JP2010275216A - 止血剤および血液凝固阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、止血剤を提供することを課題とする。また、本発明はＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤の提供を課題とする。
【解決手段】本発明者らは、ＡＤＡＭ８の発現抑制により血液循環が阻害され、血栓形成にいたることを、生きた個体を用いて証明し、この分子が血液循環を促進し、血栓形成を阻害する活性を有することを見出した。さらに、ＡＤＡＭ８が、血液凝固や血液細胞の移動に関わる糖蛋白質ＰＳＧＬ−１に対し、セレクチンへの結合部位を消失させる限定的分解活性をもつプロテアーゼとして機能することを明らかにした。
【選択図】図５

Description

本発明は、メタロプロテアーゼＡＤＡＭ８の医薬用途に関する。より具体的には、本発明は、ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、止血剤に関する。また、本発明はＡＤＡＭ８タンパク質またはＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤に関する。

ＡＤＡＭ（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）ファミリーに属する膜貫通型レセプタープロテアーゼは、膜結合成長因子および接着分子を分解する細胞外ドメインを有する。その中でも、ＡＤＡＭ８は最初マクロファージ細胞株から単離された分子であり、ＥＳＴ解析により、ヒト、マウスを含む脊椎動物では造血系組織に、ゼブラフィッシュでは腎臓や造血組織に発現することが報告されており、血液や循環器の発生に関与することが示唆されている（非特許文献１−４）。

しかしながら、ＡＤＡＭ８が何を基質とし、血液や循環器においてどのような機能を果たすのかは明らかとなっていなかった。

最近の報告では、ＡＤＡＭ８ノックアウトマウスでは発生は正常に行われ従来の解析での欠陥は見出されないこと（非特許文献５）、ＡＤＡＭ８は脊髄損傷モデルマウスにおいて、内皮細胞に過剰発現し、血管形成を促進すること（非特許文献６）が明らかになっている。また、炎症時に白血球上のＡＤＡＭ８発現量が増加し、Ｌ−セレクチンを分解することから、ＡＤＡＭ８の免疫反応への関与が示唆されている（非特許文献７）。しかしながら、本発明者らが非特許文献７に従って追試をしたところ、ＡＤＡＭ８によるＬ−セレクチンの分解は確認できなかった。また、同文献では、ＡＤＡＭ８が免疫反応において重要であることが示唆されているものの、血小板凝集や血栓形成との関係については何ら議論されていない。さらに単球のアポトーシスにおいてＡＤＡＭ８がＰＳＧＬ−１を分解する可能性に言及した文献も存在するものの（非特許文献８）、具体的には確認されておらず、また、ＰＳＧＬ−１の分解によって、ＡＤＡＭ８が血液や循環器においてどのような機能を果たすのかについても記載されていない。

一方、血小板や血管内皮細胞の表面に存在するＰ−セレクチンおよび、白血球表面に存在するＰ−セレクチンの糖鎖リガンドＰＳＧＬ−１（Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ−１）は、共に接着分子で、白血球と血管壁の接着に関与していることが報告されている。血管損傷では、血小板や血管内皮細胞が活性化されるとともに、これらの接着分子が、血小板凝固や血栓形成を促進し、さらにフィブリンの生成にも関与していることが示唆されている（非特許文献９）。

Ｒｅｉｓｓ， Ｋ． ａｎｄ Ｓａｆｔｉｇ， Ｐ． Ｓｅｍｉｎ．， Ｃｅｌｌ Ｄｅｃ． Ｂｉｏｌ． （２００８） Ｙａｇａｍｉ−Ｈｉｒｏｍａｓａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３７７， ６５２−６ （１９９５） Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２， ５８５−９１ （１９９０） ｄｅ Ｊｏｎｇ， Ｊ． Ｌ． ａｎｄ Ｚｏｎ， Ｌ． Ｉ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ３９， ４８１−５０１ （２００５） Ｋｅｌｌｙ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２３２， ２２１−２３１ （２００５） Ｍａｈｏｎｅｙ Ｅ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ ５１２， ２４３−２５５ （２００９） Ｇｏｍｅｚ−Ｇａｖｉｒｏ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７８， ８０５３−８０６３ （２００７） Ｆｕｒｉｅ Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅｎｄｓ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． １０， １７１−１７８ （２００４） Ｓｔａｍｐｆｉｓｓ ｅｔ ａｌ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． ２８， １３７５−１３７８ （２００８）

これまでＡＤＡＭ８が血液や循環器の発生に関与することが示唆されてきたものの、ＡＤＡＭ８がＰＳＧＬ−１を介した血栓形成のメカニズムに関与しており、これが実際に血液循環の促進に影響していることはこれまで知られておらず、したがって、ＡＤＡＭ８が血液循環関連の疾患に対する治療に使用できることは見出されていなかった。

そこで、本発明は、ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、止血剤を提供することを課題とする。また、本発明はＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤の提供を課題とする。

本発明者らは、ＡＤＡＭ８の発現抑制により血液循環が阻害され、血栓形成にいたることを、生きた個体を用いて証明し、この分子が血液循環を促進し、血栓形成を阻害する活性を有することを見出した。

より詳細には、本発明者らは、ＡＤＡＭ８が、ヒト、マウスにおいては血液細胞・血液細胞を産生する骨髄や胸腺などで高い発現を示すこと、ゼブラフィッシュの成体においては血液を産生する腎臓で、発生過程においても血液細胞を生ずるｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｅｌｌ ｍａｓｓやｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｂｌｏｏｄ ｉｓｌａｎｄ、あるいは哺乳類のＡＧＭ領域に対応すると考えられている大動脈と中心静脈に挟まれた領域で発現があることなどの先行技術情報から、ＡＤＡＭ８が血液生産能に関与していると予測した。

そして、ＡＤＡＭ８が血液生産においてどのような役割を果たしているかを詳細に解明するため、生きたゼブラフィッシュ個体を用いて、ＡＤＡＭ８遺伝子機能阻害実験を行った。その結果、一次造血・二次造血はともに起こるが、これらの血球の移動が阻害され、その結果血液循環が著しく不全となり、高頻度で脈管内でのうっ血あるいは血栓が生じることを見出した。すなわち、本発明者らは、ＡＤＡＭ８が血液細胞で発現し、血液細胞の循環を促進し、うっ血や血栓を防ぐ膜型ＡＤＡＭプロテアーゼであることを明らかにした。

さらに、ＡＤＡＭ８が、血液凝固や血液細胞の移動に関わる糖蛋白質ＰＳＧＬ−１に対し、Ｐ−セレクチンへの結合部位を消失させる限定的分解活性をもつプロテアーゼとして機能することを明らかにした。

まず、ＡＤＡＭ８は造血系細胞の膜表面に高発現するプロテアーゼであることから、本発明者らは、膜表面に局在する因子をその基質候補としてスクリーニングを行った。そして、培養細胞系においてＡＤＡＭ８が、血球細胞の接着・移動に関わる糖蛋白質ＰＳＧＬ−１を分解することを突き止めた。さらに、その機能が哺乳類と魚類で保存されていることも明らかにした。また、ＡＤＡＭ８機能阻害により、個体において内在性のＰＳＧＬ−１の分解が阻害されることを示し、これがＡＤＡＭ８の生理的基質のひとつであることを示した。

ＡＤＡＭ８の血液循環促進・血栓形成阻止因子としての役割、およびそのプロテアーゼ基質分子の同定は、新規の報告である。

即ち、本発明は、具体的には以下の〔１〕〜〔１７〕を提供するものである。
〔１〕ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、止血剤。
〔２〕ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物が、ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物である前記〔１〕に記載の止血剤。
〔３〕ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物が、ＡＤＡＭ８をコードする遺伝子の塩基配列またはその一部に対して、相補的な塩基配列を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、前記〔２〕に記載の止血剤。
〔４〕ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物が、ＡＤＡＭ８の活性を阻害する化合物である前記〔１〕に記載の止血剤。
〔５〕ＡＤＡＭ８タンパク質またはその断片を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤。
〔６〕ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤。
〔７〕ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物が、ＡＤＡＭ８の発現を促進する化合物である、前記〔６〕に記載の血液凝固阻止剤。
〔８〕以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、止血剤のスクリーニング方法：
（ａ）ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；
（ｂ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を検出する工程；および
（ｃ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を阻害する化合物を選択する工程。
〔９〕以下の（ｄ）〜（ｆ）の工程を含む、止血剤のスクリーニング方法：
（ｄ）ＡＤＡＭ８を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；
（ｅ）ＡＤＡＭ８の発現量を検出する工程；および
（ｆ）ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物を選択する工程。
〔１０〕以下の（ｇ）〜（ｉ）の工程を含む、血液凝固阻止剤のスクリーニング方法：
（ｇ）ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；
（ｈ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を検出する工程；および
（ｉ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を促進する化合物を選択する工程。
〔１１〕以下の（ｊ）〜（ｌ）の工程を含む、血液凝固阻止剤のスクリーニング方法：
（ｊ）ＡＤＡＭ８を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；
（ｋ）ＡＤＡＭ８の発現量を検出する工程；および
（ｌ）ＡＤＡＭ８の発現を促進する化合物を選択する工程。
〔１２〕対象において、ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を投与することを特徴とする、止血方法。
〔１３〕対象において、ＡＤＡＭ８タンパク質またはその断片を投与することを特徴とする、血液凝固を阻止する方法。
〔１４〕対象において、ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を投与することを特徴とする、血液凝固を阻止する方法。
〔１５〕止血剤の製造のための、ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物の使用。
〔１６〕血液凝固阻止剤の製造のためのＡＤＡＭ８タンパク質またはその断片の使用。
〔１７〕血液凝固阻止剤の製造のための、ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物の使用。

本発明により、ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、止血剤が提供された。ＡＤＡＭ８の機能抑制により、止血や血友病等の症状の改善など、血液凝固を促進する治療が可能となる。

また、本発明により、ＡＤＡＭ８タンパク質またはＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤が提供された。ＡＤＡＭ８タンパク質を精製・投与することで、その血液循環促進作用を利用した血栓治療やその予防、またはうっ血の予防が可能である。

図１は、ＡＤＡＭ８の発現部位の解析の結果を示す図である。ａは、ヒト血液におけるＡＤＡＭ８遺伝子ファミリーの発現割合をヒトＥＳＴ情報から解析した結果を示す。ｂは、ヒトの組織別ＥＳＴデータから、ＡＤＡＭ８の発現部位を解析した結果を示す。ｃは、ゼブラフィッシュにおける、ＡＤＡＭ８の発現部位をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した写真である。図中の矢印はマクロファージにおける発現、矢頭はＩＣＭ領域における発現を示す。拡大図における白色のバーは、背部大動脈の腹側領域を示す。黒色のバーはそれぞれ１００μｍ。 図２は、ゼブラフィッシュＡＤＡＭ（以下、ｚＡＤＡＭ８ともいう）機能阻害による血栓の形成を示す写真である。ａは、ＡＤＡＭ８の発現阻害胚とコントロールとの蛍光実体顕微鏡像の比較である。図中の矢印は、血栓形成箇所を示す。バー：２５０μｍ。ｂは、ＡＤＡＭ８の発現阻害胚をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより解析した写真である。 図３は、ｚＡＤＡＭ８正常発現個体における血液循環開始の過程を経時的に観察した顕微鏡像を示す。図中ｈｐｓは、受精後の時間を示す。ａは、ゼブラフィッシュ３０時間胚を側面方向から観察した模式図である。体幹部に２本の主要な脈管が形成されており、背側がＤＡ（ｄｏｒｓａｌ ａｏｒｔａ：背側大動脈）、腹側がＰＣＶ（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｃａｒｄｉａｌ ｖｅｉｎ；腹側大静脈）である。ＤＡとＰＣＶの中間部がＩＣＭ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）領域と呼ばれる胎児型造血の場である。ｂは、２０〜３０時間における脈管および血球形成を示す。ｃは、２６〜２８時間における血液循環開始のライブイメージングを示す写真である。右側のバーは、上から、大動脈、ｓｕｂ−ａｏｒｔｉｃ ｒｅｇｉｏｎ、主静脈を示す。ｄは、血液循環開始後に、循環以外の動態を示す血球の例を示す写真である。青はｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ（ＩＣＭ→血管への移動）、黄色はｒｏｌｌｉｎｇ（血管内壁に接着した状態での移動）を示す。 図４は、ｚＡＤＡＭ８機能阻害による血液循環の抑制を経時的に観察した顕微鏡像を示す。バー：２５μｍ。ａは、２６〜３１、および４８時間における、血液循環が起こっている胚の割合を示す図である。ｂは、コントロール胚（上段）およびＡＤＡＭ８発現阻害胚（下段）における血液循環開始後のイメージの比較である。ｃは、ＡＤＡＭ８発現阻害胚におけるｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎを示す写真である。ｄは、ｃと同時期のＡＤＡＭ８発現阻害胚の血球の滞留を示す。 図５は、ＡＤＡＭ８によるＰＳＧＬ−１の分解活性を解析した図および写真である。ａは、ＦＡＣＳ解析によるマウスＡＤＡＭ８（以下、ｍＡＤＡＭ８ともいう）依存的なマウスＰＳＧＬ−１（以下、ｍＰＳＧＬともいう）膜外領域シグナルの検出結果を示す図である。ｂは、ウェスタンブロットによるゼブラフィッシュＰＳＧＬ−１（以下、ｚＰＳＧＬともいう）細胞内領域シグナルの検出結果を示す写真である。上段は、抗ＰＳＧＬ−１抗体による検出、下段は抗ＨＡ抗体による検出を示す。図中のＬ（９０−９５ｋＤ）は完全長のＰＳＧＬ−１、Ｓ（６０−６５ｋＤ）は分解後のＰＳＧＬ−１を示す。＊印はバックグラウンドのバンドを示す。ｃは、ゼブラフィッシュ抽出物を試料とした、ウェスタンブロットによりｚＡＤＡＭ８を介したｚＰＳＧＬともいう）の分解を検出した結果を示す写真である。図中のＬ（〜８０ｋＤ）は完全長のＰＳＧＬ−１、Ｓ（〜４０ｋＤ）は分解後のＰＳＧＬ−１を示す。ｄは、ゼブラフィッシュにおける初期発生での血液循環開始の模式図を示す。 図６は、ウェスタンブロットによるｍＰＳＧＬ細胞内領域シグナルの検出結果を示す写真である。

以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
本発明者らによって、ＡＤＡＭ８が血液循環促進作用を有することが明らかにされた。本発明はこの知見に基づくものである。

本発明者らによって、血液循環促進作用との関係が明らかにされたＡＤＡＭ８遺伝子は、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュにおいて公知である。それぞれの配列の情報は、下記のとおりである。
ヒトＡＤＡＭ８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＮＭ＿００１１０９）の塩基配列を配列番号：１に、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
マウスＡＤＡＭ８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＮＭ＿００７４０３）の塩基配列を配列番号：３に、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
ゼブラフィッシュＡＤＡＭ８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＮＭ＿２００６３７．１）の塩基配列を配列番号：５に、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。

本発明のＡＤＡＭ８遺伝子は、ＡＤＡＭ８タンパク質をコードするものであれば、特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなども含まれる。また、ＡＤＡＭ８遺伝子には、ＡＤＡＭ８タンパク質をコードする限り、遺伝子の縮重変異なども含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって公知の方法を利用して行うことが可能である。

また、ＡＤＡＭ８遺伝子には、種々の生物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の生物においてヒト、マウスまたはゼブラフィッシュのＡＤＡＭ８タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を指す。このようなタンパク質には、例えば、ＡＤＡＭ８タンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、ＡＤＡＭ８タンパク質の部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。

本発明におけるＡＤＡＭ８タンパク質の変異体としては、配列番号：２、４または６に記載のアミノ酸において１以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：２、４または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。

本明細書中において、「ペプチド」とは、２以上のアミノ酸がアミド結合により結合しているものであれば特に限定されない。一般にタンパク質と呼ばれるものも、本発明においてはペプチド中に含むものとする。また、本発明においては「ポリペプチド」も、同様にペプチド中に含むものとする。

本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｒ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。

本発明において、変異するアミノ酸の数は特に限定されず、通常３０アミノ酸以内、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは５アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内であると考えられる。本発明におけるアミノ酸の変異としては、アミノ酸側鎖の性質が維持された、保存的置換であることが好ましい。アミノ酸側鎖の性質の例としては、塩基性側鎖（例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、チロシン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）、硫黄原子含有側鎖（例えば、システイン、メチオニン）を挙げることができる。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。

本発明において、ＡＤＡＭ８タンパク質と「機能的に同等」とは、配列番号：２、４または６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、すなわちＡＤＡＭ８タンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを示す。本発明のＡＤＡＭ８タンパク質の生化学的機能としては、ＡＤＡＭ８のプロテアーゼ活性及びそれに伴う機能、例えば、血栓の形成阻害、血液循環の促進や、ＰＳＧＬ−１の分解などが挙げられる。なお、ＡＤＡＭ８のプロテアーゼ活性は、ＡＤＡＭ８タンパク質の有するプロテアーゼとしての性質だけではなく、基質への結合能などその他の性質によっても左右され得る。また、生物学的な機能には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれる。

機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製する方法は当業者に公知である。このような方法としては、例えばハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ． Ｍ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ９８， ５０３， １９７５）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ． ２３０， １３５０−１３５４， １９８５， Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ．２３９， ４８７−４９１，１９８８）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ＡＤＡＭ８遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号：１、３または５に記載のＤＮＡ）もしくはその一部をプローブとして、またＡＤＡＭ８遺伝子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の生物からＡＤＡＭ８遺伝子の相同遺伝子を単離することは通常行いうることである。

このような相同遺伝子をコードするＤＮＡを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。当業者であれば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を適宜選択することが可能である。一例を示せば、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。当業者であれば、他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）なども適宜選択し得る。

その後の洗浄における条件は、低ストリンジェントな条件では、例えば、０．１％ＳＤＳ、１〜２×ＳＳＣ中にて行うことができる。また高ストリンジェントな条件では、０．１％ＳＤＳ、０．１〜０．５×ＳＳＣなどの条件を挙げることができる。また、温度でハイブリダイズの差を設ける場合には、高ストリンジェントの場合は６８℃、中等度の場合は４２℃、低ストリンジェントの場合は室温（２０−２５℃）で洗浄を行えばよい。ハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待しうる。但し、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、これに限定されるものではない。

単離されたＤＮＡの相同性は、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の相同性は、市販のソフトであるＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ： Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｓｒｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３：６３−６９ （１９９０））等を用いて、決定することができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

本発明者らによって、メタロプロテアーゼであるＡＤＡＭ８の基質がＰＳＧＬ−１タンパク質であることが明らかになった。ＰＳＧＬ−１遺伝子は、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュにおいて公知である。それぞれの配列の情報は、下記のとおりである。
ヒトＰＳＧＬ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＮＭ＿００３００６）の塩基配列を配列番号：７に、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。
マウスＰＳＧＬ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＮＭ＿００９１５１）の塩基配列を配列番号：９に、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
ゼブラフィッシュＰＳＧＬ−１遺伝子（アクセッション番号、ＬＯＣ７９４７２９）の塩基配列を配列番号：１１に、この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１２に示す。

本発明のＰＳＧＬ−１遺伝子は、ＰＳＧＬ−１タンパク質をコードするものであれば、特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなども含まれる。また、ＰＳＧＬ−１遺伝子には、ＰＳＧＬ−１タンパク質をコードする限り、遺伝子の縮重変異なども含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって公知の方法を利用して行うことが可能である。

また、ＰＳＧＬ−１遺伝子には、種々の生物に存在する相同遺伝子も含まれる。ここで「相同遺伝子」とは、種々の生物においてヒト、マウスまたはゼブラフィッシュＰＳＧＬ−１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を指す。このようなタンパク質には、例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質の変異体、アレル、バリアント、ホモログ、ＰＳＧＬ−１タンパク質の部分ペプチド、または、他のタンパク質との融合タンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。

本発明におけるＰＳＧＬ−１タンパク質の変異体としては、配列番号：８、１０または１２に記載のアミノ酸において１以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号：８、１０または１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。

本発明のＰＳＧＬ−１タンパク質と「機能的に同等」とは、配列番号：８、１０または１２に記載のアミノ酸に記載のアミノ酸を含むポリペプチド、すなわちＰＳＧＬ−１タンパク質と同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを示す。

本発明の第一の態様は、ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、止血剤である。

本発明において、ＡＤＡＭ８の「機能を抑制する」とは、ＡＤＡＭ８のプロテアーゼ活性を、薬剤を投与する前の状態より低下させることをいう。薬剤を投与する前の状態よりも低下すれば、正常状態より下のレベルまで低下していなくても本発明の範囲に含まれる。本発明において、ＡＤＡＭ８の機能の抑制は、どのような手段によって行われてもよい。例えば、ＡＤＡＭ８の発現を抑制したり、ＡＤＡＭ８のプロテアーゼ活性を阻害することによって可能である。ＡＤＡＭ８の機能の抑制には、機能の全部を抑制する場合も、一部を抑制する場合も含まれる。

ＡＤＡＭ８の「機能を抑制する化合物」とは、上述のＡＤＡＭ８タンパク質の生化学的機能や生物学的機能を抑制する化合物を意味し、例えば、ＡＤＡＭ８のプロテアーゼ活性を阻害する化合物、ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物などが含まれる。また、「ＡＤＡＭ８の発現を抑制」にはＤＮＡからの発現レベルの抑制も、タンパク質の発現レベルの抑制も含まれる。

本発明において「止血」とは、血管の損傷による血管内からの血液の流出を止めることをいう。この止血には、血管の損傷部位において、出血を止めるために生体が血液を凝固させる一連の分子作用である「血液凝固」が伴い、この血液凝固により生成される血液塊は「血栓」、「血餅」または「塞栓」等と称される。

本発明の「止血剤」は、前記血液凝固に作用して止血を促進する、および／または、血栓形成を促進して止血を促進する作用を有する薬剤を示す。抗出血剤、凝血促進剤等と称される薬剤もまた、本発明の「止血剤」に含まれる。

本発明のＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する止血剤の一つの態様として、ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物を有効成分として含有する止血剤を挙げることができる。本発明においてＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物の具体的な例として、ＡＤＡＭ８の発現を抑制する機能を有する核酸を挙げることができる。このような核酸には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどが含まれる。

本発明のＡＤＡＭ８の発現を抑制する機能を有する核酸の一つの態様として、アンチセンスオリゴヌクレオチドを挙げることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＤＡＭ８の遺伝子又はその転写物であるｍＲＮＡに結合してその発現を抑制し得るものであれば、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１、３または５のヌクレオチド配列またはその一部に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ若しくはＲＮＡ、あるいは、配列番号１、３または５のヌクレオチド配列を含むＡＤＡＭ８遺伝子に対応するｍＲＮＡの配列又またはその一部に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ若しくはＲＮＡを挙げることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、対象における内因性のＡＤＡＭ８遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。具体的には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的とする遺伝子又はその転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。

アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、１５塩基〜３０塩基程度、好ましくは２０塩基〜２５塩基程度である。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の核酸合成技術又はＤＮＡ組換え技術を用いて合成することができる。ＤＮＡ組換え技術によって合成する場合、配列番号：１、３または５の配列を含むベクターＤＮＡを鋳型にして、増幅しようとする配列を挟み込むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って標的配列を増幅し、必要に応じてベクター中にクローニングして、アンチセンスＤＮＡを生成することができる。また、アンチセンスＲＮＡを合成する場合には、前記の方法で合成したＤＮＡを鋳型として、ＲＮＡポリメラーゼにより合成してもよい。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、具体的には、配列番号：１３に記載の塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを挙げることができる。

本発明のＡＤＡＭ８の発現を抑制する機能を有する核酸の別の態様として、ＲＮＡｉを媒介する核酸分子を挙げることができる。ＲＮＡｉは標的遺伝子と相補的な二本鎖のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）により、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡが配列特異的に分解される現象である（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。この現象を利用することにより標的遺伝子の発現を抑制することができる。

本発明で使用可能なｓｉＲＮＡは、ＡＤＡＭ８遺伝子に転写されるｍＲＮＡと相補的な配列を含む。具体的には、本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号：１、３または５のヌクレオチド配列によってコードされるｍＲＮＡに含まれる１５〜３５塩基対、好ましくは１９〜２５塩基対、より好ましくは２１〜２３塩基対のセンス鎖配列とそれに相補的なアンチセンス鎖配列を含むことができる。ｓｉＲＮＡは、当業者であれば公知の技術に基づき設計可能である（例えば、Ｈｓｉｅｈ ＡＣ． ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｆｅｂ ０９；３２（３）：８９３−９０１．，；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｍａｒ；２２（３）：３２６−３０．；Ｕｉ−Ｔｅｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ． （２００４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｆｅｂ ０９；３２（３）：９３６−４８．）。

本発明のｓｉＲＮＡは、当業者に周知の核酸合成技術を用いて合成することができる。また、ｓｈＲＮＡなどからダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅ様のヌクレアーゼによるプロセシングを介して誘導されてもよい。また、本発明のＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に対するアンチセンス鎖ＲＮＡをコードするアンチセンスコードＤＮＡと、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域のセンス鎖ＲＮＡをコードするセンスコードＤＮＡにより発現することもできる。本発明のｓｉＲＮＡ発現システムを、ベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンス鎖ＲＮＡ、センス鎖ＲＮＡを発現させてもよいし、異なるベクターからそれぞれアンチセンス鎖ＲＮＡ、センス鎖ＲＮＡを発現させてもよい。

また、本発明のＡＤＡＭ８の発現を抑制する機能を有する核酸の別の態様として、リボザイムを挙げることができる。リボザイムとは、触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、ＡＤＡＭ８ ｍＲＮＡを部位特異的に切断する活性を有するものが好ましい。このようなリボザイムにはハンマーヘッド型やヘアピン型のリボザイムが含まれる。

ハンマーヘッド型リボザイムは、ＧＵＣなどの特定のコドンを含む標的配列を切断することが知られている。このような標的配列は本発明のＡＤＡＭ８ ｍＲＮＡ中に複数存在する。リボザイムのｍＲＮＡへの結合部位を、ＡＤＡＭ８における標的配列近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計し、標的ｍＲＮＡの切断に使用可能なハンマーヘッド型リボザイムを作出することは当業者に公知である。

本発明のＡＤＡＭ８の発現を抑制する核酸を、対象に投与する際には、前記核酸を患部、好ましくは血中または血管損傷部位、に直接注入するか、又は前記核酸の発現が可能なベクターを使用することが好ましい。或いは、前記核酸又はベクターを、リポソーム、例えばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチンまたは正電荷コレステロールなどの正電荷リポソームと複合体形成し、これを使用することもできる。また、ウイルスベクターを用いて患部に導入し、細胞感染させることによって細胞内に遺伝子導入することができる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクターや、アデノ髄伴ベクターなどを使用することがきる。ＡＤＡＭ８の発現を抑制する核酸の投与は、上記に限定されるものではなく、当業者に公知の種々の方法を用いて行うことができる。

ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する止血剤の別の態様として、ＡＤＡＭ８の活性を阻害する化合物を有効成分として含有する止血剤を挙げることができる。ＡＤＡＭ８の活性を阻害する化合物は、ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１へのプロテアーゼ活性を阻害することにより、ＰＳＧＬ−１の分解を阻害し、血液の凝集を促進することができる。

ＡＤＡＭ８の活性を阻害する化合物は、低分子化合物であっても、抗体等の高分子化合物であってもよい。また、アプタマーなどの核酸分子を使用することもできる。

ＡＤＡＭ８の活性を阻害する低分子化合物の例としては、ＡＤＡＭ８のプロテアーゼ機能を阻害する公知のプロテアーゼインヒビターを使用することができる。例えば、ＡＤＡＭファミリーに共通して作用することが知られている、ＴＡＰＩ−２やＧＭ６００１、ＴＭＩ−１、ＧＷ９４７１、Ｃａｌｂｉｐｃｈｅｍ ＭＭＰ９／１３（Ｍｏｓｓ ａｎｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６６ （２００７） １４４−１４８；Ｙｏｓｈｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２５ （２００９） ７１−８１）、１−１０，フェナントロリン（ＣＡＳ Ｎｏ． ５１４４−８９−８）などを挙げることができる。

さらに、ＡＤＡＭ８の活性を阻害する化合物として、ＡＤＡＭ８の活性を特異的に阻害する低分子化合物（例えば特開２００８−１８４３８７に記載の化合物）などを挙げることもできる。

また、ＡＤＡＭ８の活性を阻害する高分子化合物の例としては、ＡＤＡＭ８タンパク質に特異的に結合する抗体または抗体断片を挙げることができる。このような抗体または抗体断片には、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｓｃＦｖ、二重特異抗体、合成抗体などが含まれる。これらの抗体の作成方法は当業者に公知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ））により行うことができる。本発明の抗体の調製を行う場合には、本発明のタンパク質全体を用いて免疫する方法の他に、部分ペプチドを用いて免疫して調製することも可能である。

ＡＤＡＭ８の活性を阻害する核酸分子としては、アプタマーやデコイ核酸を挙げることができる。本発明に使用できるアプタマーは、ＡＤＡＭ８タンパク質に特異的に結合する核酸分子であり、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法（インビトロセレクション法ともいう）（Ｔｕｅｒｋ， Ｃ． ａｎｄ Ｇｏｌｄ， Ｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９， ５０５−５１０（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４６（６２８７），８１８−２２（１９９０））などの公知の方法で取得することが可能である。また、本発明に使用できるデコイ核酸はＡＤＡＭ８の転写調節因子の結合領域を模倣する核酸分子である。デコイ核酸はＡＤＡＭ８転写調節因子の結合領域と相同性が高いことが好ましいが、転写調節因子に結合する限り完全に相補的でなくともよい。

ＡＤＡＭ８の活性を阻害する核酸分子を対象に投与する際には、前記核酸分子を患部、好ましくは血中または血管損傷部位、に直接注入するか、又は前記核酸の発現が可能なベクターを使用することが好ましい。

本発明の「止血剤」は、血管損傷などによる出血の止血に使用できる他、血友病、フォン・ヴィレブランド病、播種性血管内凝固症候群、突発性血小板減少性紫斑病等の凝固・線溶作用に対する異常疾患の治療にも使用することができる。

本発明の第二の態様は、ＡＤＡＭ８タンパク質またはその一部を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤である。

本発明において「血液凝固」とは、血小板同士や血小板と血管内皮細胞が接着し、または血液細胞が血管壁に接着し、フィブリンなどとともに血餅を形成する一連の分子作用をいう。本発明の「血液凝固阻止剤」は、前記血液凝固を阻止して血液循環を促進する、血管中に生成した血栓を溶解して血液循環を促進する等の作用を有する薬剤を示す。抗凝血剤、血液循環促進剤、血栓形成阻害剤などの薬剤もまた、本発明の「血液凝固阻止剤」に含まれる。

ＡＤＡＭ８タンパク質の精製は、当業者に公知の方法で行うことができる。一例を示せば、まず、配列番号：２、４または６のアミノ酸配列をコードする遺伝子、または配列番号：１、３、または５を含む塩基配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のＡＤＡＭ８タンパク質を公知の方法で精製することができる。

本発明で用いる組換えベクターとしては、宿主細胞を形質転換し得るものであればよく、宿主細胞に応じて大腸菌用のプラスミド、枯草菌用のプラスミド、酵母用のプラスミド、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。これらには、その宿主細胞にてタンパク質を適切に発現させ得るプロモーター等の制御配列を有しているものが好ましい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。また、宿主細胞としては、組換えベクターにて外来性遺伝子を発現できる物であればよく、一般的には、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。

宿主細胞に組換えベクターを移入する方法としては、一般的に常用されている方法を用いればよく、例えば、大腸菌の場合は塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法、酵母の場合は塩化リチウム法やエレクトロポレーション法が利用できる。また、動物細胞の形質転換は、エレクトロポレーション等の物理的方法、あるいは、リポソーム法やリン酸カルシウム法等の化学的方法、あるいはレトロウイルス等のウイルスベクターを用いて行なうことができる。

形質転換体である宿主細胞の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。宿主細胞が大腸菌、枯草菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が好ましく、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

上記培養物から本発明の膜タンパク質を分離精製するには、通常の一般的な精製により行なうことができる。すなわち、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により膜タンパク質の粗抽出液を調製する。緩衝液中には、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。このようにして得られた抽出液、あるいは培養上清中に含まれるタンパク質の精製は、公知の精製方法によって行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、フィルター、限外ろ過、ゲルろ過、電気泳動、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、タンパク質の分離、精製を行うことが可能である。

また、発現タンパク質の精製を容易にするために、前記発現ベクターにタグを組み込んでおくこともできる。タグの例としては、例えば、ＧＳＴタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）などが挙げられる。

また、本発明の血液凝固阻止剤の有効成分としてＡＤＡＭ８タンパク質断片を用いることもできる。本発明に用いることができるＡＤＡＭ８タンパク質断片としては、プロテアーゼ活性を有する部分を含む断片であれば特に限定されることはない。このような部分は、当業者であれば適宜選択し得るが、例えば、ゼブラフィッシュのＡＤＡＭ８のアミノ酸配列（配列番号：６）における第１９７位〜３９３位に相当する配列を含む部分である。

本発明において使用できるＡＤＡＭ８タンパク質断片のより好ましい例として、ＡＤＡＭ８タンパク質の細胞外ドメインを挙げることができる。ＡＤＡＭ８タンパク質の細胞外ドメインは、例えば、ヒトのＡＤＡＭ８アミノ酸配列（配列番号：２）における第１位〜６５３、マウスＡＤＡＭ８アミノ酸配列（配列番号：４）における第１位〜第６５３位、またはゼブラフィッシュのＡＤＡＭ８のアミノ酸配列（配列番号：６）における第１位〜第６５２位までの配列に相当する部分である。

本発明の第三の態様は、ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤である。本発明においてＡＤＡＭ８の「機能を亢進する」とは、ＡＤＡＭ８のプロテアーゼ活性を促進することをいう。ＡＤＡＭ８の「機能を亢進する化合物」とは、上述のＡＤＡＭ８タンパク質の生化学的機能や生物学的機能を促進する化合物を意味し、ＡＤＡＭ８のプロテアーゼ活性を促進する化合物、ＡＤＡＭ８の発現を促進する化合物などが含まれる。「ＡＤＡＭ８の発現を促進」にはＤＮＡからの発現レベルの促進も、タンパク質の発現レベルの促進も含まれる。ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物は、投与前の状態よりも機能を亢進するものであれば特に限定されず、好ましくはＡＤＡＭ８の機能を約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上亢進する化合物であれば特に限定されない。

本発明のＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物の具体的な例として、ＡＤＡＭ８の発現を促進する化合物を挙げることができる。ＡＤＡＭ８の発現を亢進する化合物としては、例えば、ＡＤＡＭ８タンパク質またはその一部をコードする核酸などが挙げられる。具体的には、配列番号２、４または６に記載のタンパク質をコードする核酸、ゼブラフィッシュのＡＤＡＭ８のアミノ酸配列（配列番号：６）における第１位〜第６５２位までのアミノ酸配列を含む部分タンパク質を含むＡＤＡＭ８タンパク質断片をコードする核酸などが挙げられる。このような核酸には、投与対象においてタンパク質を適切に発現させ得るプロモーター、エンハンサー等の制御配列を有しているものが好ましい。対象への前記核酸の投与方法としては、前述のＡＤＡＭ８の発現を抑制する核酸の投与方法と同様の方法を適宜選択することができる。

また、ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物は、ＡＤＡＭ８タンパク質のプロテアーゼ活性を促進する化合物であってもよい。このような化合物には、低分子化合物、タンパク質等が含まれる。

本発明の「血液凝固阻止剤」は、血栓が血管の損傷等を原因として形成された部位以外の部位に移動して、血管をふさぐ血栓塞栓症（例えば、静脈血栓症、心筋梗塞章、肺塞栓症、脳塞栓症、四肢動脈血栓塞栓症等）の治療に使用することができる。また、異常な血液凝固を阻止して、血液循環の促進やうっ血予防や、血栓の線溶作用が働かずに起きる種々の疾患の治療に使用することができる。具体的な例としては、汎発性血管内血液凝固症候群の治療などが挙げられる。さらに、本発明の「血液凝固阻止剤」は、医師等による処置における、好ましくない血液凝固の予防にも使用することができる。具体的には、血液体外循環時における灌流血液の凝固防止、血管カテーテル挿入時の血液凝固の防止、輸血または血液検査の際の血液凝固の防止、手術に伴う血栓塞栓症の予防または治療などが挙げられる。

本発明者らは、ＡＤＡＭ８が血液循環促進作用を有することを見出した。より具体的には、ＡＤＡＭ８が、血液凝固や血液細胞の移動に関わる糖蛋白質ＰＳＧＬ−１に対し分解作用を有することを見出した。この結果は、ＡＤＡＭ８を標的とした止血剤または血液凝固阻止剤のスクリーニング方法が可能であることを示す。

本発明のスクリーニング方法に用いる被検化合物は特に限定されず、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合物または混合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、抗体ライブラリー、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。

本発明のスクリーニング方法の第一の態様は、ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を阻害する化合物のスクリーニングに関する。このスクリーニングにおいてはまず、（ａ）ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する細胞に候補化合物を接触させる。次いで、（ｂ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を検出する。次いで、（ｃ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を阻害する化合物を選択する。この方法によって、選択された化合物は、止血剤の候補化合物になりうる。また、後述のスクリーニング方法の非検化合物として使用することもできる。

本発明のスクリーニング方法に用いる細胞は、ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する細胞であれば、どのような細胞であってもよい。ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する生体から分離した細胞やその初代培養株、継代培養株であってもよく、実験用に確立された細胞株であってもよい。実験用に確立された細胞株としては、例えばＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＭＲＣ５（ヒト胎児正常肺）、ＵｔＳＭＣ（ヒト正常子宮平滑筋）、Ａ５４９（ヒト肺癌）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌）、Ｃａｃｏ２（ヒト大腸癌）、ＭＧ６３（ヒト骨肉腫）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞性白血病）、Ｍｏｌｔ４（ヒトＴ細胞性白血病）、Ｋ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病）、Ｕ９３７（ヒト単球性白血病）、Ａ１７２（ヒト神経膠芽腫）、ＰＡ１（ヒト卵巣性テラトカルシノーマ）、ＭＣＦ７（ヒト乳癌）、ＰＣ１２（ラット褐色細胞腫）、ＣＨＯ（ハムスター卵巣）、ＣＯＳ７（サル腎臓）、Ｖｅｒｏ（サル腎臓）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胎児繊維芽細胞）、ＳＦＭＥ（マウス胎児正常神経幹細胞）、ＥＳ−Ｄ３（マウス胚性幹細胞）、ＳＴＯ（マウス胚細胞）などが挙げられる。また、菌類としては出芽酵母、分裂酵母などが挙げられる。また、これらに所望の遺伝子を形質転換させた細胞であってもよい。さらに、生体から分離した細胞の他、受精卵や発生過程の胚等を用いることもできる。

これらの細胞を培養する方法は、上述に記載の方法に従って行うことができる。また、ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する細胞としてゼブラフィッシュ受精卵を使用することもできる。培養液中でゼブラフィッシュ受精卵に候補化合物を接触させ、ＡＤＡＭ８の活性を検出することにより、より迅速にスクリーニングを行うことができる。

ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を検出する方法としては、例えば、ＰＳＧＬ−１の分解産物が生じるか否かを検出する方法が挙げられる。一例を挙げれば、上記工程（ｃ）において、ＰＳＧＬ−１を発現する細胞からタンパク質試料を調製する。これを電気泳動した後、ＰＳＧＬ−１の細胞内ドメインを認識する抗体を用いたウェスタンブロッティングを行うことにより、ＰＳＧＬ−１の細胞外ドメインが分解されたか否かをＰＳＧＬ−１タンパク質のサイズにより確認することができる。ＡＤＡＭ８の活性が抑制され、ＰＳＧＬ−１細胞外領域の分解が抑制された場合には、天然のＰＳＧＬ−１タンパク質と同じサイズのＰＳＧＬ−１が検出される。タンパク質試料の調製、電気泳動、ウェスタンブロッティングなどの操作は当業者に公知の方法により行うことができる。

本発明のスクリーニング方法の第二の態様は、ＡＤＡＭ８の発現レベルを減少させる化合物のスクリーニング方法に関するものである。ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物は止血剤の候補化合物になりうる。

このスクリーニングにおいては、まず、（ｄ）ＡＤＡＭ８を発現する細胞に候補化合物を接触させる。次いで、（ｅ）ＡＤＡＭ８の発現量を検出する。次いで、（ｆ）ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物を選択する。この方法によって、選択された化合物は、止血剤の候補化合物になりうる。

このような細胞としては、上述のとおりＡＤＡＭ８を発現する細胞であれば、特に限定されない。ＡＤＡＭ８を発現する生体から分離した細胞やその初代培養株、継代培養株であってもよく、実験用に確立された細胞株であってもよい。実験用に確立された細胞株としては、上述のスクリーニング方法と同様の培養細胞などを使用可能である。また、出芽酵母、分裂酵母などの菌類も使用可能である。また、上述のような種々の形質転換細胞を用いることもできる。さらに、生体から分離した細胞の他、受精卵や発生過程の胚等を用いることもできる。本発明において「接触」は、例えば、細胞の培養液に被検化合物を添加することにより行うことができる。このスクリーニングにおいては、次いで、該細胞におけるＡＤＡＭ８タンパク質をコードするＤＮＡまたはＡＤＡＭ８タンパク質の発現レベルを測定し、被検化合物を接触させていない場合と比較して、ＡＤＡＭ８の発現レベルを減少させる化合物を選択する。

本発明のスクリーニング方法において、「ＡＤＡＭ８の発現を抑制」にはＤＮＡの発現レベルの抑制も、タンパク質の発現レベルの抑制も含まれる。

ＤＮＡの発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによってＤＮＡの発現レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、ＤＮＡの発現レベルを測定することも可能である。

また、タンパク質の発現レベルの測定も公知の方法によって行うことができる。例えば、ＡＤＡＭ８タンパク質を含む画分を定法に従って回収し、該ＡＤＡＭ８タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することができる。また、ＡＤＡＭ８タンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法などを実施し、該ＡＤＡＭ８タンパク質の発現を検出することも可能である。

ＡＤＡＭ８タンパク質をコードするＤＮＡの発現レベルを減少させる化合物のスクリーニングとしては非ヒト動物を使用することもできる。まず、ＡＤＡＭ８タンパク質をコードするＤＮＡを有する非ヒト動物に被検化合物を投与する。ＡＤＡＭ８タンパク質をコードするＤＮＡを有する非ヒト動物として、例えばゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ブタ、ネコ、サル、スナネズミ、ハムスター等の実験動物を用いることができるが、これらに制限されるものではない。

非ヒト動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的または非経口的に行うことができるが、それらに限定されない。被検化合物がタンパク質である場合には、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、非ヒト動物に該遺伝子を導入することも可能である。

このスクリーニングにおいては、次いで、該非ヒト動物におけるＡＤＡＭ８タンパク質をコードするＤＮＡの発現レベルを測定し、被検化合物を投与していない場合と比較して、該ＤＮＡの発現レベルを減少させる化合物を選択する。ＤＮＡの発現レベルは、上述の方法で測定することができる。

本発明のスクリーニング方法の第三の態様は、ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を促進する化合物のスクリーニングに関する。このスクリーニングにおいてはまず、（ｇ）ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する細胞に候補化合物を接触させる。次いで、（ｈ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を検出する。次いで、（ｉ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を促進する化合物を選択する。この方法によって、選択された化合物は、血液凝固阻止剤の候補化合物になりうる。

このスクリーニング方法は、工程（ｇ）〜（ｈ）までを、上述の第一のスクリーニングの態様における工程（ａ）〜（ｂ）と同様に行うことができる。次いで工程（ｉ）において、化合物と接触されない場合と比較して、天然ＰＳＧＬ−１よりもサイズの小さいＰＳＧＬ−１タンパク質のシグナルが増強した場合には、ＡＤＡＭ８の活性が促進されたと判断することができる。

本発明のスクリーニング方法の第四の態様は、ＡＤＡＭ８の発現レベルを促進させる化合物のスクリーニング方法に関するものである。ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物は血液凝固阻止剤の候補化合物になりうる。このスクリーニングにおいてはまず、（ｊ）ＡＤＡＭ８を発現する細胞に候補化合物を接触させる。次いで、（ｋ）ＡＤＡＭ８の発現量を検出する。次いで、（ｌ）ＡＤＡＭ８の発現を促進する化合物を選択する。細胞におけるＡＤＡＭ８タンパク質をコードするＤＮＡまたはＡＤＡＭ８タンパク質の発現レベルの測定は、上述のスクリーニング方法の第二の態様と同様に行うことができる。

本発明のＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、止血剤、または、ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤が投与される対象は、魚類または哺乳動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。

本発明の止血剤、または、血液凝固阻止剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、通常有効成分である、ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物、または、ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇを１回〜数回に分けて投与する。

本発明の止血剤、または、血液凝固阻止剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、それ自体は上記の止血効果または血液凝固阻止効果を有する材料であってもよいし、前記効果を有さない材料であってもよく、有効成分であるＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物、または、ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物とともに投与可能な材料を意味する。製剤上許容しうる担体は、薬理学的及び製剤学的に許容されるものであればよく、特に制限されない。例えば、賦形剤、結合剤、分散剤、増粘剤、滑沢剤、ｐＨ調整剤、可溶化剤等の一般に製剤の製造に使用される担体のほか、抗生物質、抗菌剤、殺菌剤、防腐剤、ビルダー、漂白剤、酵素、キレート剤、消泡剤、着色料（染料、顔料等）、柔軟剤、保湿剤、界面活性剤、酸化防止剤、香料、矯味剤、矯臭剤、溶媒等が含まれる。

本発明の化合物は、通常の医療製剤の形態に製剤することができる。当該医療製剤としては、上記薬理学的担体を用いて適宜調製される。医療製剤の形態としては特に限定はなく、治療目的に応じて適宜選択して使用される。その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤、乳剤）等が挙げられる。これら製剤は、通常用いられる方法により製造すればよい。

なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。

また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。

第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。

〔実施例１〕ＡＤＡＭ８の発現部位の解析
ＡＤＡＭファミリーのデータベース上の発現データを解析することによりＡＤＡＭ８の発現の特異性を検証した。

血液におけるＡＤＡＭ遺伝子ファミリーのＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のヒトＥＳＴ情報（２００９年、３２８日）から抽出した。

ホールマウントｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ：Ｗｈｏｌｅ ｍｏｕｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）のプローブには、ｚＡＤＡＭ８のアミノ酸コード領域の全長にあたる２５３２塩基を用いた。プローブ配列は野生型ゼブラフィッシュ２４時間胚より抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡから逆転写ＰＣＲ法を用いて単離した。染色したサンプルは野生型ゼブラフィッシュ２４時間胚を用いた。反応条件等は文献（Ｈａｎａｏｋａ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ（２００６）１１， ２９３-３０３）に従って行った。

ＥＳＴ情報の解析の結果、ヒトおよびマウスにおいて血液中で主に発現しているＡＤＡＭ遺伝子はＡＤＡＭ８であった（ヒトについては図１ａ、マウスはデータ示さず）。また、ゼブラフィッシュＡＤＡＭ８は生体の主な造血組織である腎臓で高度に発現が見られた。また、ヒトの組織別ＥＳＴデータによると、ＡＤＡＭ８は造血系の組織および／または器官に発現しており、基質であるＰＳＧＬ−１も同様の発現パターンを示すことが明らかになった（図１ｂ）。
ＷＩＳＨの結果、ゼブラフィッシュＡＤＡＭ８は、背部大動脈腹側のＩＣＭ（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）領域で発現していることが明らかになった（図１ｃ）。この背部大動脈の腹側は、ゼブラフィッシュにおける造血の場であり、哺乳類の大動脈・性腺・中腎（ＡＧＭ）領域にあたる。
以上より、ＡＤＡＭ８が血液生産能に関与していることが示唆された。

〔実施例２〕ゼブラフィッシュＡＤＡＭ８機能阻害による血栓の形成
本実験には赤血球で特異的に蛍光色素を発現するｇａｔａ１：ＲＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュを用い、生きた個体での赤血球の観察を行った。トランスジェニックゼブラフィッシュは、京都大学医学研究科の川原敦雄博士（現・国立循環器病センター）より供与を受けた。観察には蛍光実体顕微鏡ＭＺ−１６ＦＡ（ライカ社製）を用いた。
ｚＡＤＡＭ８の発現抑制実験を行うために、ｚＡＤＡＭ８翻訳開始点近傍配列に特異的に結合し、タンパク質合成を阻害するモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを作成した。配列設計・合成はＧｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ社に委託した。使用したＡＤＡＭ８モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡ−３’（配列番号：１３）である。モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを０．１ｍＭの濃度でインジェクションバッファー（０．２５％ フェノールレッド、 １２０ｍＭ ＫＣｌ、 ２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４）に溶解し、マイクロキャピラリーによる直接注入法により、ゼブラフィッシュ１細胞期受精卵の卵黄部分に注入した。コントロール実験として、ｚＡＤＡＭ８発現抑制モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドに対し５塩基の変異を加えたオリゴヌクレオチドを注入した胚を作成した。使用したコントロールのオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＴＡＴＡＴＡＣＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＣＧＧＡＴＣＧＣ−３’（配列番号：１４）である。オリゴヌクレオチド注入後のゼブラフィッシュ胚は２７℃で静置した。
４８時間後、蛍光実体顕微鏡下で赤血球の分布を観察し、正常発生胚（コントロール実験）とｚＡＤＡＭ８発現抑制胚を比較した。
観察結果を顕微鏡下で撮影した写真を図２ａに示す。
また、３０時間後のｚＡＤＡＭ８発現抑制胚について、実施例１と同様の方法でＷＩＳＨを行った（図２ｂ）。

ＴＧ：ＧＡＴＡ−１−ＲＦＰ（赤血球系列の前駆細胞をＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）により可視化したトランスジェニックゼブラフィッシュ）を用いて、個体でのＡＤＡＭ８生理活性についての検証をおこなった。ｚＡＤＡＭ８の発現を抑制するモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを卵に注入しｚＡＤＡＭ８の発現阻害をおこなった個体（４８時間胚）では、血液循環が著しく抑制され、中心静脈内あるいは心臓付近（キュビエ管など）、頭部などでの著しいうっ血あるいは血栓を生じた（図２ａ）。また、ＷＩＳＨの結果においても、赤血球はＩＣＭ領域から移動せず体幹部に蓄積する様子が観察された（図２ｂ）。なお、ｇａｔａ−１は赤血球分化に必須な転写因子、α−ｅ１ｇｌｏｂｉｎはヘモグロビンを構成するタンパク質であり、共に赤血球を標識するマーカー遺伝子である。このことから、ＡＤＡＭ８は血液循環促進・血栓阻害に関わる生理活性をもつことが明らかとなった。

〔実施例３〕ｚＡＤＡＭ８機能阻害による血液循環の抑制
トランスジェニックゼブラフィッシュのｚＡＤＡＭ８の発現抑制は、実施例２と同様の方法で行った。コントロールには、ｚＡＤＡＭ８を発現抑制していないトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた。ｚＡＤＡＭ８発現抑制個体の観察は受精後２６時間後より１時間置きに３１時間後まで、さらに４８時間後の計７回、蛍光観察による目視で血液循環の有無を判別し記録した。コントロール個体の観察は受精後２０時間から行った。観察には蛍光実体顕微鏡ＭＺ−１６ＦＡ（ライカ社製）を用いた。また、顕微鏡像の記録には共焦点顕微鏡ＴＣＳ−ＳＰ５（ライカ社製）を用いた。

まず、ｚＡＤＡＭ８正常発現個体において血液循環開始の過程を経時的に観察した（図３）。図３ｂに示すように、２０時間において、まずDAの前駆細胞が背側に移動した。この際、ＰＣＶとＩＣＭの境界が明確でないため、この部分を「ＤＡに隣接した非ＤＡ領域」という意味でｓｕｂ−ａｏｒｔｉｃ ｒｅｇｉｏｎと呼ぶこととする。２４時間胚ではＰＣＶが明確に分化しはじめた。このときＩＣＭ領域には、血管内に入る前の未熟な赤血球が蓄積していた。さらに、３０時間胚では、ＩＣＭ領域から血管内への血球の移動がほぼ終了し、ＩＣＭ領域に該当する部分が縮小し、血管は太い管状構造をとった。また、図３ｃに示すように、２６〜２８時間において、ＩＣＭから脈管（ＤＡ、ＰＣＶ）への血球の移動が起こり、その後に突如として血液循環が開始した（７４’００""前後）。
また、図ｄには、血液循環開始後に循環以外の動態を示す血球の例を示す。青はｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ（ＩＣＭ→血管への移動）、黄色はｒｏｌｌｉｎｇ（血管内壁に接着した状態での移動）を示す。
ゼブラフィッシュ正常発生個体において、多くの個体では血液循環は受精後約２７〜２９時間経過後から開始された（図３ｂ、図４ａ、および、図４ｂ上段）。しかしｚＡＤＡＭ８の発現阻害個体においては、このような血液循環の開始がほとんど見られなくなった。受精後４８時間においても約半数の個体では血液循環が全く見られず、ｚＡＤＡＭ８の作用が正常な血液循環開始に必要であることが明らかとなった（図４ａ、図４ｂ下段、および、図４ｄ）。
なお、ｚＡＤＡＭ８正常発現個体においても、発現抑制個体においても、ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎおよびｒｏｌｌｉｎｇは正常に起こっていたことから、ＡＤＡＭ８は血球の血管内皮との接着を切断する作用があることが示唆された（図４ｃ）。

〔実施例４〕ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性
（４−１）ＦＡＣＳ解析によるＰＳＧＬ−１膜外領域シグナルの検出
ｍＰＳＧＬのセレクチン結合領域に対する抗体を用いたＦＡＣＳ解析により、培養細胞内で発現させたｍＰＳＧＬ分子の膜外領域のシグナルの、ｍＡＤＡＭ８の有無による変化を検出した。
本実験では、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。抗体は、ｍＰＳＧＬ（ＮＭ＿００９１５１）のセレクチン結合領域である細胞外領域特異的モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：４ＲＡ１０， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いた。ＦＡＣＳ解析には、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。
継代後１日のＨＥＫ２９３細胞へＣＭＶプロモーターに連結したｍＰＳＧＬ ｃＤＮＡを導入し、２４時間培養した。ＤＮＡはｐＣＩベクター（プロメガ社）を用いて導入した。トランスフェクションマーカーには、同様にＣＭＶプロモーターに連結したＧＦＰを用いた。マウスＡＤＡＭ８（ＮＭ＿００７４０３）および、プロテアーゼ活性欠損型マウスＡＤＡＭ８（ＥＱ変異体：３３０番目のアミノ酸"Ｅ"を"Ｑ"に置換）も同様にＣＭＶプロモーターによる発現系で導入した。培養細胞へのＤＮＡトランスフェクションには、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ ａｍｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。導入条件は付属マニュアルに倣った。
トランスフェクションの２４時間後に、培養細胞を抗マウスＰＳＧＬ−１抗体および二次抗体（Ａｌｅｘａ６４７， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）にて生染色し、ＦＡＣＳによりｍＰＳＧＬの膜外領域のシグナルを検出した。サンプル毎のトランスフェクション効率の違いを考慮して、トランスフェクションマーカーであるＧＦＰのシグナル量によりｍＰＳＧＬのシグナル量を補正した。
補正後のシグナル量に関して、ｍＰＳＧＬのみをトランスフェクションした際の値を１とし、マウスＡＤＡＭ８およびＥＱ変異体の共発現時のシグナル量を比較した。グラフ化したものが図５ａである。

ｍＡＤＡＭ８の存在下で膜外シグナル強度は有意に低下したが、プロテアーゼ活性欠損型ＥＱ ｍＡＤＡＭ８の存在下ではシグナルに変化はなかった。したがってＰＳＧＬ−１膜外領域がＡＤＡＭ８により蛋白分解を受け、セレクチン結合性を失うことが示唆された。

（４−２）ウェスタンブロッティングによるＰＳＧＬ−１細胞内領域に付加したシグナルの検出
本実験にも、ＨＥＫ２９３細胞を用いた。ウェスタンブロッティングに関しては、抗ｚＰＳＧＬ抗体を用いて検出を行った（図５ｂ上段）。二次抗体には抗ラビットＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を用いた。また、ｚＰＳＧＬのＣ末端にＨＡ（ヘマグルチニン）タグを付加したクローンを作製し、一次抗体にＨＡ−７（アブカム社製）を用いた。二次抗体には抗マウスＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を用い、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで発光反応を行いＴｙｐｈｏｏｎスキャナ（共にＧＥヘルスケア社製）でシグナルを検出した（図５ｂ下段）。
ｚＰＳＧＬは、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロジェン社）、ＡＤＡＭ８はｐＣＩベクター（プロメガ社）を用いて細胞に導入した。サンプルは、ＤＮＡをトランスフェクションした後２４時間でタンパク質の回収を行った。細胞をホモジェナイザーで破砕したのち、界面活性剤（ＮＰ−４０）を含むバッファーで氷上撹拌し、膜画分からｚＰＳＧＬを溶出した。β−メルカプトエタノールで還元処理を行ったあと、１００℃で熱処理を加え、泳動サンプルとして調製した。
調製したサンプルは１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜（アマシャム社製）へと転写し、抗体によるブロッティング反応および発光反応を行った。
スキャナで検出したイメージが図５ｂである。

また、ｍＰＳＧＬのＣ末端にＨＡタグを付加したクローンでも同様の条件により、ウェスタンブロッティングを行った。結果を図６に示す。

ｚＰＳＧＬ、ｍＰＳＧＬどちらにおいても、ｍＡＤＡＭ８あるいはｚＡＤＡＭ８の存在下でのみ、３０ｋＤａ付近に小さなサイズの切断片を確認した（図中のＳ）。このような断片はＥＱ ｍＡＤＡＭ８およびＥＱ ｚＡＤＡＭ８では見られなかった。したがってｍＰＳＧＬはＡＤＡＭ８によって限定分解をうけ、細胞内領域を含む短い断片を生じることが明らかとなった。また、この活性はマウスとゼブラフィッシュのＡＤＡＭ８で保存されていることが分かった。

（４−３）生体におけるｚＡＤＡＭ８を介したｚＰＳＧＬの分解
本実験のウェスタンブロッティングに関しては、内在性のｚＰＳＧＬに反応する抗体を作製し用いた。抗体作製はＭＢＬ社に委託した。二次抗体には抗ラビットＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ社製）を用いた。以後の検出系は実施例４−２と共通である。
コントロール胚、ｚＡＤＡＭ８発現阻害胚、ｚＰＳＧＬ発現阻害（ノックダウン）胚は実施例１と同様の方法により調製した。ｚＰＳＧＬ発現阻害に使用したＰＳＧＬ−１モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、５’−ＴＧＴＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧ’（配列番号：１５）である。各サンプルはそれぞれ５０個の２４時間胚より抽出した。
各処理を施した２４時間胚を５０個集め、氷上のＰＢＳに浸した状態で、ピンセットを用いた手作業により卵殻および卵黄を除去した。ホモジェナイザーで胚を破砕した後、ＮＰ−４０バッファーでｚＰＳＧＬの溶出を行った。以後のサンプル調製は実施例４−２と同様である。
調製したサンプルは１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。１レーンあたり胚５個に相当するタンパク質をアプライした。以後の操作は実施例４−２と同様である。
スキャナにより取得したイメージが図５ｃである。

ｚＰＳＧＬの細胞内領域に特異的な抗体を作製し、生体内におけるｚＡＤＡＭ８を介したｚＰＳＧＬの分解能を検討した。ＰＳＧＬ−１の発現抑制（Ｋ．Ｄ．＝Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）により減少する３種類のシグナルを、内在性ｚＰＳＧＬのシグナルとして同定した。ｚＡＤＡＭ８発現抑制下では切断片と考えられる２種類のシグナルが減少し、残るシグナルの強度が微増した。これは、ｚＡＤＡＭ８による分解が起こらず、完全長のｚＰＳＧＬが蓄積した結果だと考えられる。
なお、ＨＥＫ細胞で発現させた場合とｚＰＳＧＬの分子量が異なるが、付加される糖成分の違いであるものと考えられる。
以上の結果より、ゼブラフィッシュにおける初期発生では、ＡＤＡＭ８が血球の血管内への侵入の後に、血球上のＰＳＧＬ−１を介する細胞接着を切断して、血流内へと導くための機能を有していることが明らかになった。概念図を図５ｄに示す。したがって、生体内においてもＡＤＡＭ８を介したＰＳＧＬ−１の分解が起こっており、その分解阻害が血栓形成という生理現象とリンクしていることが示唆された。

本発明のＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する止血剤は、血管損傷などによる出血の止血に使用できる他、血友病、フォン・ヴィレブランド病、播種性血管内凝固症候群、突発性血小板減少性紫斑病等の凝固・線溶系の異常疾患の治療のための医薬品として利用可能である。

また、本発明のＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤は、血栓塞栓症の治療のための医薬品として利用可能である。また、異常な血液凝固を阻止することにより、血液循環の促進やうっ血予防や、血栓の線溶作用が働かずに起きる種々の疾患の治療のための医薬品として利用可能である。

Claims (11)

1. ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、止血剤。
2. ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物が、ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物である請求項１に記載の止血剤。
3. ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物が、ＡＤＡＭ８をコードする遺伝子の塩基配列またはその一部に対して、相補的な塩基配列を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の止血剤。
4. ＡＤＡＭ８の機能を抑制する化合物が、ＡＤＡＭ８の活性を阻害する化合物である請求項１に記載の止血剤。
5. ＡＤＡＭ８タンパク質またはその断片を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤。
6. ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物を有効成分として含有する、血液凝固阻止剤。
7. ＡＤＡＭ８の機能を亢進する化合物が、ＡＤＡＭ８の発現を促進する化合物である、請求項６に記載の血液凝固阻止剤。
8. 以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、止血剤のスクリーニング方法：
   （ａ）ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；
   （ｂ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を検出する工程；および
   （ｃ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を阻害する化合物を選択する工程。
9. 以下の（ｄ）〜（ｆ）の工程を含む、止血剤のスクリーニング方法：
   （ｄ）ＡＤＡＭ８を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；
   （ｅ）ＡＤＡＭ８の発現量を検出する工程；および
   （ｆ）ＡＤＡＭ８の発現を抑制する化合物を選択する工程。
10. 以下の（ｇ）〜（ｉ）の工程を含む、血液凝固阻止剤のスクリーニング方法：
    （ｇ）ＡＤＡＭ８およびＰＳＧＬ−１を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；
    （ｈ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を検出する工程；および
    （ｉ）ＡＤＡＭ８のＰＳＧＬ−１分解活性を促進する化合物を選択する工程。
11. 以下の（ｊ）〜（ｌ）の工程を含む、血液凝固阻止剤のスクリーニング方法：
    （ｊ）ＡＤＡＭ８を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程；
    （ｋ）ＡＤＡＭ８の発現量を検出する工程；および
    （ｌ）ＡＤＡＭ８の発現を促進する化合物を選択する工程。