上記実施例１のグルコースセンサの微生物
電極において、微生物（シュードモナス・フルオレッセ
ンス（biovarV））の凍結乾燥菌体の替わりに、上記同
様に培養して得られた培養物を洗浄しこれから遠心分離
によって分離されたシュードモナス・フルオレッセンス
（biovarV）の湿菌体を用いた以外は、上記実施例１と
全く同様にして微生物電極を作製し、さらに、この微生
物電極を用いて上記実施例１と同様にして比較例のグル
コースセンサを作製した。

【００４６】＜本発明のグルコースセンサの評価＞上記
実施例１のグルコースセンサを用いて、本発明のグルコ
ースセンサの基質応答性、グルコース濃度依存性、温度
依存性、ｐＨ依存性を評価した。

【００４７】（ａ）基質応答性 上記実施例１および比較例１のグルコースセンサの種々
の基質に対する応答性を以下の方法により評価した。

【００４８】表１に示す各種基質（１３化合物）を１０
０ｍＭリン酸緩衝液に３ｍｇ／ｍｌの濃度となるように
溶解した１３種類の試験液を作製した。上記実施例１の
グルコースセンサの試料槽に１０ｍＭフェリシアン化カ
リウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を
１５ｍｌ入れ、参照電極と微生物電極との間に＋４００
ｍＶの電位を負荷し流れる電流を計測した。次に、最終
濃度が１５０ｍｇ／ｌになるように上記試験液の１つを
７９０μｌ添加して同様に電流値を測定し、添加する前
の電流値との差を算出した。同様にして残りの１２種類
の試験液に関して添加の前後における電流値の差を算出
した。さらに、比較例１のグルコースセンサを用いて同
様に１３種類の試験液に関して添加の前後における電流
値の差を算出した。また、実施例１のグルコースセンサ
における微生物電極を作製する手順に則って、微生物を
全く含有しない作用電極を作製し、これ用いて上記実施
例１と同様にして作製したグルコースセンサをコントロ
ールとして用いて同様の測定を行った。

【００４９】結果を表１に示す。なお、表１において、
○は電流値に差があったことを示し、×は電流値に実質
的な差がなかったことを示す。

【００５０】

【表１】

【００５１】この結果から明らかなように、湿菌体含有
の微生物電極を有する比較例のグルコースセンサが、グ
ルコース以外の多くの基質に対して応答性を示したの比
べ、本発明のグルコースセンサは、グルコース以外の基
質には全く反応せず、グルコースに対する高い基質特性
が示された。

【００５２】（ｂ）グルコース濃度依存性 上記実施例１のグルコースセンサの試料槽に１０ｍＭフ
ェリシアン化カリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を１５ｍｌ入れ、参照電極と微生物電極
との間に＋４００ｍＶの電位を負荷し流れる電流を計測
した。ついで、グルコース溶液を最終濃度が１５、３
０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１３
５、１５０ｍｇ／ｌになるように順次添加して、添加の
度に電流値が安定したところで電流値を測定してこれを
レコーダで記録し、さらにグルコース溶液無添加時の電
流値との差を求めた。結果をグルコース濃度と電流値の
関係として図３に示す。なお、図３における縦軸の電流
値は、グルコース溶液無添加時の電流値との差（△ｎ
Ａ）を示すものである。

【００５３】この結果から明らかなように電流値（の
差）は、グルコース濃度とよく相関しており、本発明の
グルコースセンサを用いれば、グルコース濃度を的確に
測定できることがわかる。

【００５４】（ｃ）温度依存性 上記実施例１で得られたグルコースセンサを用いて本発
明のグルコースセンサの温度依存性を評価した。すなわ
ち、上記（１）の試験においてグルコース溶液を用いた
場合と同様にして、実施例１で得られたグルコースセン
サのグルコースに対する応答性（添加前後の電流値の
差）を各温度において測定した。結果を図４に示す。

【００５５】この結果から、本発明のグルコースセンサ
を用いて、同じ濃度のグルコース溶液を測定しても電流
値（の差）は測定温度にある程度影響を受けることが確
認され、本発明のグルコースセンサ使用時の温度管理の
重要性が示唆された。

【００５６】（ｄ）ｐＨ依存性 上記実施例１で得られたグルコースセンサを用いて本発
明のグルコースセンサのｐＨ依存性を評価した。すなわ
ち、上記（１）の試験においてグルコース溶液を用いた
場合と同様にして、実施例１で得られたグルコースセン
サのグルコースに対する応答性（添加前後の電流値の
差）を各ｐＨにおいて測定した。なお、ｐＨの調整はリ
ン酸緩衝液を用いた場合とトリス緩衝液を用いた場合の
２系列で行った。結果を図５に示す。

【００５７】この結果から、本発明のグルコースセンサ
を用いてグルコース濃度の測定を行う際には、ｐＨ６〜
９程度の範囲においてはｐＨによる影響はほとんどない
といえる。

【００５８】

【実施例２】上記実施例１と全く同様にしてシュードモ
ナス・フルオレッセンス（biovarV）の凍結乾燥菌体を
得た。これを密封して４℃で１ヶ月間保存した。つい
で、１ヶ月間保存後の凍結乾燥菌体を用いて実施例１と
同様にしてグルコースセンサを作製し、上記（１）の試
験でグルコース溶液を用いた場合と同様にしてグルコー
スに対する応答性を測定した。その結果、このグルコー
スセンサのグルコースに対する応答性は、凍結乾燥直後
の乾燥菌体を用いて作製した実施例１のグルコースセン
サと同程度であった。

【００５９】また、上記同様に２ヶ月間保存後の凍結乾
燥菌体を用いて実施例１と同様にしてグルコースセンサ
を作製し、さらに上記と同様にしてグルコースに対する
応答性を測定したところ、グルコースに対する応答性は
実施例１のグルコースセンサと同程度であった。

【００６０】これにより、本発明のグルコースセンサに
用いる乾燥菌体が保存安定性にも優れることがわかる。

【００６１】

【実施例３】上記実施例１と同様にして得られたシュー
ドモナス・フルオレッセンス（biovarV）の培養菌体を
培養物から分離後、リン酸緩衝液に湿潤させ温度４℃、
湿度２０％の恒温恒湿槽に１０日間開放状態で放置した
ところ、菌体は１０日後には完全に乾燥した。この自然
乾燥菌体を上記凍結乾燥菌体の替わりに用いて実施例１
と同様にしてグルコースセンサを作製した。また、前記
乾燥の途中、２日目、３日目、６日目、８日目に恒温恒
湿槽より菌体を取り出し、これを凍結乾燥菌体の替わり
に用いて実施例１と同様にしてグルコースセンサを作製
した。

【００６２】上記各グルコースセンサを用いて、上記
（１）の試験でエタノール溶液、酢酸溶液、グルコース
溶液を用いた場合と同様にしてエタノール、酢酸、グル
コースに対する応答性を測定した。結果をエタノールに
ついては図６に、酢酸については図７に示す。また、グ
ルコースについては上記各グルコースセンサ間に差は認
められなかった。

【００６３】この結果から乾燥が完全でない菌体を用い
たグルコースセンサにおいては、グルコース以外の基質
に対する応答性がある程度残っており、乾燥が進んだ菌
体を用いたグルコースセンサ程、グルコースに対する基
質特異性が高いことがわかった。

【００６４】

【発明の効果】本発明のグルコースセンサは、微生物を
利用したグルコースセンサでありながらグルコースに対
する基質特異性が高く、しかも試料溶液中の溶存酸素濃
度変化に影響を受けない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のグルコースセンサの有する微生物電
極の一例を示す図である。

【図２】 本発明のグルコースセンサの一実施例を示す
図である。

【図３】 本発明のグルコースセンサを用いたグルコー
ス濃度測定の結果を示す図である。

【図４】 本発明のグルコースセンサの温度依存性を示
す図である。

【図５】 本発明のグルコースセンサのｐＨ依存性を示
す図である。

【図６】 本発明のグルコースセンサに用いる菌体の乾
燥状態とエタノールに対する応答性の関係を示す図であ
る。

【図７】 本発明のグルコースセンサに用いる菌体の乾
燥状態と酢酸に対する応答性の関係を示す図である。

【符号の説明】

１．金属（金）電極 ２．微生物膜 ３．微生物電極 ４．テトロンメッシュ ５．Ｏ−リング ６．絶縁部材 ７．参照電極 ８．対極 ９．ポテンシオスタット １０．試料槽 １１．マグネチックスターラー １２．スターラーバー １３．レコーダ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 金属又は炭素からなる電極並びにこの電
   極に当接された微生物菌体を含有する薄膜からなる微生
   物電極と、対極とを有し、前記微生物菌体が膜酵素とし
   てグルコースデヒドロゲナーゼを含む微生物の乾燥菌体
   であるグルコースセンサ。
2. 【請求項２】 さらに参照電極を有する請求項１記載の
   グルコースセンサ。
3. 【請求項３】 乾燥菌体が凍結乾燥により得られること
   を特徴とする請求項１記載のグルコースセンサ。
4. 【請求項４】 微生物がグルコノバクター（Glconobact
   er）属、アシネトバクター（Acinitobacter）属、シュ
   ードモナス（Pseudomonas）属またはアスペルギルス（A
   spergillus）属に属する微生物から選ばれることを特徴
   とする請求項１記載のグルコースセンサ。