JP5896375B2 - 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子 - Google Patents
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- C12Y101/9901—Glucose dehydrogenase (acceptor) (1.1.99.10)
Description
配列番号1で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)アミノ酸配列において、298、338、340、341、343、352、354、424、426、431、及び432位のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における置換を含み、且つ、野生型GLDと比較して阻害剤に対する感受性が低下した改変型GLD。
[態様2]
阻害剤が終濃度1mMの条件で共存した測定系において、阻害剤が共存しない場合と比べ40%以上の相対活性を示す、態様1記載の改変型GLD。
[態様3]
アミノ酸置換が、A298I、A298V、V338M、S340G、S340N、S340V、S340W、H341A、H341C、H341D、H341E、H341F、H341G、H341I、H341K、H341L、H341M、H341N、H341P、H341Q、H341R、H341S、H341V、H341W、H341Y、D343A、D343E、D343F、D343H、D343I、D343K、D343L、D343M、D343N、D343Q、D343R、D343S、D343W、D343Y、D343V、G352A、G352C、G352D、G352E、G352F、G352I、G352K、G352L、G352M、G352N、G352P、G352Q、G352R、G352S、G352T、G352V、G352W、G352Y、K354A、K354C、K354D、K354E、K354F、K354G、K354H、K354M、K354N、K354P、K354Q、K354Y、K354H、K354R、K354S、Y424C、Y424D、Y424E、Y424K、Y424N、Y424Q、Y424R、Y424S、Y424T、Y424V、G426A、G426C、G426D、G426E、G426F、G426H、G426I、G426K、G426L、G426M、G426N、G426P、G426R、G426S、G426T、G426W、G426Y、G426V、V431F、F432I、F432K、F432L、F432M、F432Q、F432R、F432T、及びF432V、並びに、これらの任意の組み合わせから成る群から選択される、態様1又は2記載の改変型GLD。
[態様4]阻害剤が1,10-フェナントロリンである、態様1ないし3のいずれか一項に記載の改変型GLD。
[態様5]
配列番号1で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)アミノ酸配列において、A298I、S272T+A298V+A369T、V338M+Q382H、L250V+S340G+D399N、S340N、S340V、S340W、H341A、H341C、H341D、H341E、H341F、H341G、H341I、H341K、H341L、H341M、H341N、H341P、H341Q、H341R+G499S、H341S、H341V、H341W、H341Y、D343A、D343E+L562H、R250L+D343E+K494E、D343F、D343H、D343I、D343K、D343L、D343M、D343N+S490S、D343Q、D343R、D343S、D343W、D343Y、D343V、G352A、G352C、G352D、G352E、G352F、G352I、G352K、G352L、G352M、G352N、G352P、G352Q、G352R、G352S、G352T、G352V、G352W、G352Y、K354A、K354C、K354D、K354E、K354F、K354G、K354H、K354M、M342L+K354N、K354P、K354Q、K354Y、K354H、K354R、K354S、Y424C、Y424D、Y424E、Y424K、Y424N、Y424Q、Y424R、Y424S、Y424T、Y424V、G426A、G426C、G426D、G426E、G426F、G426H、G426I、G426K、G426L、G426M、G426N、G426P、G426R、G426S+A578V、G426T、G426W、G426Y、G426V、V431F、F432I、F432K、F432L、F432M、F432Q、F432R、F432T、及びF432V、並びに、これらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する改変型GLD。
[態様6]
態様1ないし5のいずれか一項に記載の改変型GLDをコードするポリヌクレオチド。
[態様7]
配列番号1で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが配列番号2に示される塩基配列を有する、態様6記載のポリヌクレオチド。
[態様8]
態様6又は7記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
[態様9]
態様8記載の組換えベクターを用いることによって作製された形質転換細胞。
[態様10]
大腸菌、酵母、又は糸状菌である、態様9記載の形質転換細胞。
[態様11]
態様9又は10の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から改変型GLDを採取することを特徴とする、改変型GLDの製造方法。
[態様12]
態様1ないし5のいずれか一項に記載の改変型GLD又は態様11記載の製造方法で得られた改変型GLDを使用することを特徴とする、グルコースの測定方法。
[態様13]
態様1ないし5のいずれか一項に記載の改変型GLD又は態様11記載の製造方法で得られた改変型GLDを含有することを特徴とする、グルコース測定試薬組成物。
[態様14]
態様1ないし5のいずれか一項に記載の変型GLD又は態様11記載の製造方法で得られた改変型GLDを使用することを特徴とする、グルコース測定用のバイオセンサ。
本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を反応層に使用したセンサであればよい。例えば、該バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着などの方法を利用して電極系を形成し、更に酸化還元酵素と電子受容体とを含む測定試薬を備えることによって作製される。このバイオセンサの測定試薬に基質を含む試料液を接触させると、測定試薬が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。この他に、発色強度又はpH変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。これらのバイオセンサにより、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。
分光光度計(日本分光社製 V-660)を用いて測定する場合は次の手順に従い測定を行った。
0.1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)1.0mL、1.0M D−グルコース1.0mL、3mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(以下DCIPという)0.14mL、3mM 1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェイト(以下1−m−PMSという)0.2mL、メタノール0.06mL、蒸留水0.55mLを3mL石英セル(光路長1cm)に添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして37℃で10分間インキュベート後、酵素溶液0.05mLを添加後、DCIPの600nmにおける吸光度変化(ΔABS/min)を測定する。DCIPのpH7.0におけるモル吸光係数を16.3×103cm-1M-1とし、1分間に1μmolのDCIPが還元される酵素活性が実質的に該酵素活性1unitと等価であることから、吸光度変化より該酵素活性を式1に従って求めた。実施例8においては上記の試薬組成中のメタノールを蒸留水に置きかえ測定を行った。
予め適当な希釈倍率に希釈しておいた培養上清を1ウェルあたり100μlずつ96マイクロプレートに添加した。そこに1M リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)、1.0M D−グルコース、3mM DCIP、3mM 1−m−PMSそしてメタノールの容積比がそれぞれ0.1:1:0.14:0.2:0.06からなる酵素活性測定試薬を1ウェルあたり100μlずつ添加し、DCIPの600nmにおける吸光度変化(ΔABS/min)を測定する。分光光度計を用いた活性測定手順により酵素活性が既知となっている酵素溶液の吸光度変化との間で比例換算を行うことにより、酵素溶液の酵素活性を算出することができる。
また、以下の実施例において、分光光度計、プレートリーダーのいずれで測定した場合も上記試薬組成にて測定した酵素活性値をブランク値とし、上記試薬組成中のメタノールを阻害剤である1,10-フェナントロリン濃度またはプロフラビン塩酸塩濃度が50mMのメタノール溶液に置き換えて(阻害剤の終濃度:1mM)測定した値をサンプル値とする。
特許文献1に公開されているアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)FERM BP-08578株由来のGLD遺伝子を通常の方法により単離し、シグナル配列(配列番号1における1〜19番目のアミノ酸配列)をコードする部位を除いた(以下野生型GLD遺伝子と言う)。野生型GLD遺伝子を鋳型とし、配列番号3および4に記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーDNA(F)、プライマーDNA(R)としPCRを行った。このとき、プライマーDNA(F)は予めリン酸化しておいた。得られたPCR産物をSalIで処理した後に、予めNaeI、SalIで処理し、Nae1の切断部位は脱リン酸化しておいたプラスミドpAFF2(独立行政法人産業技術総合研究所より分譲)に対して導入し、プラスミドpAFF3GLDを取得した。続いて、野生型GLD遺伝子を鋳型とし、配列番号5および6に記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーDNA(F)、プライマーDNA(R)としてPCRを行い、得られたPCR産物をBglIIおよびSphIで処理し、予めBglIIとSphIで処理しておいたpAFF3GLDに対し導入しプラスミドpAFF4GLDを取得した。以下の実験にはpAFF4GLDを用いた。
プライマーDNA(R):5’ ctgcaggtcgacgcatgcctaacgacgaccagcatcggccttgatgag 3’(配列番号4)
プライマーDNA(F):5’ ggcagatcttccaactccacgtccgccaaatatgattat 3’(配列番号5)
プライマーDNA(R):5’ acatgcatgctctagactaacgacgaccagcatcggccttgatgag 3’(配列番号6)
野生型GLD遺伝子にランダム変異を導入するために、下記のようなオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。なお、プライマーDNA(F)は制限酵素BglII切断部位を有し、プライマーDNA(R)は制限酵素XbaI切断部位を有する。
プライマーDNA(F):5’ggcagatcttccaactccacgtccgccaaatatgattat 3’(配列番号7)
プライマーDNA(R):5’acatgcatgctctagactaacgacgaccagcatcggccttgatgag 3’(配列番号8)
96マイクロウェルプレート(Nunc社製)の各ウェルに125μLのイーストエクストラクト(BD社製)1.0%、トリプトン(BD社製) 2.0%、グルコース(和光純薬製) 2.0%からなるYPD培地を分注し、実施例2で取得した酵母の形質転換体を1コロニーずつ植菌し、30℃、1,000rpmで24時間振とう培養した。培養後、遠心して上清を回収した。前述の酵素活性測定法に従い、プレートリーダーを用いてブランク値およびサンプル値を測定し、サンプル値をブランク値にて除した値を相対活性(%)とした。野生株と比べて相対活性が優位に増加した変異株を選別し、遺伝子解析を実施した結果、表1の通りだった。
GLD遺伝子に部位特異的な置換変異を導入するために、下記のようなオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。
尚、オリゴヌクレオチド中の「NNN」には置換変異のアミノ酸をコードする任意の塩基配列(コドン)が該当する。例えば、置換変異のアミノ酸が、アラニン(A)の場合はGCC、システイン(C)の場合はTGC、アスパラギン酸(D)の場合はGAC、グルタミン酸(E)の場合はGAG、フェニルアラニン(F)の場合はTTC、グリシン(G)の場合はGGC、ヒスチジン(H)の場合はCAC、イソロイシン(I)の場合はATC、リジン(K)の場合はAAG、ロイシン(L)の場合はCTT、メチオニン(M)の場合はATG、アスパラギン(N)の場合はAAC、プロリン(P)の場合はCCC、グルタミン(Q)の場合はCAG、アルギニン(R)の場合はCGT、セリン(S)の場合はTCC、スレオニン(T)の場合はACT、バリン(V)の場合はGTC、トリプトファン(W)の場合はTGG、チロシン(Y)の場合はTATが該当する。またこれらの塩基配列は配列番号2に記載の塩基配列を元に決定した。
プライマーDNA(A298):5’ tgtctctgccggtnnnttgaagtccccggc 3’ (配列番号9)
プライマーDNA(S340):5’ aggaccaagtgaacnnncacatggatgcat 3’ (配列番号10)
プライマーDNA(H341):5’ ccaagtgaacagcnnnatggatgcatcggg 3’ (配列番号11)
プライマーDNA(D343):5’ gaacagccacatgnnngcatcgggcaacac 3’ (配列番号12)
プライマーDNA(G352):5’ cacttccatctctnnnaccaaggcagtctc 3’ (配列番号13)
プライマーDNA(K354):5’ catctctggaaccnnngcagtctcctaccc 3’ (配列番号14)
プライマーDNA(Y424):5’ tgaagtcctgaacnnnccgggcagcgcgac 3’ (配列番号15)
プライマーDNA(V431):5’ cagcgcgacgtccnnntttgcagaattctg 3’ (配列番号16)
プライマーDNA(F432):5’ cgcgacgtccgtgnnngcagaattctgggc 3’ (配列番号17)
更に、実施例2と同様に、こうして取得した大腸菌形質転換体からillustra plasmid mini spin kit(GEヘルスケア社製)を用いて部位特異的な置換変異を導入したプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドをSaccharomyces cerevisiae BY4741に導入した。
:その1)
実施例5により取得した酵母の形質転換体について、実施例3に記載の手順と同様にして相対活性が野生株と比較して顕著に増加した変異株を選別した。それら変異株の相対活性の測定結果を表2〜4に示す。また、A298V、V338M、S340G、S340N、S340V、S340W、H341A、H341C、H341D、H341F、H341G、H341I、H341K、H341L、H341M、H341N、H341Q、H341R、H341S、H341V、H341W、H341Y、D343A、D343E、D343F、D343H、D343I、D343K、D343L、D343M、D343N、D343Q、D343S、D343W、D343Y、D343V、G352A、G352F、G352I、G352M、G352N、G352P、G352Q、G352R、G352S、G352W、G352Y、Y424C、Y424K、Y424N、Y424Q、Y424R、Y424S、Y424V、G426A、G426C、G426F、G426H、G426I、G426K、G426L、G426M、G426N、G426S、G426T、G426W、G426Y、G426V、V431F、F432I、F432K、F432L、F432M、F432Q、F432R、F432T、F432Vにおいては、1,10-フェナントロリンと併せてプロフラビン塩酸塩に対する感受性も優位に低下(プロフラビン塩酸塩による阻害に対する相対活性45%以上)していた。
500mL容坂口フラスコにYPD培地を150mL入れ、実施例5にて取得した341位のヒスチジンがトリプトファンに置換した改変株および432位のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異株を植菌し、30℃、120rpm、48時間の条件で培養した。
培養液を3,000×gで5分間遠心し、上澄み液を10μmメンブレンフィルターにてろ過した。ろ液をViva spin 20-10k(GEヘルスケア社製)等を用いて濃縮し、透過液の電気伝導度が10μS/cm以下になるまで脱塩を行った。
得られた酵素溶液を1mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化させておいたDEAEセルファイン A-500-mカラム(直径 1.0cm×高さ 6.0cm)に通液し酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄し、さらに10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を通液した。得られた活性画分を集めViva spin2-10k(GEヘルスケア社製)にて濃縮し精製酵素とした。
得られた精製酵素溶液を適切な濃度に希釈後、前述の酵素活性測定法に倣い分光光度計を用いてサンプル値及びブランク値を測定した。
測定の結果を表5に示す。精製酵素においても1,10-フェナントロリンおよびプロフラビン塩酸塩の感受性が大きく低下していることが判った。
実施例3および6に記載の手順と同様にして高濃度の阻害剤の共存下で相対活性を測定した。その結果(表6)から、阻害剤の終濃度1〜20mMにおいて、野生型と比較して本発明の改変型GLDの相対活性は顕著に増加していることが判明した。
実施例7で得た、341位のヒスチジンがトリプトファンに置換した改変株および432位のフェニルアラニンがロイシンに置換した改変株から得た改変型GLDを使用し、前述の酵素活性測定法に倣い分光光度計を用いてD-グルコースの定量を行った。反応測定系において、終濃度が0.3、5.0、15、25、50mMとなるようD-グルコースを添加し、600nmにおけるDCIPの吸光度変化(ΔAbs/min)を測定した。この吸光度変化を既知のグルコース濃度(0.3、5.0、15、25、50mM)に対してプロットしたところ、検量線が作成できた(図1A〜図1D)。これより本発明の改変型GLDを用いてグルコースの定量が可能であることが示された。
Claims (13)
- 配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有する、フラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)のアミノ酸配列において、
A298I、A298V、S272T+A298V+A369T、V338M、V338M+Q382H、S340G、S340N、S340V、S340W、L250V+S340G+D399N、H341A、H341C、H341D、H341E、H341F、H341G、H341I、H341K、H341L、H341M、H341N、H341P、H341Q、H341R、H341S、H341V、H341W、H341Y、H341R+G499S、D343A、D343E、D343F、D343H、D343I、D343K、D343L、D343M、D343N、D343Q、D343R、D343S、D343W、D343Y、D343V、D343E+L562H、R250L+D343E+K494E、D343N+S490S、G352A、G352C、G352D、G352E、G352F、G352I、G352K、G352L、G352M、G352N、G352P、G352Q、G352R、G352S、G352T、G352V、G352W、G352Y、K354A、K354C、K354D、K354E、K354F、K354G、K354H、K354M、K354N、K354P、K354Q、K354Y、K354R、K354S、M342L+K354N、G426A、G426C、G426D、G426E、G426F、G426H、G426I、G426K、G426L、G426M、G426N、G426P、G426R、G426S、G426T、G426W、G426Y、G426V、G426S+A578V、V431F、F432I、F432K、F432L、F432M、F432Q、F432R、F432T、及びF432Vから成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基における置換を含み(但し、上記アミノ酸配列が配列番号1でない場合には、F432I及びF432Vは除く)、且つ、配列番号1で示される野生型GLDと比較して阻害剤である1,10-フェナントロリンに対する感受性が低下した改変型GLD。 - フラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)のアミノ酸配列が配列番号1で示される、請求項1記載の改変型GLD。
- 阻害剤が終濃度1mMの条件で共存した測定系において、阻害剤が共存しない場合と比べ85.4%以上の相対活性を示す、請求項1又は2記載の改変型GLD。
- 阻害剤が終濃度1mMの条件で共存した測定系において、阻害剤が共存しない場合と比べ90%以上の相対活性を示す、請求項3記載の改変型GLD。
- 請求項1ないし4のいずれか一項に記載の改変型GLDをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号1で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素(GLD)アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが配列番号2に示される塩基配列を有する、請求項5記載のポリヌクレオチド。
- 請求項5又は6記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
- 請求項7記載の組換えベクターを用いることによって作製された形質転換細胞。
- 大腸菌、酵母、又は糸状菌である、請求項8記載の形質転換細胞。
- 請求項8又は9の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から改変型GLDを採取することを特徴とする、改変型GLDの製造方法。
- 請求項1ないし4のいずれか一項に記載の改変型GLD又は請求項10記載の製造方法で得られた改変型GLDを使用することを特徴とする、グルコースの測定方法。
- 請求項1ないし4のいずれか一項に記載の改変型GLD又は請求項10記載の製造方法で得られた改変型GLDを含有することを特徴とする、グルコース測定試薬組成物。
- 請求項1ないし4のいずれか一項に記載の変型GLD又は請求項10記載の製造方法で得られた改変型GLDを使用することを特徴とする、グルコース測定用のバイオセンサ。
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