WO2020196708A1 - グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法及びグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤 - Google Patents

グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法及びグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤 Download PDF

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glucose dehydrogenase
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美穂 豊岡
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Definitions

  • the present disclosure relates to a method for modifying the substrate specificity of glucose dehydrogenase and a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier.
  • Glucose measurement is used for blood glucose monitoring of diabetic patients.
  • Glucose oxidase hereinafter, also referred to as GOD
  • GDH glucose dehydrogenase
  • Glucose oxidase is an oxidoreductase that catalyzes the reaction of oxidizing ⁇ -D-glucose to D-glucono-1,5-lactone (gluconolactone).
  • Glucose oxidase uses oxygen as an electron acceptor and flavin adenine dinucleotide (FAD) as a cofactor.
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • Glucose dehydrogenase is classified as an oxidoreductase and uses glucose and an electron acceptor as substrates to catalyze the reaction that produces gluconolactone and a reduced acceptor.
  • glucose dehydrogenase include nicotinamide dinucleotide-dependent GDH, nicotinamide dinucleotide phosphate-dependent GDH, pyrroloquinoline quinone (PQQ) -dependent GDH, and FAD-dependent GDH (flavin-bound GDH).
  • Non-Patent Document 1 describes a problem in which a glucose value higher than the actual value is erroneously obtained in glucose measurement using PQQ-GDH due to maltose or the like existing in the system, which causes hypoglycemia. are doing. Therefore, in glucose measurement using an enzyme, a measurement reagent having high specificity to glucose and low reactivity to other sugars such as maltose has been required.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2015-139376 describes a method for increasing the stability of glucose dehydrogenase by adding smectite, which is a mineral.
  • Patent Document 2 International Publication No. 2005/054840 pamphlet describes a method for measuring a blood component capable of sufficiently and accurately correcting the amount of blood component by measuring the hematocrit value with high accuracy and high reliability, a sensor used therein, and a sensor used therein. It is intended to provide an apparatus and describes an apparatus comprising glucose dehydrogenase.
  • sugar alcohols are listed as enzyme stabilizers, and maltitol is preferred. Further, in the examples, maltitol is used.
  • Patent Document 3 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-114359 aims to provide a method for measuring a component and a sensor without requiring a complicated correction step, and describes a method for measuring glucose in blood and a sensor used therein.
  • Paragraph 0016 lists sugar alcohols as enzyme stabilizers, with maltitol being preferred. Maltitol is used in the examples.
  • Patent Document 4 (Pamphlet of International Publication No. 2001/025776) describes a glucose sensor using PQQ-GDH.
  • a stabilizer may be added to the reaction layer of the biosensor, and there is a disclosure of sugar as a stabilizer.
  • sugars are listed, and glucose and maltose are described. There is no description that sugar was used as a stabilizer in the examples.
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2009-195250 describes a method for improving the stability of a composition containing soluble glucose dehydrogenase, and includes a FAD-GDH recombinant derived from Aspergillus oryzae or Aspergillus terreus and trehalose. The composition is described.
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-018096 describes a method for improving the stability of a composition containing a flavin-bound glucose dehydrogenase.
  • JP-A-2015-139376 Patent No. 6402887
  • International Publication No. 2005/054840 Pamphlet JP-A-2005-114359
  • International Publication No. 2001/025776 Pamphlet JP-A-2009-195250
  • Patent No. 5176045 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2014-018096
  • the present disclosure provides a method for modifying the substrate specificity of FAD-dependent glucose dehydrogenase by using a low-molecular-weight compound which is a glucose analog, and a glucose dehydrogenase substrate-specific modifier which is a glucose analog and a low-molecular compound.
  • a low-molecular-weight compound which is a glucose analog
  • a glucose dehydrogenase substrate-specific modifier which is a glucose analog and a low-molecular compound.
  • the present inventors use a method different from the approach of searching for a novel GDH enzyme or the approach of introducing a mutation into an existing GDH to modify its substrate specificity, such as glucose such as maltose.
  • substrate specificity such as glucose such as maltose.
  • FAD-GDH FAD-dependent glucose dehydrogenase
  • Glucose dehydrogenase substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase coexist when glucose measurement is performed, and the reactivity of the glucose dehydrogenase to maltose (Mal) and the reactivity to glucose in the absence of the modifier.
  • the ratio of the glucose dehydrogenase's reactivity to maltose (Mal) to glucose (Glu) in the presence of the modifier (Mal / Glu) is higher than the ratio of (Glu) (Mal / Glu).
  • the method to be modified [2]
  • One or more glucose dehydrogenase substrate-specific modifiers selected from the group consisting of sorbitol, D-iditol, L-iditol, D-glucal, ribitol, L-growth, trehalose, D-mannitol, xylitol, and glycerol.
  • glucose dehydrogenase is a glucose dehydrogenase derived from the genus Mucor or Aspergillus.
  • the method according to any one of embodiments 1 to 3 wherein glucose dehydrogenase is immobilized on a solid phase surface.
  • a glucose dehydrogenase substrate-specific modifier which is a low molecular weight compound that is an analog of glucose and is resistant to maltose of FAD-dependent glucose dehydrogenase (FAD-GDH) in the absence of the modifier.
  • One or more glucose dehydrogenase substrate-specific modifiers selected from the group consisting of sorbitol, D-iditol, L-iditol, D-glucal, ribitol, L-growth, trehalose, D-mannitol, xylitol, and glycerol.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier comprises one or more compounds selected from the group consisting of sorbitol, D-iditol, L-iditol, D-glucal, ribitol, L-growth, D-mannitol, and glycerol. , The modifier according to embodiment 6. [9] The modifier according to any of embodiments 6-8, wherein the glucose dehydrogenase is a glucose dehydrogenase from the genus Mucor or Aspergillus.
  • a system for measuring glucose which comprises the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier according to any one of embodiments 6 to 9 and glucose dehydrogenase immobilized on a solid phase surface.
  • a system for measuring glucose which comprises the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier according to any one of embodiments 6 to 9 and glucose dehydrogenase which is not immobilized on a solid phase surface.
  • a composition for measuring glucose or a reagent for measuring glucose which comprises the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase according to any one of embodiments 6 to 9.
  • composition for glucose measurement or a glucose measurement reagent according to Embodiment 12 which comprises a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase as individual reagents.
  • composition for measuring glucose or a reagent for measuring glucose according to the twelfth embodiment wherein the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier and the glucose dehydrogenase are contained in the same reagent.
  • a method for screening a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier which comprises the following steps.
  • Steps to prepare glucose dehydrogenase ii) A step of determining the ratio (Mal / Glu) of the reactivity of the glucose dehydrogenase to maltose (Mal) to the reactivity to glucose (Glu). iii) The glucose dehydrogenase of i) is brought into contact with a candidate substance which is a low molecular weight compound which is an analog of glucose, and then the reactivity (Mal) of the glucose dehydrogenase to maltose and the reaction to glucose in the presence of the candidate substance.
  • a candidate substance which is a low molecular weight compound which is an analog of glucose
  • the process of determining the sex (Glu) ratio (Mal / Glu), iv) The step of comparing the ratio (Mal / Glu) in ii) and the ratio (Mal / Glu) in the presence of the candidate substance in iii), and v) If the ratio (Mal / Glu) in the presence of the candidate substance in iii) is modified rather than the ratio (Mal / Glu) in ii), the candidate substance is subjected to glucose dehydrogenase substrate specificity.
  • the process of making a modifier The process of making a modifier.
  • a method for producing a glucose measuring reagent or a glucose measuring composition which comprises blending a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier identified by the method according to the 16th embodiment into a glucose measuring reagent or a glucose measuring composition.
  • a glucose measuring reagent comprising a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase identified by the method of embodiment 16.
  • the electrode comprising one or more compounds selected from the group consisting of, ribitol, L-growth, trehalose, D-mannitol, xylitol, and glycerol.
  • the battery comprising one or more compounds selected from the group consisting of, ribitol, L-growth, trehalose, D-mannitol, xylitol, and glycerol.
  • the substrate specificity of glucose dehydrogenase can be modified.
  • the present disclosure provides a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier.
  • the substrate specificity modifiers of the present disclosure can be analogs of glucose.
  • an analog of glucose refers to a sugar compound or sugar alcohol compound that has a similar chemical structure to glucose but is not recognized as a substrate by glucose dehydrogenase.
  • Glucose analogs can be low molecular weight compounds.
  • the low molecular weight compound referred to here means a compound having a molecular weight (g / mol) of about 90 to about 380, for example, a compound having a molecular weight (g / mol) of about 150 to about 380.
  • not recognized as a substrate by glucose dehydrogenase means that it is not recognized as a substrate by glucose dehydrogenase at all, or is not substantially recognized as a substrate by glucose dehydrogenase. Specifically, it is not recognized as a substrate. Specifically, assuming that the activity (reactivity) when glucose is used as a substrate is 100%, the activity against glucose analog is 1% or less, 0.5% or less, 0.1% or less, It means that it is 0.05% or less, 0.01% or less, 0.005% or less, 0.001% or less, for example, 0.0005% or less.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifiers of the present disclosure include L-growth, D-iditol, L-iditol, sorbitol, ribitol (CAS no. 488-81-3, also referred to as adonitol), trehalose, and Includes D-glucar and one or more compounds selected from the group consisting of D-mannitol, xylitol, and glycerol.
  • the substrate specificity modifiers of the present disclosure are L-growth, D-iditol, L-iditol, sorbitol, ribitol, trehalose, D-glucar, D-mannitol, xylitol, glycerol or one or more thereof. It is a combination.
  • the substrate specificity modifier of the present disclosure contains L-growth (CAS No. 6027-89-0), it may be provided as a mixture of L-form and D-form, for example racemic, or L-form. May be provided as.
  • the L-form for a certain optically active compound means that the L-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • the L-growth can be of an optical purity of 90-100% ee, eg 95-100% ee, eg 97-100% ee.
  • the substrate specificity modifier of the present disclosure contains D-iditol (CAS no. 25878-23-3), it is preferably provided as D form.
  • the D-form for a certain optically active compound means that the D-form is present at, for example, an optical purity of 90 to 100% ee, for example, 95 to 100% ee, for example, 97 to 100% ee.
  • D-iditol can have an optical purity of 90-100% ee, such as 95-100% ee, such as 97-100% ee.
  • L-iditol CAS no. 488-45-9
  • L-iditol can have an optical purity of 90-100% ee, such as 95-100% ee, such as 97-100% ee.
  • the substrate specificity modifier of the present disclosure contains D-glucal (CAS no. 13265-84-4), it is preferably provided as D form.
  • the D-glucural can have an optical purity of 90-100% ee, such as 95-100% ee, such as 97-100% ee.
  • D-mannitol CAS no. 69-65-8
  • D-mannitol can have an optical purity of 90-100% ee, eg 95-100% ee, eg 97-100% ee.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifiers of the present disclosure do not contain smectite.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier of the present disclosure has a final concentration of 0.1 mM to 1000 mM, for example, 0.1 mM to 500 mM, 0.1 mM to 300 mM, 0.1 mM to 100 mM, 0.1 mM to 80 mM in the measurement solution at the time of glucose measurement.
  • an aqueous solution containing the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase of the present disclosure can be applied to the electrode and dried.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier is concentrated during drying, and the concentration is higher than the final concentration before drying.
  • Such a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier at a high concentration after drying and an electrode coated with the modifier are also included in the present disclosure.
  • the present disclosure provides a composition for measuring glucose or a reagent for measuring glucose, which comprises a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase.
  • the glucose measurement reagent can be in solution or dry form.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier in the glucose measuring reagent and the glucose dehydrogenase can be included as separate reagents.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier in the glucose measuring reagent and the glucose dehydrogenase can be contained in the same reagent.
  • the glucose measuring reagent does not contain glucose dehydrogenase, in which case glucose dehydrogenase can be added to the measurement solution at the time of glucose measurement.
  • the glucose measurement reagent does not contain a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier, in which case the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier can be added to the measurement solution at the time of glucose measurement.
  • the present disclosure provides a method for measuring glucose using the substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase.
  • the glucose measuring method can be a method of measuring the glucose concentration.
  • the glucose measuring method can be a method for quantifying the glucose concentration.
  • the sample to be measured can contain glucose.
  • the sample to be measured can include maltose.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier may be included in the glucose measurement reagent in advance, or may be added to the measurement solution at the time of glucose measurement.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier is 0.1 mM to 1000 mM, for example, 0.1 mM to 500 mM, 0.1 mM to 300 mM, 0.1 mM to 100 mM, 0.1 mM to 80 mM, 0.1 mM to 70 mM, at the time of measurement. It may be included in the measurement solution at a final concentration of 0.1 mM-60 mM, 0.1 mM-50 mM, 0.2 mM-20 mM, 0.25 mM-10 mM, eg 5 mM.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier may be contained in the glucose measurement solution.
  • glucose dehydrogenase and a sample may be added to the glucose measurement solution to start the measurement.
  • glucose dehydrogenase may be immobilized on an electrode, and the glucose measurement solution and sample may be brought into contact with the electrode to perform glucose measurement.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier of the present disclosure may be included in the glucose measurement reagent in advance.
  • This measurement reagent may or may not contain glucose dehydrogenase. If the measurement reagent contains glucose dehydrogenase, a sample can be added thereto to start glucose measurement. If the measurement reagent does not contain glucose dehydrogenase, a sample and glucose dehydrogenase can be added thereto (in any order) to start glucose measurement.
  • glucose dehydrogenase may be immobilized on an electrode, and the measurement reagent and sample may be brought into contact with the electrode to perform glucose measurement.
  • glucose dehydrogenase refers to FAD-dependent glucose dehydrogenase (FAD-GDH).
  • FAD-GDH FAD-dependent glucose dehydrogenase
  • Known FAD-GDH can be used as the glucose dehydrogenase.
  • Preferable examples of known FAD-GDH-derived microorganisms include Mucoromycotina, preferably Mucorales, more preferably Mucorales, and even more preferably Mucorales.
  • Specific examples include FAD-GDH derived from the genus Mucor, the genus Absidia, the genus Actinomucor, and the genus Circinella.
  • Examples of specific preferable microorganisms classified into the genus Mucor include Mucor prainii, Mucor javanicus, Mucor circinelloides f. Circinelloides, Mucor guilliermondii, Mucor hiemalis f. Silvaticus, Mucor subtilissimus, Mucor dimorphosporus, etc. Be done. More specifically, Mucor prainii, Mucor javanicus, Mucor circinelloides f. Circinelloides, Mucor guilliermondii NBRC9403, Mucor hiemalis, Mucor hiemalis f.
  • Circinella minor examples include Circinella mucoroides, Circinella muscae, Circinella rigida, Circinella simplex, and Circinella umbellata.
  • the NBRC strain and the RD strain are NBRC (Incorporated Administrative Agency Product Evaluation Technology Infrastructure Organization Biotechnology Center) storage strains. These FAD-GDH also include its variants.
  • FAD-GDHs include FAD-GDH from the genus Aspergillus, such as GDH from Aspergillus oryzae, GDH from Aspergillus awamori, GDH from Aspergillus aureus, GDH from Aspergillus niger, GDH from Aspergillus foetidas, Aspergillus.
  • GDH derived from Iizukae GDH derived from Aspergillus barge color, GDH derived from Aspergillus hoenix, GDH derived from Aspergillus bisporus, GDH derived from Aspergillus brunneo-uniseriatus, GDH derived from Aspergillus carneus, GDH derived from Aspergillus malignus and GDH derived from Aspergillus teleus.
  • FAD-GDH also include its variants.
  • FAD-GDHs include FAD-GDH derived from the genus Glomera, GDH derived from Glomerella fructigena, for example GDH derived from Glomerella fructigena NBRC5951, GDH derived from Glomerella cingulata, GDH derived from Glomerella cingulata NBRC107000 strain, and FAD derived from Colletotrichum.
  • GDH for example, GDH derived from Colletotrichum gleosporioides, GDH derived from Colletotrichum chlorophyti, GDH derived from Colletotrichum orbiculare, FAD-GDH derived from the genus Botriospheria, for example, GDH derived from Botryosphaeria parva.
  • FAD-GDH derived from the genus Burkholderia for example, GDH derived from the membrane protein Burkhorderia cepacia, GDH derived from the Burkhorderia cepacia KS1 strain, and the like.
  • FAD-GDH also include its variants.
  • the gene encoding FAD-GDH can be obtained by genetic engineering techniques.
  • a commonly used gene cloning method may be used.
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted from known microbial cells or various cells capable of producing FAD-GDH by a conventional method, for example, by the method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989). it can.
  • cDNA can be synthesized using mRNA as a template.
  • a library of chromosomal DNA or cDNA can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • a method of synthesizing an appropriate probe DNA based on the known amino acid sequence information of FAD-GDH and using this to select a FAD-GDH gene having high substrate specificity from a library of chromosomal DNA or cDNA or The purpose of encoding FAD-GDH with high substrate specificity by preparing an appropriate primer DNA based on the above amino acid sequence and performing an appropriate polymerase chain reaction (PCR method) such as the 5'RACE method or the 3'RACE method.
  • PCR method polymerase chain reaction
  • the DNA containing the gene fragment of the above can be amplified and these DNA fragments can be ligated to obtain a DNA containing the full length of the target FAD-GDH gene.
  • Mutation treatment of the FAD-GDH gene which is the starting material, can be performed by any known method according to the intended mutation form. That is, a method of contacting / acting the FAD-GDH gene or the recombinant DNA in which the gene is integrated with a drug that is a mutagen; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method that makes full use of a protein engineering method, etc. Can be widely used.
  • Examples of the mutagen drug used in the above mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrite, sulfite, hydrazine, formic acid, 5-bromouracil and the like. be able to.
  • the conditions of contact and action can be taken according to the type of drug used, and are not particularly limited as long as a desired mutation can actually be induced in the FAD-GDH gene.
  • the desired mutation can be induced by contacting and acting at the above drug concentration of preferably 0.5 to 12 M at a reaction temperature of 20 to 80 ° C. for 10 minutes or longer, preferably 10 to 180 minutes. Even when UV irradiation is performed, it can be performed according to the conventional method as described above (Modern Chemistry, p24-30, June 1989 issue).
  • a method known as Site-Specific Mutagenesis can be generally used.
  • Kramer method Nucleic Acids Res., 12,9441 (1984): Methods Enzymol., 154,350 (1987): Gene, 37,73 (1985)
  • Eckstein method Nucleic Acids Res., 13,8749 (1985)).
  • Kunkel method Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 82,488 (1985): Methods Enzymol., 154,367 (1987) )
  • Etc. can be mentioned.
  • a desired FAD-GDH gene can be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
  • the multicapillary DNA analysis system CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter
  • CEQ2000 manufactured by Beckman Coulter
  • the FAD-GDH gene obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and the host cell corresponding to each vector is incorporated. Can be transformed or transduced by a conventional method.
  • prokaryotic host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli K-12 strain, Escherichia collie BL21 (DE3), Escherichia collie JM109, Escherichia collie DH5 ⁇ , Escherichia collie W3110, Escherichia collie C600, etc. Both are manufactured by Takara Bio Co., Ltd.). They are transformed or transduced into them to obtain a host cell (transformant) into which DNA has been introduced.
  • a method for transferring the recombinant DNA into such a host cell for example, when the host cell is a microorganism belonging to Escherichia collie, a method of transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be adopted, and further.
  • the electroporation method may be used.
  • commercially available competent cells for example, ECOS Competent Escherichia Collie BL21 (DE3); manufactured by Nippon Gene
  • yeast An example of a eukaryotic host cell is yeast.
  • yeast classified into yeast include yeasts belonging to the genus Zygosaccharomyces, the genus Saccharomyces, the genus Pichia, the genus Candida, and the like.
  • the insert gene may contain a marker gene that allows selection of transformed cells. Examples of the marker gene include genes that complement the nutritional requirements of the host, such as URA3 and TRP1.
  • the inserted gene preferably contains a promoter or other control sequence capable of expressing the target gene in the host cell (for example, enhancer sequence, terminator sequence, polyadenylation sequence, etc.). Specific examples of the promoter include a GAL1 promoter, an ADH1 promoter and the like.
  • transformation into yeast includes, for example, a method using lithium acetate (Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269 (1995)) and electroporation (J Microbiol Methods 55 (2003) 481). -484) and the like can be preferably used, but the transformation is not limited to this, and transformation may be carried out by using various arbitrary methods including the spheroplast method and the glass bead method.
  • eukaryotic host cells include mold cells such as the genus Aspergillus and the genus Trichoderma.
  • the method for producing a transformant of mold cells is not particularly limited, and examples thereof include a method of inserting into a host filamentous fungus in a manner in which a gene encoding FAD-GDH is expressed according to a conventional method. Specifically, a DNA construct in which a gene encoding FAD-GDH is inserted between an expression-inducing promoter and a terminator is prepared, and then the host filamentous fungus is transformed with a DNA construct containing a gene encoding FAD-GDH. Therefore, a transformant overexpressing the gene encoding FAD-GDH is obtained.
  • a DNA fragment consisting of an expression-inducing promoter-a gene encoding FAD-GDH-a terminator prepared for transforming a host filamentous fungus and a recombinant vector containing the DNA fragment are collectively referred to as a DNA construct. Call me.
  • the method of inserting into the host filamentous fungus in a manner in which the gene encoding FAD-GDH is expressed is not particularly limited, but for example, a method of inserting directly onto the chromosome of the host organism by using homologous recombination; plasmid vector. Examples thereof include a method of introducing into a host filamentous fungus by connecting them above.
  • a DNA construct can be ligated between the sequences homologous to the upstream and downstream regions of the recombination site on the chromosome and inserted into the genome of the host filamentous fungus.
  • a transformant by self-cloning can be obtained by overexpression in a host filamentous fungus under the control of its own high expression promoter.
  • the highly expressed promoter is not particularly limited, and examples thereof include a promoter region of the TEF1 gene (tef1), which is a translation elongation factor, a promoter region of the ⁇ -amylase gene (amy), and an alkaline protease gene (alp) promoter region.
  • the DNA construct can be incorporated into a plasmid vector used for transformation of filamentous fungi by a conventional method, and the corresponding host filamentous fungus can be transformed by a conventional method.
  • Such a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it can produce FAD-GDH in the host filamentous fungus, for example, pUC19 and the filamentous fungus system, pSTA14 (Mol. Gen. Genet). .218, 99-104, 1989) and filamentous fungal systems.
  • the DNA construct is preferably used by introducing it into the chromosome of the host filamentous fungus, but as another method, the DNA construct is applied to an autonomous replication type vector (Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)). It can also be used in a form that is not introduced into the chromosome by incorporating.
  • the DNA construct may contain a marker gene that allows selection of transformed cells.
  • the marker gene is not particularly limited, and examples thereof include genes that complement the nutritional requirements of the host, such as pyrG, niaD, and adeA; and drug resistance genes to drugs such as pyrithiamine and hygromycin B oligomycin.
  • the DNA construct also preferably contains promoters, terminators and other regulatory sequences (eg, enhancers, polyadenylation sequences, etc.) that allow the gene encoding FAD-GDH to be overexpressed in the host cell.
  • the promoter is not particularly limited, and examples thereof include an appropriate expression-inducing promoter and a constitutive promoter, and examples thereof include a tef1 promoter, an alp promoter, and an amy promoter.
  • the terminator is also not particularly limited, and examples thereof include an alp terminator, an amy terminator, and a tef1 terminator.
  • the expression control sequence of the gene encoding FAD-GDH is not always necessary when the DNA fragment containing the gene encoding FAD-GDH to be inserted contains a sequence having an expression control function.
  • the DNA construct may not have a marker gene.
  • DNA construct is, for example, a DNA construct in which the tef1 gene promoter, the gene encoding FAD-GDH, the alp gene terminator, and the pyrG marker gene are linked to the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19. is there.
  • a method for transforming into filamentous fungi a method known to those skilled in the art can be appropriately selected.
  • a protoplast PEG method using polyethylene glycol and calcium chloride (for example, Mol) after preparing a protoplast of a host filamentous fungus. . Gen. Genet. 218, 99-104, 1989, JP-A-2007-222055, etc.) can be used.
  • the medium for regenerating the transformed filamentous fungus an appropriate medium is used according to the host filamentous fungus to be used and the transformation marker gene.
  • the regeneration of the transformed filamentous fungus was carried out, for example, in Czapek-Dox minimal medium containing 0.5% agar and 1.2M sorbitol. It can be done at Diffco).
  • homologous recombination is used to replace the promoter of the gene encoding FAD-GDH originally contained on the chromosome of the host filamentous fungus with a highly expressed promoter such as tef1. May be good. Also at this time, it is preferable to insert a transformation marker gene such as pyrG in addition to the highly expressed promoter.
  • a transformation marker gene such as pyrG in addition to the highly expressed promoter.
  • the upstream region of the gene encoding FAD-GDH-transformation marker gene-high expression promoter-FAD-GDH A transformation cassette or the like consisting of all or a part of the gene encoding the above can be used.
  • the upstream region of the gene encoding FAD-GDH and all or part of the gene encoding FAD-GDH are utilized for homologous recombination. All or part of the gene encoding FAD-GDH can be used including a region in the middle from the start codon.
  • the length of the region suitable for homologous recombination is preferably 0.5 kb or more.
  • the transformed filamentous fungus was cultured under the condition that the enzymatic activity of FAD-GDH was observed, and then the activity of FAD-GDH in the culture obtained after the culture was confirmed. It can be done by.
  • confirmation that the transformed filamentous fungus was produced is that chromosomal DNA is extracted from the transformed filamentous fungus and PCR is performed using this as a template to produce a PCR product that can be amplified when transformation occurs. It may be done by confirming.
  • the FAD-GDH enzyme production method cultivates a host cell that produces FAD-GDH obtained as described above, expresses the FAD-GDH gene contained in the host cell, and then simply releases FAD-GDH from the culture. It may be manufactured by separating them.
  • the medium for culturing the host cells includes, for example, one or more nitrogen sources such as yeast extract, trypton, peptone, meat extract, corn steep liquor, or exudate of soybean or wheat bran, sodium chloride, and potassium phosphate monobasic ,
  • nitrogen sources such as yeast extract, trypton, peptone, meat extract, corn steep liquor, or exudate of soybean or wheat bran, sodium chloride, and potassium phosphate monobasic
  • One or more inorganic salts such as dipotassium phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate were added, and if necessary, sugar raw materials, vitamins and the like were added as appropriate. Things are used.
  • the initial pH of the medium is not limited, but can be adjusted to, for example, pH 6-9.
  • the culture is carried out at a culture temperature of 10 to 42 ° C., preferably a culture temperature of about 25 ° C. for 4 hours to 1 week, more preferably a culture temperature of about 25 ° C. for 4 hours to 5 days, aeration-stirred deep culture, shaking culture, It may be carried out by static culture or the like.
  • the FAD-GDH enzyme is collected from the culture.
  • a usual known enzyme collecting means may be used.
  • the cells are subjected to ultrasonic destruction treatment, grinding treatment, etc. by a conventional method, or this enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme or yatarase, or shaken or left in the presence of toluene or the like.
  • the enzyme can be lysed and excreted from the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate, etc., and then ammonium sulfate, alcohol, acetone, etc. are added thereto. Fractionate, and the precipitate is collected to obtain the crude enzyme of FAD-GDH.
  • the crude enzyme of FAD-GDH can be further purified by any known means.
  • a purified enzyme preparation for example, a gel filtration method using Sephadex, Ultrogel or biogel; an adsorption / elution method using an ion exchanger; an electrophoresis method using a polyacrylamide gel or the like; an adsorption using hydroxyapatite.
  • Elution method Sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation method; Affinity chromatography method; Fractionation method using molecular sieving membrane or hollow yarn membrane, etc., or a combination thereof was carried out for purification.
  • FAD-GDH enzyme preparations can be obtained.
  • glucose dehydrogenase may be immobilized on a solid phase.
  • the present disclosure provides a glucose measurement kit or glucose measurement system (device) comprising the substrate specificity modifier described above and a solid phase in which glucose dehydrogenase is immobilized.
  • the solid phase include, but are not limited to, beads, particles, a polymer, and an electrode surface.
  • glucose dehydrogenase may be immobilized on an electrode.
  • the present disclosure provides a glucose measurement system (instrument) comprising the substrate specificity modifier described above and an electrode on which glucose dehydrogenase is immobilized.
  • Glucose dehydrogenase can be immobilized on the solid phase by any known method. Glucose dehydrogenase may be immobilized on beads, membranes, carbon particles, gold particles, platinum particles, polymers, or electrode surfaces. Immobilization methods include a method using a cross-linking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, and the like, and glucose dehydrogenase is added to the polymer. It may be fixed or adsorbed and fixed on an electrode, or these may be used in combination.
  • glucose dehydrogenase is immobilized on a carbon electrode with glutaraldehyde and then treated with a reagent having an amine group to block glutaraldehyde.
  • the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier of the present disclosure may be present when immobilizing glucose dehydrogenase on a solid phase surface.
  • mediators such as 1-methoxy-5-methylphenylenedinium methylsulfate (mPMS), 5-methylphenazinenium methylsulfate (PMS), 5-ethylphenazinenium methylsulfate (PES) and other phenazine compounds, phenothiazine compounds, potassium ferricyanide and other ferricides, ferrocene, dimethylferrocene , Ferrocene compounds such as ferrocenecarboxylic acid, quinone compounds such as naphthoquinone, anthraquinone, hydroquinone, pyroquinolinquinone, cytochrome compounds, biologene compounds such as benzylviologen and methylviologen, indophenol compounds such as dichlorophenol indophenol.
  • mPMS 1-methoxy-5-methylphenylenedinium methylsulfate
  • PMS 5-methylphenazinenium methylsulfate
  • PES 5-ethylphen
  • Luthenium compounds such as hexaammine ruthenium chloride, osmium complexes such as osmium-2,2'-bipyridine, p-phenylenediamine, N-isopropyl-N'-phenyl-p-phenylenediamine (IPPD), N', N- Diphenyl-p-phenylenediamine (DPPD), N- (1,3-dimethylbutyl) -N'-phenyl-p-phenylenediamine, N, N, N', N'-tetramethyl-1,4-phenylenediamine Phenylenediamine compounds such as, etc. can be used.
  • IPPD isopropyl-N'-phenyl-p-phenylenediamine
  • DPPD Diphenyl-p-phenylenediamine
  • Phenylenediamine compounds such as, etc. can be used.
  • these mediators can also be used after being modified with a polymer such as polyvinyl imidazole, polyethyleneimine, or polyacrylic acid.
  • these mediators can also be immobilized on GDH using a cross-linking reagent or the like.
  • these mediators can also be immobilized on the electrode by hydrophobic interaction with reference to Japanese Patent No. 648441 and Japanese Patent No. 6484742. All of these contents are incorporated herein by reference. Further, these mediators can also be immobilized on the electrode after activating the electrode surface by acid treatment or the like. Materials such as carbon, gold, and platinum can be used for the electrodes.
  • the final concentration of the mediator added to the sample solution is not particularly limited, and is, for example, 1pM to 1M, 1pM to 100mM, 1pM to 20mM, 1pM to 10mM, 1pM to 5mM, 2pM to 1mM, 3pM to 800 ⁇ M, 4pM to 600 ⁇ M, 5pM. It can be in the range of ⁇ 500 ⁇ M, 6pM ⁇ 400 ⁇ M, 7pM ⁇ 300 ⁇ M, 8pM ⁇ 200 ⁇ M, 9pM ⁇ 100 ⁇ M, 10pM ⁇ 50 ⁇ M.
  • the order of addition of the mediator and other reagents is not limited, and the mediator and other reagents may be added simultaneously or sequentially.
  • the time for performing the redox reaction or the time for performing the electrochemical measurement can be 60 minutes or less, 30 minutes or less, 10 minutes or less, 5 minutes or less, or 1 minute or less.
  • the time for redox reaction is 60 minutes or more, 120 minutes or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 1 week or more, 2 weeks or more, It can be 3 weeks or more.
  • the glucose dehydrogenase contained in the composition or the glucose dehydrogenase immobilized on the electrode is a purified glucose dehydrogenase enzyme.
  • GDH glucose dehydrogenase activity
  • PMS phenazine metosulfate
  • DCIP 2,6-dichloroindophenol
  • GDH activity can be measured according to the following procedure. Mix 2.05 mL of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.6 mL of 1M D-glucose solution and 0.15 mL of 2 mM DCIP solution, and incubate at 37 ° C for 5 minutes. Then, 0.1 mL of 15 mM PMS solution and 0.1 mL of enzyme sample solution are added, and the reaction is started. The absorbance at the start of the reaction and over time is measured, the amount of decrease in absorbance at 600 nm per minute ( ⁇ A600) with the progress of the enzymatic reaction is determined, and the GDH activity is calculated according to the following formula. At this time, GDH activity defines 1 U as the amount of enzyme that reduces 1 ⁇ mol of DCIP per minute in the presence of D-glucose at a concentration of 200 mM at 37 ° C.
  • 3.0 is the solution volume of reaction reagent + enzyme reagent (mL)
  • 16.3 is the mmol molecular extinction coefficient (cm 2 / ⁇ mol) under the present activity measurement conditions
  • 0.1 is the solution volume of the enzyme solution (mL)
  • 1.0 is.
  • ⁇ A 600 blank is the amount of decrease in absorbance at 600 nm per minute when the reaction is started by adding 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) instead of the enzyme sample solution
  • df is dilution. Represents a multiple.
  • the glucose measurement kit of the present disclosure contains a sufficient amount of substrate specificity modifier for at least one assay.
  • the glucose measurement kits of the present disclosure include glucose dehydrogenase, buffers required for the assay, glucose substrate standard solution for making calibration curves, and guidelines, in addition to the substrate specificity modifier.
  • the substrate standard solution can be a glucose standard solution.
  • a maltose substrate standard solution having a known concentration can also be used.
  • the glucose measurement kit of the present disclosure comprises a substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase as the same reagent.
  • the kit for measuring glucose of the present disclosure contains a substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase as separate reagents.
  • glucose dehydrogenase may be immobilized on an electrode, and the glucose measurement kits of the present disclosure used for such electrodes include a substrate specificity modifier as a single reagent.
  • the term "single reagent” as used herein does not mean that the reagent does not contain a substance other than a substrate specificity modifier.
  • the substrate specificity modifier may be in a solution state or a dry state, for example, a powder.
  • the glucose concentration can be measured, for example, as follows.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • ADA N- (2-acetamido) imide diacetic acid
  • Bis-Tris bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
  • a liquid or solid composition containing one or more substances selected from the group consisting of imidazole and imidazole is retained.
  • a pH buffer and a color-developing reagent color-changing reagent
  • a sample containing glucose is added thereto, and the mixture is reacted for a certain period of time. During this period, the absorbance corresponding to the maximum absorption wavelength of the dye produced by polymerization or reduced dye by directly receiving electrons from GDH is monitored.
  • Calibration prepared in advance using a glucose solution of standard concentration from the rate of change in absorbance per hour for the rate method and the change in absorbance up to the point when all glucose in the sample was oxidized for the endpoint method. The glucose concentration in the sample can be calculated based on the ion curve.
  • coloring reagent for example, 2,6-dichloroindophenol (DCIP) can be added as an electron acceptor and glucose can be quantified by monitoring the decrease in absorbance at 600 nm. ..
  • DCIP 2,6-dichloroindophenol
  • NTB nitrotetrazolium blue
  • the amount of diformazan produced can be determined by measuring the absorbance at 570 nm, and the glucose concentration can be calculated.
  • the color-developing reagent (color-changing reagent) used is not limited to these.
  • glucose can be detected or measured by an enzyme sensor.
  • the enzyme sensor may include an electrode on which glucose dehydrogenase is immobilized. Further, the above-mentioned mediator may be adsorbed on the electrode. Examples of the electrode of the enzyme sensor include a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, and the like, and glucose dehydrogenase can be applied or immobilized on the electrode.
  • the enzyme sensor can be a glucose sensor. That is, in certain embodiments, the present disclosure provides a method for detecting or measuring glucose using the above-mentioned substrate specificity modifier and glucose sensor.
  • the glucose sensor can be used for continuous blood glucose measurement and continuous glucose monitoring.
  • the composition or reagent containing the substrate specificity modifier of the present disclosure can be used for various electrochemical measurements using a potentiostat, galvanostat, etc., together with an electrode on which glucose dehydrogenase is immobilized, an enzyme sensor, or the like. it can.
  • Electrochemical measurement methods include various methods such as amperometry, such as chronoamperometry, potential step chronoamperometry, voltammetry, such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, potentialometry, and coulometry.
  • amperometry such as chronoamperometry, potential step chronoamperometry
  • voltammetry such as cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, potentialometry, and coulometry.
  • the glucose concentration in a sample can be calculated by measuring the current when glucose is reduced by the amperometry method.
  • the applied voltage can be, for example, -1000 mV to +1000 mV (vs. Ag / AgCl), although it depends
  • Electrodes can be formed on an insulating substrate. Specifically, electrodes can be formed on a substrate by a photolithography technique or a printing technique such as screen printing, gravure printing, or flexographic printing. Examples of the material of the insulating substrate include silicon, glass, ceramic, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, polyester and the like, and those having strong resistance to various solvents and chemicals can be used. Further, carbon cloth, carbon paper, or buckypaper can be used as the base of the electrode. The area of the working electrode can be set according to the desired response current.
  • the area of the working electrode is 1 mm 2 or more, 1.5 mm 2 or more, 2 mm 2 or more, 2.5 mm 2 or more, 3 mm 2 or more, 4 mm 2 or more, 5 mm 2 or more, 6 mm 2 or more, 7 mm 2 or more, 8 mm. 2 or more, 9 mm 2 or more, 10 mm 2 or more, 12 mm 2 or more, 15 mm 2 or more, 20 mm 2 or more, 30 mm 2 or more, 40 mm 2 or more, 50 mm 2 or more, 1 cm 2 or more, 2 cm 2 or more, 3 cm 2 or more, 4 cm 2 or more , 5 cm 2 or more, for example 10 cm 2 or more.
  • the area of the working electrode can be 10 cm 2 or less, 5 cm 2 or less, for example 1 cm 2 or less.
  • the opposite pole can be similar.
  • carbon nanotubes, graphene, Ketjen black, etc. can be immobilized on the working surface to increase the apparent surface area.
  • the apparent area can be increased 10 times or more, 50 times or more, 100 times or more, 1000 times or more.
  • the present disclosure provides a method of screening for a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier.
  • This method i) Steps to prepare glucose dehydrogenase, ii) A step of determining the ratio (Mal / Glu) of the reactivity of the glucose dehydrogenase to maltose (Mal) to the reactivity to glucose (Glu).
  • iii) The glucose dehydrogenase of i) is brought into contact with the candidate substance, and then the ratio of the reactivity (Mal) to glucose (Glu) of the glucose dehydrogenase to maltose in the presence of the candidate substance (Mal / Glu).
  • the present disclosure provides a method of confirming the effective concentration of a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier.
  • This method i) Step of preparing glucose dehydrogenase and first concentration, second concentration, ... nth concentration of glucose dehydrogenase substrate specificity modifier (n is a natural number), ii) Glucose dehydrogenase reactivity to maltose (Mal) and glucose reactivity (Glu) in the presence of glucose dehydrogenase substrate specificity modifiers at the first, second, ..., and nth concentrations.
  • the process of determining the ratio (Mal / Glu), iii) A step of comparing the ratio (Mal / Glu) at each concentration and confirming the effective concentration of the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier. including. For example, in one embodiment, if the ratio Mal / Glu at a particular concentration n is substantially the same as the ratio Mal / Glu without the addition of the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier, then the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier The lower limit of the effective concentration can be set to the specific concentration n or higher.
  • the glucose dehydrogenase substrate if the ratio Mal / Glu at a particular concentration n is substantially the same as the ratio Mal / Glu when a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier is added at concentration n-1, then the glucose dehydrogenase substrate.
  • the upper limit of the effective concentration of the specificity modifier may be set to the specific concentration n or set lower than that. However, the concentration n is higher than the concentration n-1.
  • the present disclosure comprises blending a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier identified by the screening method with a glucose measuring reagent or a glucose measuring composition to prepare a glucose measuring reagent or a glucose measuring composition.
  • a glucose metering reagent comprising a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier and glucose dehydrogenase identified by the screening method.
  • the ratio (Mal / Glu) of glucose dehydrogenase reactivity to maltose (Mal) to glucose reactivity (Glu) can be determined by the following procedure. N-Isopropyl-N'-phenyl-p-phenylenediamine (IPPD) is adsorbed and fixed to the carbon printed electrode, and glucose dehydrogenase, for example, glucose dehydrogenase derived from Mucor or glucose dehydrogenase derived from Aspergillus is cross-linked and fixed with glutaraldehyde. .. Chronoamperometry is performed by applying a potential of +250 mV (Ag / AgCl) using a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • maltose is added in phosphate buffered saline (PBS) so as to have a final concentration of 1 mM (for example, added 100 seconds after the start of measurement).
  • PBS phosphate buffered saline
  • glucose is added in phosphate buffered saline (PBS) to a final concentration of 1 mM (for example, 100 seconds after the addition of maltose).
  • the substrate specificity of glucose dehydrogenase can be evaluated by measuring the reactivity to maltose when the reactivity to glucose is 100%.
  • the ratio of reactivity to maltose (Mal) and reactivity to glucose (Glu) may be referred to as Mal / Glu.
  • the response current ratio can be referred to as the response current ratio.
  • glucose dehydrogenase substrate specificity modifier if the Mal / Glu of a glucose dehydrogenase is 0.50%, then the glucose dehydrogenase of the glucose dehydrogenase under the same measurement conditions, but in the presence of the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier.
  • Mal / Glu is less than 0.50%, the reactivity to maltose is reduced, and it can be said that the substrate specificity of the glucose dehydrogenase is modified.
  • glucose dehydrogenase substrate specificity modifiers can reduce the effect of maltose on glucose measurements.
  • the relative value of Mal / Glu of a certain glucose dehydrogenase in the absence of a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier may be defined as 100%. In this case, under the same measurement conditions, but in the presence of a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier, if the Mal / Glu of the glucose dehydrogenase is less than 100%, the reactivity to maltose is reduced and the glucose dehydrogenase It can be said that the substrate specificity has been modified.
  • the Mal / Glu of a glucose dehydrogenase when the Mal / Glu of a glucose dehydrogenase is 100% in the absence of a glucose dehydrogenase substrate-specific modifier, the glucose dehydrogenase of the glucose dehydrogenase in the presence of the glucose dehydrogenase substrate-specific modifier of the present disclosure.
  • Mal / Glu ratio is 99% or less, 98% or less, 97% or less, 96% or less, 95% or less, 94% or less, 93% or less, 92% or less, 91% or less, 90% or less, 89% or less, 88% or less, 87% or less, 86% or less, 85% or less, 84% or less, 83% or less, 82% or less, 81% or less, 80% or less, 79% or less, 78% or less, 77% or less, 76% Below, 75% or less, 74% or less, 73% or less, 72% or less, 71% or less, 70% or less, 69% or less, 68% or less, 67% or less, 66% or less, 65% or less, 64% or less, 63% or less, 62% or less, 61% or less, 60% or less, 59% or less, 58% or less, 57% or less, 56% or less, 55% or less, 54% or less, 53% or less, 52% or less, 51% Below, 50% or less, 49% or
  • the Mal / Glu of a glucose dehydrogenase when the Mal / Glu of a glucose dehydrogenase is 100% in the absence of a glucose dehydrogenase substrate-specific modifier, the glucose dehydrogenase of the glucose dehydrogenase in the presence of the glucose dehydrogenase substrate-specific modifier of the present disclosure.
  • Mal / Glu ratio is 110% or more, 120% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 160% or more, 170% or more, 180% or more, 190% or more, 200% or more, 220% or more, 240% or more, 260% or more, 280% or more, 300% or more, for example 110% to 300%, 120% to 280%, 130% to 260%, 140% to 240%, 150% to 220%, 160% to It can be 200%, for example 170% -190%.
  • the numerical range in the present disclosure shall include an upper limit value and a lower limit value (for example, the numerical range a to b means a or more and b or less). In addition, the present disclosure shall include any combination of upper and lower limits exemplified for a numerical range.
  • glucose dehydrogenase substrate specificity modifier of the present disclosure can modify the substrate specificity of GDH by the following mechanism of action. That is, glucose dehydrogenase is known to recognize and act on glucose by its substrate pocket, but a compound having a chemical structure similar to glucose (glucose analog) first enters the substrate pocket and enters the substrate pocket. It is thought to prevent the entry of contaminant sugars other than glucose, such as maltose.
  • glucose is a C6 compound and glycerol is a C3 compound
  • glycerol has the same structure as a part of glucose, and glycerol also modifies the substrate specificity of glucose dehydrogenase. Since the action was observed, it is considered that glycerol is in the substrate pocket or interacts with the substrate pocket.
  • the substrate specificity of glucose dehydrogenase can be modified.
  • the present disclosure can also be combined with other methods of modifying the substrate specificity of glucose dehydrogenase.
  • a new glucose dehydrogenase found by searching for a glucose dehydrogenase having high substrate specificity can be used in combination with the GDH substrate specificity modifier of the present disclosure.
  • the substrate specificity of GDH is modified, and the modified GDH mutant can be used in combination with the GDH substrate specificity modifier of the present disclosure.
  • the glucose dehydrogenase substrate-specific modifiers used in the glucose assay of the present disclosure are L-growth, D-iditol, L-iditol, D-glucar, sorbitol, ribitol, and trehalose, as well as D-mannitol. It may contain one or more compounds selected from the group consisting of, xylitol, and glycerol, and the glucose dehydrogenase may be FAD-GDH derived from the genus Mucor, for example, GDH derived from Mucor prainii (MpGDH), said FAD-GDH. May be immobilized on the electrode or may not be immobilized.
  • the glucose dehydrogenase substrate-specific modifiers used in the glucose assay of the present disclosure are L-growth, D-iditol, D-glucar, sorbitol, ribitol, and trehalose, as well as D-mannitol, xylitol, and It may contain one or more compounds selected from the group consisting of glycerol, and the glucose dehydrogenase may be FAD-GDH from the genus Mucor, such as Mucor RD056860 GDH (MrdGDH), which FAD-GDH is immobilized on an electrode. It may or may not be fixed.
  • the glucose dehydrogenase substrate-specific modifiers used in the glucose assay of the present disclosure are from L-growth, D-iditol, D-glucar, ribitol, and trehalose, as well as D-mannitol, xylitol, and glycerol. It may contain one or more compounds selected from the group, and the glucose dehydrogenase may be FAD-GDH from the genus Aspergillus, such as Aspergillus oryzae or FAD-GDH from Aspergillus terreus, or GLD1. GDH may or may not be immobilized on the electrode.
  • the substrate specificity modifier of the present disclosure the substrate specificity of glucose dehydrogenase can be modified. As a result, when measuring the glucose concentration of a sample using glucose dehydrogenase, the influence of maltose can be reduced, and more accurate glucose concentration measurement becomes possible. This may be useful for blood glucose control of diabetic patients and the like.
  • the present disclosure provides an electrode comprising a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier.
  • the electrode can be an anode electrode.
  • the anode electrodes of the present disclosure have glucose dehydrogenase.
  • glucose dehydrogenase may be immobilized on the electrodes of the battery.
  • the anode electrodes of the present disclosure can provide a battery in combination with a cathode electrode and a resistor.
  • the present disclosure provides a method of power generation using the batteries described above.
  • a battery comprising the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier of the present disclosure is provided.
  • the present disclosure provides an anode or cathode for a fuel cell and a fuel cell with the anode or cathode.
  • This fuel cell contains the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier of the present disclosure.
  • the present disclosure comprises a method of generating electricity using a battery containing the above-mentioned glucose dehydrogenase substrate specificity modifier, as well as an immobilization of glucose dehydrogenase on an anode electrode and using a substrate corresponding to glucose dehydrogenase, for example glucose, as a fuel.
  • a method of generating electricity in the presence of a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier is provided.
  • the fuel cell of the present disclosure comprises the glucose dehydrogenase substrate specificity modifier, anode or cathode, fuel cell, cathode, anode with glucose dehydrogenase, and electrolyte.
  • An artificial electronic mediator may be adsorbed on the anode or cathode. Examples of the artificial electronic mediator include, but are not limited to, the known mediators described above and the phenylenediamine compounds described in Japanese Patent No. 648441 and Japanese Patent No. 6484742.
  • the fuel cell of the present disclosure may be provided with a wiring for which a load resistor can be arranged between the anode and the cathode, if necessary. In certain embodiments, the load resistance is part of the fuel cell of the present disclosure.
  • the load resistance is not part of the fuel cell of the present disclosure, and the fuel cell of the present disclosure is configured to be connectable to a suitable load resistance.
  • oxidoreductase forms part of the anode.
  • the redox enzyme may be in close proximity to or in contact with the anode, may be immobilized, or may be adsorbed.
  • the fuel tank contains a compound that serves as a substrate for oxidoreductase immobilized on an electrode. For example, if glucose dehydrogenase is immobilized on an electrode, the fuel can be glucose.
  • the fuel cell of the present disclosure may have an ion exchange membrane that separates the anode and cathode.
  • the ion exchange membrane can have pores of 1 nm to 20 nm.
  • the anode can be a common electrode such as a carbon electrode.
  • an electrode made of conductive carbon such as carbon black, graphite, or activated carbon, or an electrode made of metal such as gold or platinum can be used. Specific examples thereof include carbon paper, carbon cloth, glassy carbon, carbon nanotubes, and HOPG (highly oriented pyrolytic graphite).
  • an electrode catalyst generally used in a fuel cell such as platinum or platinum alloy is used as a carbonaceous material such as carbon black, graphite or activated carbon, or a conductive material made of gold, platinum or the like. It is possible to use an electrode carried on the body or a conductor composed of an electrode catalyst itself such as platinum or a platinum alloy as a cathode electrode, and supply an oxidizing agent (catalyst side substrate, oxygen, etc.) to the electrode catalyst. it can.
  • a substrate-reducing enzyme electrode can be used as a cathode paired with an anode composed of the substrate-oxidizing enzyme electrode as described above.
  • the redox enzyme that reduces the oxidizing agent include known enzymes such as laccase and bilirubin oxidase.
  • a known electron transfer mediator may be used, if necessary.
  • the oxidizing agent include oxygen and the like.
  • an oxygen-selective membrane eg, a dimethylpolysiloxane membrane
  • impurities such as ascorbic acid and uric acid
  • the power generation method of the present disclosure includes a step of supplying a compound serving as a substrate for oxidoreductase as a fuel to an anode having oxidoreductase.
  • a compound serving as a substrate for oxidoreductase as a fuel to an anode having oxidoreductase.
  • the substrate is oxidized and the electrons generated at the same time are generated by the oxidoreductase, which is an electron transfer mediator that mediates electron transfer between the oxidase and the electrode, for example, phenylene. It is transferred to a diamine-based compound, and electrons are transferred to a conductive base material (anode electrode) by the electron transfer mediator.
  • An electric current is generated when electrons reach the cathode electrode from the anode electrode through wiring (external circuit).
  • the protons (H + ) generated in the above process move to the cathode electrode in the electrolyte solution. Then, at the cathode electrode, the protons that have moved from the anode in the electrolyte solution, the electrons that have moved from the anode side through the external circuit, and the oxidizing agent (cathode side substrate) such as oxygen and hydrogen peroxide react. Water is produced. This can be used to generate electricity.
  • in vivo glucose can be used as the fuel for the anode.
  • glucose dehydrogenase is required to have substrate specificity that acts only on glucose in order to control the current.
  • the substrate specificity modifier of the present disclosure can also be used for such applications.
  • the ratio (Mal / Glu) of glucose dehydrogenase to maltose reactivity to glucose reactivity can be "modified".
  • modification as used herein may include “increase” and "decrease”. For example, when it is desired to reduce the influence of maltose in measuring the glucose concentration, it is preferable to reduce the ratio (Mal / Glu). Further, for example, when glucose dehydrogenase is used in a fuel cell fueled by a mixture of glucose and maltose, it is preferable to increase the ratio (Mal / Glu) in order to obtain a higher current value.
  • the present disclosure provides not only a method of reducing the glucose dehydrogenase ratio (Mal / Glu), but also a method of increasing the ratio (Mal / Glu), and a substrate specificity modifier for that purpose.
  • “modification” in each description shall be read as “reduction” or "increase”.
  • the substrate specificity of GDH can be changed depending on the application by using the above-mentioned substrate specificity modifier without modifying glucose dehydrogenase by genetic manipulation.
  • the present disclosure provides a method of modifying the substrate specificity of glucose dehydrogenase by using a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier, which is a glucose analog and a low molecular weight compound.
  • a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier which is a glucose analog and a low molecular weight compound.
  • the present disclosure provides the use of a glucose analog and low molecular weight compound glucose dehydrogenase substrate specificity modifier to modify the substrate specificity of glucose dehydrogenase.
  • the present disclosure provides a glucose dehydrogenase substrate specificity modifier, which is a glucose analog and a low molecular weight compound, for use in modifying the substrate specificity of glucose dehydrogenase.
  • the methods of the present disclosure do not include medical practice.
  • Example 1 Introduction of Mucor-derived GDH gene into a host and confirmation of GDH activity
  • the amino acid sequence of Mucor-derived GDH (MpGDH) described in Patent No. 464893 is set to SEQ ID NO: 1 and the nucleotide sequence is set to SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 4 the entire base sequence encoding MrdGDH having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 was synthesized (SEQ ID NO: 4).
  • a DNA construct was prepared by inserting the target gene MpGDH gene or MrdGDH gene into the multi-cloning site of plasmid pUC19 by a conventional method.
  • pUC19 used the pUC19 linearized Vector attached to the In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech).
  • the MpGDH gene or MrdGDH gene was ligated using the In-Fusion HD Cloning Kit described above according to the protocol attached to the kit, and the plasmid for construct (construction plasmid).
  • pUC19-MpGDH, pUC19-MrdGDH were obtained.
  • double-joint PCR (Fungal Genetics and Biology, 2004, Vol. 41, p. 973-981) was performed using the GDH gene, and 5' A cassette consisting of the arm region-pyrG gene-TEF1 promoter gene-flavin-bound GDH gene-3'arm region was constructed, and the pyrG disruption strain derived from the Aspergillus soya NBRC4239 strain (upstream 48 bp of the pyrG gene, coding region 896 bp) was constructed by the following procedure. , Downstream 240 bp deficient strain) was used for transformation.
  • the pyrG gene is a uracil auxotrophic marker.
  • the obtained transformed Aspergillus soya can be grown in a uridine-free medium by introducing pyrG, which is a gene that complements the uridine requirement, and is selected as a strain into which the target gene has been introduced. did it. From the obtained strains, the target transformant was confirmed by PCR and selected.
  • Each GDH production was carried out using transformed Aspergillus soya transformed with the MpGDH or MrdGDH gene.
  • DPY liquid medium in a 200 ml Erlenmeyer flask 1% (w / v) polypeptone, 2% (w / v) dextrin, 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% (w / v) KH2PO4, 0.05% ( w / v) MgSO 4 ⁇ 7H 2 0; the pH unadjusted) 40 ml, was inoculated conidia of each strain, 4 days at 30 ° C., and shaking culture was carried out at 160 rpm.
  • the cells were filtered from the cultured culture, and the obtained medium supernatant fraction was concentrated and desalted to 10 mL with Amicon Ultra-15, 30K NMWL (manufactured by Millipore), and 20 mM phosphorus containing 150 mM NaCl was added. It was replaced with potassium phosphate buffer (pH 6.5). Subsequently, it was applied to HiLoad 26/60 Superdex 200pg (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 150 mM NaCl, and eluted with the buffer to show GDH activity. Fractions were collected to obtain purified MpGDH preparations. Similarly, a refined preparation of Mrd GDH was obtained. These enzymes are in a state of being bound to FAD via the FAD binding site (holoenzyme).
  • Example 2 Effect of substrate specificity modifier when using an immobilized enzyme 10 ⁇ L of 12 mg / ml MpGDH purified preparation, 10 ⁇ L of each glucose analog of 15 mM, and 10 ⁇ L of 20 mM K phosphate buffer were mixed. It was allowed to stand for 2 hours or more. N-Isopropyl-N'-phenyl-p-phenylenediamine (IPPD) is adsorbed and fixed on SCREEN-PRINTED ELECTRODES (DropSens, product number DRP-C110), 12 ⁇ g of each MpGDH is applied, and dried at room temperature. I let you.
  • IPPD N-Isopropyl-N'-phenyl-p-phenylenediamine
  • the electrodes were placed in 25% glutaraldehyde vapor, and the obtained electrodes were purely washed to obtain IPPD / MpGDH immobilized electrodes.
  • connect to the ALS electrochemical analyzer 814D using a dedicated connector (DRP-CAC) immerse the IPPD / GDH-immobilized electrode, Ag / AgCl reference electrode, and platinum counter electrode in PBS, and perform chronoamperometry measurement. went.
  • the applied voltage was +250 mV (Ag / AgCl).
  • the current value became sufficiently stable (about 100 seconds after the start of measurement)
  • maltose was added so that the final concentration was 1 mM in PBS.
  • Example 3 Effect of substrate specificity modifier when using unimmobilized enzyme 10 ⁇ L of 12 mg / ml MpGDH purified preparation, 10 ⁇ L of each glucose analog of 15 mM, and 10 ⁇ L of 20 mM K phosphate buffer Then, it was allowed to stand for 2 hours or more.
  • SCREEN-PRINTED ELECTRODES manufactured by DropSens, product number DRP-C110
  • 80 ⁇ L of PBS, 5 ⁇ L of each MpGDH solution, and 10 ⁇ L of 2 mg / ml mPMS solution were applied and mixed.
  • the applied voltage was +100 mV (Ag / Ag +), and chronoamperometry measurement was performed.
  • a maltose solution was added so as to have a final concentration of 5 mM, and the mixture was mixed by pipetting. The measurement was stopped when the current value was sufficiently stable, and the difference before and after the addition of maltose was taken as the response current value of maltose. When an equal amount of pure water was added instead of the maltose solution, no increase in the response current was observed.
  • the printed electrode used was thoroughly washed with ultrapure water, dried, and chronoamperometry measurement was performed in the same manner as described above. A glucose solution was added instead of the maltose solution, and the glucose response current value was measured.
  • maltose / glucose The value obtained by dividing the response current value of maltose by the response current value of glucose was calculated as maltose / glucose (%).
  • maltose / glucose of MpGDH 100%, it becomes 67% when sorbitol is added, 58% when ribitol is added, 56% when L-growth is added, and D-iditol is added.
  • 84% when L-iditol was added, it was 68%, and when trehalose was added, it was 72%, which modified the substrate specificity.
  • L-iditol was found to act as a substrate specificity modifier when the enzyme was not immobilized.
  • Example 4 Effect of substrate specificity modifier when using carbon cross electrode 80 ⁇ l of N'N-diphenyl-p-phenylenediamine (DPPD) adsorbed and fixed multi-walled carbon nanotube solution (1.4 wt%, MWCNT solution) ) was applied to a 5 mm square carbon cloth (manufactured by Toyo Technica) in multiple times. After it was sufficiently dried, it was washed with ultrapure water.
  • DPPD N'N-diphenyl-p-phenylenediamine
  • Example 5 Effect of combination of substrate specificity modifier on carbon cross electrode
  • a MWCNT / DPPD / MpGDH immobilized electrode was prepared in the same manner as in Example 4. However, only the process of applying 20 ⁇ l of 40 mg / ml wild MpGDH 20 ⁇ l and 10 ⁇ l of 100 mM glycerol and 100 mM L-iditol dissolved in ultrapure water to the MWCNT / DPPD immobilized electrode is changed. Made. Then, chronoamperometry was measured by the method described in Example 4 to calculate maltose / glucose (%).
  • Example 6 Construction of fuel cell
  • the carbon cloth electrode prepared in Example 4 using the solution containing purified GDH and D-mannitol was used as an anode electrode.
  • IPPD was used instead of DPPD as the mediator.
  • a cathode electrode was prepared by adsorbing and fixing 10 mg / ml bilirubin oxidase (BOD, manufactured by Sigma) on a carbon cloth adsorbed with a multi-walled carbon nanotube solution (1.4 wt%, MWCNT solution).
  • a variable resistor was connected between the anode electrode and the wiring connecting the cathode electrode, and an ALS electrochemical analyzer 814D was connected.
  • an electrolyte solution containing PBS (pH 7.4) and 200 mM D-glucose was used, and the above anode and cathode electrodes were immersed. It was measured at room temperature using the open circuit potential, which is a potentiostat technique. As a result, a current value of 0.125 mA / cm 2 was obtained when connected to 10 k ⁇ .
  • the fuel cell of the present disclosure is considered as follows. That is, by using the electrode in which GDH was immobilized in the presence of various glucose analogs in Example 4, it was possible to react with glucose with high substrate specificity. Therefore, for example, in the case of a fuel cell using the anode electrode of the present disclosure, when the fuel is a component in the living body in which maltose and glucose coexist, for example, a meal or an infusion solution is ingested, and the maltose concentration temporarily increases. It is expected that it will be possible to pass a constant current even in the case of maltose.
  • the substrate specificity of GDH can be modified according to the application. This is advantageous in various applications.
  • the substrate specificity of glucose dehydrogenase can be modified.
  • the influence of maltose can be reduced, and more accurate glucose concentration measurement becomes possible. This may be useful for blood glucose control of diabetic patients and the like.
  • by modifying the substrate specificity of glucose dehydrogenase so as to increase the reactivity to maltose it is possible to obtain a higher current value when using a fuel cell containing a mixture of glucose and maltose as a fuel. Become.

Abstract

グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変することを課題とする。　グルコースアナログであり低分子化合物であるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を用いる、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法及びグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を提供する。

Description

グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法及びグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤
　本開示は、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法及びグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤に関する。
　グルコース測定は、糖尿病患者の血糖値モニタリングなどに用いられる。グルコースの定量には通常、グルコースオキシダーゼ（以下、ＧＯＤともいう）やグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨともいう）が用いられる。
　グルコースオキシダーゼはβ－Ｄ－グルコースをＤ－グルコノ－１，５－ラクトン（グルコノラクトン）へ酸化する反応を触媒する酸化還元酵素である。グルコースオキシダーゼは酸素を電子受容体とし、また補因子としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を用いる。
　グルコースデヒドロゲナーゼは酸化還元酵素に分類され、グルコース及び電子アクセプターを基質とし、グルコノラクトン及び還元型アクセプターを生成する反応を触媒する。グルコースデヒドロゲナーゼとしてはニコチンアミドジヌクレオチド依存性ＧＤＨ、ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸依存性ＧＤＨ、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性ＧＤＨ、ＦＡＤ依存性ＧＤＨ（フラビン結合型ＧＤＨ）等が挙げられる。
　グルコースを基質とする酵素を用いて血中グルコースを測定する場合、当該酵素の基質特異性が問題となることがある。特にマルトースに対する反応性が問題となることがあった。例えば野生型ＰＱＱ－ＧＤＨはグルコース特異的ではなく、マルトース、ガラクトース、及びキシロース等の他の糖とも反応する。非特許文献１は、ＰＱＱ－ＧＤＨを用いたグルコース測定において、系に存在するマルトース等に起因して、実際よりも増大したグルコース値が誤って得られ、これが低血糖の原因となる問題について記載している。したがって、酵素を用いたグルコース測定では、グルコースへの特異性が高く、マルトースのような他の糖に対する反応性が低い測定試薬が求められていた。
　グルコースに対する基質特異性を高めるために、或いはマルトースに対する反応性を低減するために、基質特異性の優れたグルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）を探索するアプローチが試みられ、種々のFAD依存性GDHが見出された（非特許文献２、３参照）。また、単離されたGDHについて、その遺伝子を取得し、遺伝子工学的に改変して、基質特異性を改変するアプローチも試みられている。
　一方で、グルコースに対する特異性とは別に、酵素の安定性が問題となることがある。特許文献１（特開２０１５－１３９３７６）は、鉱物であるスメクタイトを添加して、グルコースデヒドロゲナーゼの安定性を高める方法を記載している。
　特許文献２（国際公開第２００５／０５４８４０号パンフレット）は、ヘマトクリット値を高精度及び高信頼性で測定することにより血液成分量を十分かつ正確に補正可能な血液成分の測定方法およびそれに用いるセンサならびに装置を提供することを目的としており、グルコースデヒドロゲナーゼを含む装置を記載している。段落００２７には、酵素安定化剤として糖アルコールが列挙され、マルチトールが好ましいとされている。また実施例ではマルチトールが用いられている。
　特許文献３（特開２００５－１１４３５９）は、複雑な補正工程を必要とせず、成分の測定方法及びセンサを提供することを目的としており、血液中のグルコースの測定方法およびそれに用いるセンサを記載している。段落００１６には、酵素安定化剤として糖アルコールが列挙され、マルチトールが好ましいとされている。実施例ではマルチトールが用いられている。
　特許文献４（国際公開第２００１／０２５７７６号パンフレット）はPQQ-GDHを用いたグルコースセンサを記載している。第８頁には、バイオセンサの反応層に安定化剤を添加してもよいことの記載があり、安定化剤として糖の開示がある。また糖が列挙されており、グルコース及びマルトースの記載がある。実施例に安定化剤として糖を用いたことの記載は見当たらない。
　特許文献５（特開２００９－１９５２５０）は、可溶性グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法を記載しており、アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・テレウス由来FAD-GDH組換え体及びトレハロースを含む組成物を記載している。
　特許文献６（特開２０１４－０１８０９６）は、フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法を記載している。
特開２０１５－１３９３７６（特許第６４０２８８７号） 国際公開第２００５／０５４８４０号パンフレット 特開２００５－１１４３５９ 国際公開第２００１／０２５７７６号パンフレット 特開２００９－１９５２５０（特許第５１７６０４５号） 特開２０１４－０１８０９６（特許第６１０１０１１号）
Frias, et. al., Diabetes Care, Vol. 33, No. 4, April 2010, pp. 728-729 Tsujimura S, et. al., Biosci Biotechnol Biochem., Vol. 70, 2006, pp. 654-659 Satake R, et. al., J Biosci Bioeng., Vol. 120, 2015, pp. 498-503
　本開示は、グルコースアナログである低分子化合物を用いることにより、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法、及びグルコースアナログであり低分子化合物であるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の問題に鑑み、新規のGDH酵素を探索するアプローチや、既存のGDHに変異を導入してその基質特異性を改変するアプローチとは別の方法により、マルトース等のグルコースではない糖類への反応を改変させる方法について鋭意検討した。その結果、特定のグルコースアナログである低分子化合物が、驚くべきことに、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼのグルコースではない糖類（例えばマルトース）への反応性を改変させることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本開示は以下の実施形態を包含する。 　
[１]　グルコースアナログであり低分子化合物であるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を用いることにより、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法であって、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いてグルコース測定を行うときに、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤とグルコースデヒドロゲナーゼとを共存させることを含み、該改変剤の不在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）と比較して、該改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）が改変される、前記方法。 　
[２]　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤がソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、トレハロース、D-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、実施形態１に記載の方法。 　
[３]　グルコースデヒドロゲナーゼがムコール属又はアスペルギルス属由来のグルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態１又は２に記載の方法。 　
[４]　グルコースデヒドロゲナーゼが固相表面に固定化されている、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。 　
[５]　グルコースデヒドロゲナーゼが固相表面に固定化されていない、実施形態１～３のいずれかに記載の方法。 　
[６]　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤であって、該改変剤はグルコースのアナログである低分子化合物であり、該改変剤の不在下でのFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）のマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）と比較して、該改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）が改変される、前記グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤。 　
[７]　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤がソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、トレハロース、D-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、実施形態６に記載の改変剤。 　
[８]　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤がソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、D-マンニトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、実施形態６に記載の改変剤。 　
[９]　グルコースデヒドロゲナーゼがムコール属又はアスペルギルス属由来のグルコースデヒドロゲナーゼである、実施形態６～８のいずれかに記載の改変剤。 　
[１０]　実施形態６～９のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及び固相表面に固定化されたグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用システム。 　
[１１]　実施形態６～９のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及び固相表面に固定化されていないグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用システム。 　
[１２]　実施形態６～９のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用組成物又はグルコース測定試薬。 　
[１３]　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤と、グルコースデヒドロゲナーゼとを、個別の試薬として含む、実施形態１２に記載のグルコース測定用組成物又はグルコース測定試薬。 　
[１４]　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤と、グルコースデヒドロゲナーゼとを、同一試薬中に含む、実施形態１２に記載のグルコース測定用組成物又はグルコース測定試薬。 　
[１５]　実施形態６～９のいずれかに記載の改変剤又は実施形態１０若しくは１１に記載のシステム、又は実施形態１２～１４のいずれかに記載の組成物若しくは試薬を用いた、グルコース測定方法。 　
[１６]　以下の工程を含む、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤のスクリーニング方法、
i)　グルコースデヒドロゲナーゼを用意する工程、
ii)　該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）を決定する工程、
iii)　前記i)のグルコースデヒドロゲナーゼとグルコースのアナログである低分子化合物である候補物質とを接触させ、その後、候補物質の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）を決定する工程、
iv)　前記ii)における比（Mal/Glu）と、iii)における候補物質の存在下での比（Mal/Glu）とを比較する工程、及び
v) 前記ii)における比（Mal/Glu）よりも、iii)における候補物質の存在下での比（Mal/Glu）が改変されている場合には、当該候補物質を、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤とする工程。 　
[１７]　実施形態１６に記載の方法により同定されたグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を、グルコース測定試薬又はグルコース測定組成物に配合することを含む、グルコース測定試薬又はグルコース測定組成物の製造方法。 　
[１８]　実施形態１６に記載の方法により同定されたグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定試薬。 　
[１９]　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含む電極、ここで前記グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、ソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、トレハロース、D-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、前記電極。 　
[２０]　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含む電池、ここで前記グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、ソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、トレハロース、D-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、前記電池。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-058223号及び日本国特許出願番号2019-182592号の開示内容を包含する。
　本開示により、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変することができる。
　ある実施形態において、本開示は、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を提供する。本開示の基質特異性改変剤はグルコースのアナログ（類似体）であり得る。本明細書において、グルコースのアナログとは、グルコースと化学構造が類似しているが、グルコースデヒドロゲナーゼにより基質と認識されない糖化合物又は糖アルコール化合物を言う。グルコースアナログは低分子化合物であり得る。ここで言う低分子化合物とは、分子量（g/mol）が約90～約380の化合物、例えば約150～約380の化合物を言う。また、グルコースデヒドロゲナーゼにより基質と認識されない、とは、グルコースデヒドロゲナーゼにより基質として全く認識されない、又は実質的に基質として認識されないことをいう。実質的に基質として認識されない、とは具体的には、グルコースを基質とした場合の活性（反応性）を100%とすると、グルコースアナログに対する活性が1%以下、0.5%以下、0.1%以下、0.05%以下、0.01%以下、0.005%以下、0.001%以下、例えば0.0005%以下であることをいう。
　ある実施形態において、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、L-グロース、D-イジトール、L-イジトール、ソルビトール、リビトール（CAS no. 488-81-3、アドニトールともいう）、トレハロース、及びD-グルカール、並びにD-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む。別の実施形態において、本開示の基質特異性改変剤は、L-グロース、D-イジトール、L-イジトール、ソルビトール、リビトール、トレハロース、D-グルカール、D-マンニトール、キシリトール、グリセロール又はその１以上の組み合わせである。
　本開示の基質特異性改変剤が、L-グロース（CAS No. 6027-89-0）を含む場合、これはL体及びD体の混合物、例えばラセミ体として提供されてもよく、又はL体として提供されてもよい。本明細書において、ある光学活性な化合物についてL体とは、例えば光学純度90～100%ee、例えば95～100%ee、例えば97～100%eeにてL体が存在することをいう。例えばL-グロースは、光学純度90～100%ee、例えば95～100%ee、例えば97～100%eeのものであり得る。
　本開示の基質特異性改変剤がD-イジトール（CAS no. 25878-23-3）を含む場合、これは好ましくはD体として提供される。本明細書において、ある光学活性な化合物についてD体とは、例えば光学純度90～100%ee、例えば95～100%ee、例えば97～100%eeにてD体が存在することをいう。例えばD-イジトールは、光学純度90～100%ee、例えば95～100%ee、例えば97～100%eeのものであり得る。
　本開示の基質特異性改変剤がL-イジトール（CAS no. 488-45-9）を含む場合、これは好ましくはL体として提供される。例えばL-イジトールは、光学純度90～100%ee、例えば95～100%ee、例えば97～100%eeのものであり得る。
　本開示の基質特異性改変剤がD-グルカール（CAS no. 13265-84-4）を含む場合、これは好ましくはD体として提供される。例えばD-グルカールは、光学純度90～100%ee、例えば95～100%ee、例えば97～100%eeのものであり得る。
　本開示の基質特異性改変剤がD-マンニトール（CAS no. 69-65-8）を含む場合、これは好ましくはD体として提供される。例えばD-マンニトールは、光学純度90～100%ee、例えば95～100%ee、例えば97～100%eeのものであり得る。
　ある実施形態において、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、スメクタイトを含まない。
　本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、グルコース測定時における測定溶液中での終濃度が、0.1mM～1000mM、例えば0.1mM～500mM、0.1mM～300mM、0.1mM～100mM、0.1mM～80mM、0.1mM～70mM、0.1mM～60mM、0.1mM～50mM、0.2mM～20mM、0.25mM～10mM、例えば5mMとなるように、グルコース測定試薬又はグルコース測定組成物に配合され得る。ある実施形態において、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びグルコースデヒドロゲナーゼを含む水溶液を電極に塗布し、乾燥させることができる。この場合、乾燥時にグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は濃縮され、乾燥前の終濃度よりも高い濃度となることが想定される。このような乾燥後の高濃度での、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及び、該改変剤を塗布された電極も本開示に包含される。
　ある実施形態において、本開示は、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用組成物又はグルコース測定試薬を提供する。ある実施形態において、グルコース測定試薬は溶液形態又は乾燥形態であり得る。ある実施形態において、グルコース測定試薬中のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤と、グルコースデヒドロゲナーゼとは、個別の試薬として含まれ得る。別の実施形態では、グルコース測定試薬中のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤と、グルコースデヒドロゲナーゼとは、同一試薬中に含まれ得る。さらなる実施形態では、グルコース測定試薬はグルコースデヒドロゲナーゼを含まず、この場合、グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコース測定時に測定溶液に添加され得る。別の実施形態では、グルコース測定試薬はグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を含まず、この場合、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、グルコース測定時に測定溶液に添加され得る。
　ある実施形態において本開示は、該基質特異性改変剤及びグルコースデヒドロゲナーゼを用いた、グルコース測定方法を提供する。グルコース測定方法はグルコースの濃度を測定する方法であり得る。グルコース測定方法はグルコースの濃度を定量する方法であり得る。測定される試料は、グルコースを含むものであり得る。測定される試料は、マルトースを含むものであり得る。グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、グルコース測定試薬に予め含まれてもよく、又はグルコース測定時に測定溶液に添加されてもよい。
　本開示のグルコース測定法では、測定時においてグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤が0.1mM～1000mM、例えば0.1mM～500mM、0.1mM～300mM、0.1mM～100mM、0.1mM～80mM、0.1mM～70mM、0.1mM～60mM、0.1mM～50mM、0.2mM～20mM、0.25mM～10mM、例えば5mMの終濃度にて測定溶液に含まれ得る。
　ある実施形態において、本開示のグルコース測定法では、前記のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、グルコース測定溶液に含まれていてもよい。この場合、当該グルコース測定溶液に、グルコースデヒドロゲナーゼ及び試料を添加して、測定を開始してもよい。或いは、グルコースデヒドロゲナーゼを電極に固定化し、当該グルコース測定溶液及び試料を電極に接触させ、グルコース測定を行ってもよい。
　別の実施形態では、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、予めグルコース測定試薬に含まれていてもよい。この測定試薬はグルコースデヒドロゲナーゼを含むものであってもよく、又は含まないものであり得る。測定試薬がグルコースデヒドロゲナーゼを含む場合、そこに試料を添加してグルコース測定を開始しうる。測定試薬がグルコースデヒドロゲナーゼを含まない場合、そこに試料及びグルコースデヒドロゲナーゼを（任意の順で）添加してグルコース測定を開始しうる。或いは、グルコースデヒドロゲナーゼを電極に固定化し、当該測定試薬及び試料を電極に接触させ、グルコース測定を行ってもよい。
　本明細書では、特に断らない限り、グルコースデヒドロゲナーゼとは、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）をいう。グルコースデヒドロゲナーゼとして、公知のFAD-GDHを用いることができる。公知のFAD-GDHの由来微生物の好適な例としては、ケカビ亜門、好ましくはケカビ綱、より好ましくはケカビ目、さらに好ましくはケカビ科に分類される微生物を挙げることができる。具体的には、ムコール(Mucor)属、アブシジア(Absidia)属、アクチノムコール(Actinomucor)属、シルシネラ(Circinella)属由来のFAD-GDH等が挙げられる。
　Mucor属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Mucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f. circinelloides、Mucor guilliermondii、Mucor hiemalis f. silvaticus、Mucor subtilissimus、Mucor dimorphosporus等が挙げられる。より具体的には、Mucor prainii、Mucor javanicus、Mucor circinelloides f. circinelloides、Mucor guilliermondii NBRC9403、Mucor hiemalis、Mucor hiemalis f. silvaticus NBRC6754、Mucor subtilissimus NBRC6338、Mucor RD056860、Mucor dimorphosporus NBRC5395等が挙げられる。Absidia属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Absidia cylindrospora、Absidia hyalosporaを挙げることができる。Actinomucor属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Actinomucor elegansを挙げることができる。Circinella属に分類される微生物であって、具体的な好ましい微生物の例としては、Circinella minor、Circinella mucoroides、Circinella muscae、Circinella rigida、Circinella simplex、Circinella umbellataを挙げることができる。より具体的には、Circinella minor NBRC6448、Circinella mucoroides NBRC4453、Circinella muscae NBRC6410、Circinella rigida NBRC6411、Circinella simplex NBRC6412、Circinella umbellata NBRC4452、Circinella umbellata NBRC5842、Circinella RD055423及びCircinella RD055422を挙げることができる。なお、NBRC菌株およびRD菌株はNBRC（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター）の保管菌株である。これらのFAD-GDHには、その変異体も包含される。
　他の公知のFAD-GDHとしてはアスペルギルス属由来のFAD-GDH、例えばアスペルギルス・オリゼ由来GDH、アスペルギルス・アワモリ由来GDH、アスペルギルス・アウレウス由来GDH、アスペルギルス・ニガー由来GDH、アスペルギルス・フォエチダス由来GDH、アスペルギルス・イイズカエ由来GDH、アスペルギルス・バージカラー由来GDH、アスペルギルス・ホエニクス由来GDH、アスペルギルス・ビスポラス由来GDH、Aspergillus brunneo-uniseriatus由来GDH、Aspergillus carneus由来GDH、Aspergillus malignus由来GDH及びアスペルギルス・テレウス由来GDHが挙げられる。これらのFAD-GDHには、その変異体も包含される。
　他の公知のFAD-GDHとしてはグロメラ属由来のFAD-GDH、例えばGlomerella fructigena由来GDH、例えばGlomerella fructigena NBRC5951株由来GDH、Glomerella cingulata由来GDH、例えばGlomerella cingulata NBRC107000株由来GDH、コレトトリカム属由来のFAD-GDH、例えばColletotrichum gloeosporioides由来GDH、Colletotrichum chlorophyti由来GDH、Colletotrichum orbiculare由来GDH、ボトリオスフェリア属由来のFAD-GDH、例えばBotryosphaeria parva由来GDHが挙げられる。また、ブルクホルデリア属由来のFAD-GDH、例えば膜タンパク質であるBurkhorderia cepacia由来GDH、Burkhorderia cepacia KS1株由来GDHが挙げられる。例えば特開2019-000020(特許第6453385号)、国際公開第2017/002896号、国際公開第2002/036779号(特許第4107386号)等を参照のこと。これらのFAD-GDHには、その変異体も包含される。
（FAD-GDHをコードする遺伝子の取得）
　FAD-GDHをコードする遺伝子は、遺伝子工学的手法により取得することができる。FAD-GDH遺伝子を取得するには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を用いればよい。例えばFAD-GDH生産能を有する公知の微生物菌体や種々の細胞から、常法により、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNA又はcDNAを用いて、染色体DNA又はcDNAのライブラリーを作製することができる。
　ついで、公知のFAD-GDHのアミノ酸配列情報に基づき、適当なプローブDNAを合成して、これを用いて染色体DNA又はcDNAのライブラリーから基質特異性の高いFAD-GDH遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、5’RACE法や3’RACE法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（PCR法）により、基質特異性の高いFAD-GDHをコードする目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらのDNA断片を連結させて、目的のFAD-GDH遺伝子の全長を含むDNAを得ることができる。
　取得されたFAD-GDH遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるFAD-GDHの酵素科学的性質を指標に選択を行う方法を採用し得る。
　出発物質であるFAD-GDH遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、FAD-GDH遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。 
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは5-ブロモウラシル等を挙げることができる。
　この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をFAD-GDH遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは0.5～12Mの上記薬剤濃度において、20～80℃の反応温度下で10分間以上、好ましくは10～180分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、p24～30、1989年6月号）。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisとして知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法 (Nucleic Acids Res.,12,9441(1984):Methods Enzymol.,154,350(1987):Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Acids Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,9679(1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,82,488(1985)：Methods Enzymol.,154,367(1987))等が挙げられる。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit;Clonetech社、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit;Stratagene製、Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit;Stratagene製など）の利用が挙げられる。
　また、一般的なポリメラーゼチェインリアクション(Polymerase Chain Reaction)として知られる手法を用いることもできる(Technique,1,11(1989))。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法又は酵素合成法により、直接所望のFAD-GDH遺伝子を合成することもできる。
　上記のような任意の方法により選択されたFAD-GDH遺伝子のDNA塩基配列の決定又は確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000（ベックマン・コールター社製）等を用いれば良い。
（FAD-GDH遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
　上述のように得られたFAD-GDH遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
　原核宿主細胞の一例としては、エシェリヒア属に属する微生物、例えば大腸菌K-12株、エシェリヒア・コリーBL21(DE3)、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5α、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600等（いずれもタカラバイオ社製）が挙げられる。それらを形質転換し、又は、それらに形質導入して、DNAが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばECOS Competent エシェリヒア・コリーBL21(DE3)；ニッポンジーン製）を用いても良い。
　真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、TRP1のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で目的遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、ADH1プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法(MethodsMol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995))やエレクトロポレーション(J Microbiol Methods 55 (2003)481-484)等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えばよい。
　また、例えば、真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス(Aspergillus)属やトリコデルマ(Tricoderma)属のようなカビ細胞が挙げられる。カビ細胞の形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、FAD-GDHをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、FAD-GDHをコードする遺伝子を発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したDNAコンストラクトを作製し、次いでFAD-GDHをコードする遺伝子を含むDNAコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換することにより、FAD-GDHをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－FAD-GDHをコードする遺伝子－ターミネーターからなるDNA断片及び該DNA断片を含む組換えベクターをDNAコンストラクトと総称してよぶ。
　FAD-GDHをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
　相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、DNAコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるTEF1遺伝子(tef1)のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子(amy)のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子(alp)プロモーター領域などが挙げられる。
　ベクターを利用する方法では、DNAコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
　そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主糸状菌中でFAD-GDHを生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、pUC19及び糸状菌の系、pSTA14（Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989）及び糸状菌の系などが挙げられる。
　DNAコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)）にDNAコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
　DNAコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、pyrG、niaD、adeAのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢオリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、DNAコンストラクトは、宿主細胞中でFAD-GDHをコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、tef1プロモーター、alpプロモーター、amyプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、alpターミネーター、amyターミネーター、tef1ターミネーターなどが挙げられる。
　DNAコンストラクトにおいて、FAD-GDHをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入するFAD-GDHをコードする遺伝子を含むDNA断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、DNAコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
　DNAコンストラクトの一実施態様は、例えば、pUC19のマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteに、tef1遺伝子プロモーター、FAD-GDHをコードする遺伝子、alp遺伝子ターミネーター及びpyrGマーカー遺伝子を連結させたDNAコンストラクトである。
　糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストPEG法（例えば、Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989、特開2007-222055号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてpyrG遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、0.5%寒天及び1.2Mソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
　また、例えば、形質転換糸状菌を得るために、相同組換えを利用して、宿主糸状菌が本来染色体上に有するFAD-GDHをコードする遺伝子のプロモーターをtef1などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、pyrGなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開2011-239681に記載の実施例１や図１を参照して、FAD-GDHをコードする遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－FAD-GDHをコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、FAD-GDHをコードする遺伝子の上流領域及びFAD-GDHをコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。FAD-GDHをコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは0.5kb以上あることが好ましい。
　形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、FAD-GDHの酵素活性が認められる条件下で形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるFAD-GDHの活性を確認することにより行うことができる。
　また、形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、形質転換糸状菌から染色体DNAを抽出し、これを鋳型としてPCRを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
　例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
（FAD-GDH酵素の製造方法）
　FAD-GDH酵素は、上述のように取得したFAD-GDHを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるFAD-GDH遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からFAD-GDHを単離することにより製造すればよい。
　上記宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　培地の初発pHは、限定されないが、例えば、pH 6～9に調整することができる。培養は、10～42℃の培養温度、好ましくは25℃前後の培養温度で4時間～1週間、さらに好ましくは25℃前後の培養温度で4時間～5日間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
　培養終了後、該培養物よりFAD-GDH酵素を採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、もしくはリゾチームやヤタラーゼ等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、FAD-GDHの粗酵素を得る。
　FAD-GDHの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたFAD-GDH酵素標品を得ることができる。
　ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼは、固相に固定化されていてもよい。ある実施形態において本開示は、前記の基質特異性改変剤、及び、グルコースデヒドロゲナーゼが固定化された固相を含む、グルコース測定キット又はグルコース測定システム（装置）を提供する。固相としては、ビーズや粒子、ポリマー、電極表面などが挙げられるがこれに限らない。例えば、ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼは、電極に固定化されていてもよい。ある実施形態において本開示は、前記の基質特異性改変剤、及び、グルコースデヒドロゲナーゼが固定化された電極を含む、グルコース測定システム（装置）を提供する。
（グルコースデヒドロゲナーゼの固定化方法）
　グルコースデヒドロゲナーゼは任意の公知の方法により固相に固定化されうる。グルコースデヒドロゲナーゼをビーズや膜、炭素粒子、金粒子、白金粒子、ポリマー、電極表面に固定化してもよい。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、グルコースデヒドロゲナーゼをポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いてグルコースデヒドロゲナーゼをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。ある実施形態では、グルコースデヒドロゲナーゼを固相表面に固定化する際に、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を存在させてもよい。
　ある実施形態では、グルコースデヒドロゲナーゼを電極に固定化して用いる場合、又はグルコースデヒドロゲナーゼを固定化することなく用いる場合、メディエータとして、公知のメディエータ、例えば1-メトキシ-5-メチルフェナジニウムメチルスルファート（mPMS）、5-メチルフェナジニウムメチルスルファート（PMS）、5-エチルフェナジニウムメチルスルファート（PES）等のフェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、フェリシアン化カリウム等のフェリシアン化物、フェロセン、ジメチルフェロセン、フェロセンカルボン酸等のフェロセン系化合物、ナフトキノン、アントラキノン、ヒドロキノン、ピロロキノリンキノン等のキノン系化合物、シトクロム系化合物、ベンジルビオロゲンやメチルビオロゲン等のビオロゲン系化合物、ジクロロフェノールインドフェノール等のインドフェノール系化合物、塩化ヘキサアンミンルテニウム等のルテニウム錯体、オスミウム-2,2’-ビピリジン等のオスミウム錯体、p-フェニレンジアミン、N-イソプロピル-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン(IPPD)、N',N-ジフェニル-ｐ-フェニレンジアミン(DPPD)、N-(1,3-ジメチルブチル)-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン、N,N,N’,N’－テトラメチル－1,4－フェニレンジアミン等のフェニレンジアミン系化合物を用いることができる。また、これらのメディエータはポリビニルイミダゾール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸などのポリマーに修飾されて用いることもできる。また、これらのメディエータはGDHに架橋試薬等を用いて固定化することもできる。また、これらのメディエータは特許第6484741号及び特許6484742号を参照にして、疎水性相互作用により電極に固定化することもできる。参照によりこれらの全内容を本明細書に組み入れる。また、これらのメディエータは電極表面を酸処理等して活性化させた後に、電極に固定化することもできる。電極は炭素、金、白金等の素材等を用いることが出来る。
　試料溶液に添加するメディエータの終濃度は特に限定されず、例えば、1pM～1M、1pM～100mM、1pM～20mM、1pM～10mM、1pM～5mM、2pM～1mM、3pM～800μM、4pM～600μM、5pM～500μM、6pM～400μM、7pM～300μM、8pM～200μM、9pM～100μM、10pM～50μMの範囲であり得る。なお、メディエータと他の試薬との添加順序は制限されず、同時でも逐次添加でもよい。
　ある実施形態において酸化還元反応を行う時間又は電気化学的測定を行う時間は、60分以下、30分以下、10分以下、5分以下、又は1分以下とすることができる。または、長期間測定する酵素センサーや電池等においては、酸化還元反応を行う時間は、60分以上、120分以上、1日以上、2日以上、3日以上、1週間以上、2週間以上、3週間以上とすることができる。
　特に断らない限り、組成物に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼ或いは電極に固定化されたグルコースデヒドロゲナーゼは、精製されたグルコースデヒドロゲナーゼ酵素である。
（グルコースデヒドロゲナーゼの活性測定）
　グルコースデヒドロゲナーゼ（GDH）の活性測定を説明する。GDH(EC 1.1.99.10)は、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ－δ－ラクトンを生成する反応を触媒する。このとき電子受容体が電子を受け取り、還元型電子受容体になる。GDHの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート(PMS)及び2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１）　D-グルコ－ス　＋　PMS（酸化型）
　　　　　　　　→　D-グルコノ-δ-ラクトン　＋　PMS（還元型）
（反応２）　PMS（還元型）　＋　DCIP（酸化型）
　　　　　　　　→　PMS（酸化型）　＋　DCIP（還元型）
　具体的には、まず、（反応１）において、D-グルコースの酸化に伴い、PMS（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、PMS（還元型）が酸化されるのに伴ってDCIPが還元される。この「DCIP（酸化型）」の消失度合を波長600nmにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
　GDHの活性は、以下の手順に従って測定することができる。100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 2.05mL、1M D-グルコース溶液 0.6mLおよび2mM DCIP溶液 0.15mLを混合し、37℃で5分間保温する。次いで、15mM PMS溶液　0.1mL及び酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の１分間あたりの減少量(ΔA600)を求め、次式に従いGDH活性を算出する。この際、GDH活性は、37℃において濃度200mMのD-グルコース存在下で１分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、式中の3.0は反応試薬＋酵素試薬の液量(mL)、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm2/μmol)、0.1は酵素溶液の液量(mL)、1.0はセルの光路長(cm)、ΔA600blankは100mM リン酸緩衝液(pH7.0)を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の600nmにおける吸光度の１分間あたりの減少量、dfは希釈倍数を表す。
　本開示のグルコース測定用キットは、少なくとも１回のアッセイに十分な量の基質特異性改変剤を含む。典型的には、本開示のグルコース測定用キットは、基質特異性改変剤に加えて、グルコースデヒドロゲナーゼ、アッセイに必要な緩衝液、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース基質標準溶液、ならびに指針を含む。基質標準溶液はグルコース標準溶液であり得る。なお、グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性を評価する場合には、濃度既知のマルトース基質標準溶液を用いることもできる。
　ある実施形態において、本開示のグルコース測定用キットは、基質特異性改変剤とグルコースデヒドロゲナーゼとを同一試薬として含む。別の実施形態において、本開示のグルコース測定用キットは、基質特異性改変剤とグルコースデヒドロゲナーゼとを別々の試薬として含む。別の実施形態では、グルコースデヒドロゲナーゼは電極に固定化されていてもよく、そのような電極に対して用いる本開示のグルコース測定用キットは基質特異性改変剤を単一試薬として含む。ただしここでいう単一試薬とは、当該試薬が基質特異性改変剤以外の物質を含まないことを意味するものではない。基質特異性改変剤は溶液状態でも乾燥状態、例えば粉末でもよい。
　比色法を用いた一例としてグルコース濃度の測定が挙げられる。グルコース濃度の測定は、比色式測定用の場合は、例えば、以下のように行うことができる。反応層にはグルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、そして反応促進剤としてN-(2-アセトアミド）イミド２酢酸(ADA)、ビス(2-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてpH緩衝剤、発色試薬（変色試薬）を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、GDHより電子を直接受け取ることによって重合し生成する色素もしくは還元された色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
　この方法において使用できる発色試薬（変色試薬）としては、例えば2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)を電子受容体として添加し、600nmにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー(NTB)を加え、570nm吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する発色試薬（変色試薬）はこれらに限定されない。
（酵素センサー）
　ある実施形態においてグルコースは、酵素センサーにより検出又は測定され得る。酵素センサーは、グルコースデヒドロゲナーゼが固定化された電極を含み得る。また、電極には上記のメディエータが吸着していてもよい。酵素センサーの電極としては、例えばカーボン電極、金電極、白金電極などが挙げられ、この電極上にグルコースデヒドロゲナーゼを塗布または固定化することができる。さらに、導電性材料としてCo、Pd、Rh、Ir、Ru、Os、Re、Ni、Cr、Fe、Mo、Ti、Al、Cu、V、Nb、Zr、Sn、In、Ga、Mg、Pb、Au、Pt、Agのうち少なくとも一種類の元素を含む金属微粒子が含まれていてもよく、これらは、合金であっても、めっきを施したものであってよい。カーボンとして、カーボンナノチューブやカーボンブラック、グラファイト、フラーレン、及びその誘導体等も含まれる。ある実施形態において酵素センサーはグルコースセンサーであり得る。すなわち、ある実施形態において本開示は、前記の基質特異性改変剤及びグルコースセンサーを用いる、グルコースの検出方法又は測定方法を提供する。該グルコースセンサーは持続血糖測定や連続グルコースモニタリングに使用可能である。
　本開示の基質特異性改変剤を含む組成物又は試薬は、グルコースデヒドロゲナーゼを固定化した電極、又は酵素センサー等と共に、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いて、種々の電気化学的測定に用いることができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、例えばクロノアンペロメトリー、ポテンシャルステップ・クロノアンペロメトリー、ボルタンメトリー、例えばサイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばグルコース測定では、アンペロメトリー法により、グルコースが還元される際の電流を測定することで、試料中のグルコース濃度を算出することができる。印加電圧は条件や装置の設定にもよるが、例えば-1000mV～+1000mV(vs. Ag/AgCl)などとすることができる。
　電極として印刷電極を用いることもできる。これにより測定に必要な溶液量を低減することができる。電極は絶縁基板上に形成しうる。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成させ得る。絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられ、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いることができる。また、電極の基盤としてカーボンクロスやカーボンペーパー、バッキーペーパーを用いることもできる。作用極の面積は、所望の応答電流に応じて設定することができる。例えばある実施形態では、作用極の面積を1mm2以上、1.5mm2以上、2mm2以上、2.5mm2以上、3mm2以上、4mm2以上、5mm2以上、6mm2以上、7mm2以上、8mm2以上、9mm2以上、10mm2以上、12mm2以上、15mm2以上、20mm2以上、30mm2以上、40mm2以上、50mm2以上、1cm2以上、2cm2以上、3cm2以上、4cm2以上、5cm2以上、例えば10cm2以上とすることができる。ある実施形態では、作用極の面積を10cm2以下、5cm2以下、例えば1cm2以下、とすることができる。対極も同様でありうる。また、作用極上にカーボンナノチューブやグラフェン、ケッチェンブラック等を固定化し、みかけの表面積を大きくすることも出来る。この場合、見かけの面積は10倍以上、50倍以上、100倍以上、1000倍以上増え得る。
　ある実施形態において、本開示はグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤のスクリーニング方法を提供する。この方法は、
i)　グルコースデヒドロゲナーゼを用意する工程、
ii)　該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）を決定する工程、
iii)　前記i)のグルコースデヒドロゲナーゼと候補物質とを接触させ、その後、候補物質の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）を決定する工程、
iv)　前記ii)における比（Mal/Glu）と、iii)における候補物質の存在下での比（Mal/Glu）とを比較する工程、及び
v) 前記ii)における比（Mal/Glu）よりも、iii)における候補物質の存在下での比（Mal/Glu）が改変されている場合には、当該候補物質を、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤とする工程を含む。候補物質は、グルコースのアナログである低分子化合物であり得る。
　ある実施形態において、本開示はグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の有効濃度を確認する方法を提供する。この方法は、
i)　グルコースデヒドロゲナーゼ並びに第１濃度、第２濃度、・・・第n濃度のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を用意する工程（nは自然数）、
ii)　前記第１濃度、第２濃度、・・・及び第n濃度のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤存在下での、グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）をそれぞれ決定する工程、
iii)　各濃度における比（Mal/Glu）を比較し、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の有効濃度を確認する工程、
を含む。例えばある実施形態において、特定の濃度nにおける比Mal/Gluが、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を添加しない場合の比Mal/Gluと実質的に同じであれば、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の有効濃度の下限値は、前記特定の濃度nとするか、それよりも高く設定しうる。ある実施形態において、特定の濃度nにおける比Mal/Gluが、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を濃度n-1にて添加した場合の比Mal/Gluと実質的に同じであれば、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の有効濃度の上限値は、前記特定の濃度nとするか、それよりも低く設定しうる。ただし、濃度nは濃度n-1よりも高濃度とする。
　ある実施形態において本開示は、該スクリーニング方法により同定されたグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を、グルコース測定試薬又はグルコース測定組成物に配合することを含む、グルコース測定試薬又はグルコース測定組成物の製造方法を提供する。またある実施形態において本開示は、該スクリーニング方法により同定されたグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定試薬を提供する。
　グルコースデヒドロゲナーゼの、マルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）は、以下の手順で決定することができる。カーボン印刷電極にN-イソプロピル-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン(IPPD)を吸着固定し、グルコースデヒドロゲナーゼ、例えばムコール属由来のグルコースデヒドロゲナーゼ又はアスペルギルス属由来のグルコースデヒドロゲナーゼをグルタルアルデヒドにより、架橋固定する。作用電極、対極、参照極の3極電極を用いて、+250 mV(Ag/AgCl)の電位を印加し、クロノアンペロメトリを行う。このとき、電流値が十分に安定した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で終濃度1mMとなるようにマルトースを添加する（例えば測定開始から100秒後に添加）。次に、マルトース添加後、再度電流値が十分に安定した後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で終濃度1mMとなるようにグルコースを添加する（例えばマルトース添加から100秒後に添加）。グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性は、グルコースに対する反応性を１００％としたときのマルトースに対する反応性を測定することにより評価し得る。本明細書において、マルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比をMal/Gluと表記することがある。反応性を応答電流により評価する場合には、反応性の比を応答電流の比ということができる。
　例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の不在下において、あるグルコースデヒドロゲナーゼのMal/Gluが0.50%である場合、同じ測定条件で、ただしグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのMal/Gluが0.50%未満であれば、マルトースに対する反応性が低減しており、当該グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性が改変されたと言える。このようなグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、グルコース測定におけるマルトースの影響を低減させ得る。なお、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の不在下における、あるグルコースデヒドロゲナーゼのMal/Gluという相対値を100%と規定してもよい。この場合、同じ測定条件で、ただしグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのMal/Gluが100%未満であれば、マルトースに対する反応性が低減しており、当該グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性が改変された、と言える。また、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのMal/Gluが100%以上であれば、マルトースに対する反応性が増大しており、当該グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性が改変された、と言える。
　ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の不在下における、あるグルコースデヒドロゲナーゼのMal/Gluを100%とした場合、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのMal/Glu比は、99%以下、98%以下、97%以下、96%以下、95%以下、94%以下、93%以下、92%以下、91%以下、90%以下、89%以下、88%以下、87%以下、86%以下、85%以下、84%以下、83%以下、82%以下、81%以下、80%以下、79%以下、78%以下、77%以下、76%以下、75%以下、74%以下、73%以下、72%以下、71%以下、70%以下、69%以下、68%以下、67%以下、66%以下、65%以下、64%以下、63%以下、62%以下、61%以下、60%以下、59%以下、58%以下、57%以下、56%以下、55%以下、54%以下、53%以下、52%以下、51%以下、50%以下、49%以下、48%以下、47%以下、46%以下、45%以下、44%以下、43%以下、42%以下、41%以下、40%以下、39%以下、38%以下、37%以下、36%以下、35%以下、34%以下、33%以下、32%以下、31%以下、30%以下、29%以下、28%以下、27%以下、26%以下、25%以下、24%以下、23%以下、22%以下、21%以下、20%以下、19%以下、18%以下、17%以下、16%以下、15%以下、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、例えば1%以下、例えば実質的に0%、例えば0%、例えば99%～0%、99%～1%、98%～2％、97%～3%、96%～4％、95%～5%、94%～6%、93%～7%、92%～8%、91%～9%、90%～10%、89%～11%、88%～12%、87%～13%、86%～14%、85%～15%、84%～16%、83%～17％、82%～18%、81%～19%、80%～20%、79%～21%、78%～22%、77%～23%、76%～24%、75%～25%、74%～26％、73%～27%、72%～28%、71%～29%、70%～30%、69%～31%、68%～32%、67%～33%、66%～34%、65%～35%、64%～36%、63%～37%、62%～38%、61%～39%、60%～40%、59%～41%、58%～42%、57%～43%、56%～44%、55%～45%、54%～46%、53%～47%、52%～48%、51%～49%、例えば50%であり得る。
　ある実施形態において、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の不在下における、あるグルコースデヒドロゲナーゼのMal/Gluを100%とした場合、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのMal/Glu比は、110%以上、120%以上、130%以上、140%以上、150%以上、160%以上、170%以上、180%以上、190%以上、200%以上、220%以上、240%以上、260%以上、280%以上、300%以上、例えば110%～300%、120%～280%、130%～260%、140%～240%、150%～220%、160%～200%、例えば170%～190%であり得る。特に断らない限り、本開示における数値範囲は、上限値及び下限値も含むものとする（例えば数値範囲a～bは、a以上かつb以下を意味する）。また、本開示は、数値範囲について例示される上限値と下限値のあらゆる組み合わせを包含するものとする。
　特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤がGDHの基質特異性を改変しうるのは、次の作用機序によるものと考えられる。すなわち、グルコースデヒドロゲナーゼは、その基質ポケットによりグルコースを認識し作用することが知られているが、グルコースと類似する化学構造を有する化合物（グルコースアナログ）が、先に基質ポケットに入り、該基質ポケットにグルコース以外の夾雑糖、例えばマルトースが入るのを妨げるものと考えられる。なお、グルコースはC6化合物であり、グリセロールはC3化合物であるが、グリセロールはグルコースの一部分と構造が一致している、と見ることもでき、かつ、グリセロールについてもグルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する作用が見られたことから、グリセロールが基質ポケットに入っているか又は基質ポケットと相互作用しているものと考えられる。
　本開示によりグルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変することができる。また本開示は、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する他の方法と組み合わせることも可能である。例えば、基質特異性の高いグルコースデヒドロゲナーゼを探索し、見出した新たなグルコースデヒドロゲナーゼを、本開示のGDH基質特異性改変剤と組み合わせて用いることができる。また、例えば、GDHの基質特異性を改変し、改変されたGDH変異体を、本開示のGDH基質特異性改変剤と組み合わせて用いることができる。
　ある実施形態において、本開示のグルコース測定法に用いられるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、L-グロース、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、ソルビトール、リビトール、及びトレハロース、並びにD-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含んでもよく、グルコースデヒドロゲナーゼはムコール属由来のFAD-GDH、例えばMucor prainii由来GDH（MpGDH）であってもよく、該FAD-GDHは電極に固定化されていてもよく、又は固定化されていなくともよい。
　ある実施形態において、本開示のグルコース測定法に用いられるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、L-グロース、D-イジトール、D-グルカール、ソルビトール、リビトール、及びトレハロース、並びにD-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含んでもよく、グルコースデヒドロゲナーゼはムコール属由来のFAD-GDH、例えばMucor RD056860 GDH(MrdGDH)であってもよく、該FAD-GDHは電極に固定化されていてもよく、又は固定化されていなくともよい。
　ある実施形態において、本開示のグルコース測定法に用いられるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、L-グロース、D-イジトール、D-グルカール、リビトール、及びトレハロース、並びにD-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含んでもよく、グルコースデヒドロゲナーゼはアスペルギルス属由来のFAD-GDH、例えばアスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・テレウス由来FAD-GDH、若しくはGLD1であってもよく、該FAD-GDHは電極に固定化されていてもよく、又は固定化されていなくともよい。
　本開示の基質特異性改変剤を用いることにより、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変することができる。これによりグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料のグルコース濃度を測定するときに、マルトースによる影響を低減することができ、より正確なグルコース濃度測定が可能となる。これは糖尿病患者の血糖値管理などに有用であり得る。
（本開示の電極）
　ある実施形態において本開示は、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を含む電極を提供する。ある実施形態において電極はアノード電極であり得る。ある実施形態において、本開示のアノード電極はグルコースデヒドロゲナーゼを有する。ある実施形態においてグルコースデヒドロゲナーゼは電池の有する電極に固定化されていてもよい。ある実施形態において、本開示のアノード電極はカソード電極と抵抗を組み合わせて電池を提供することができる。ある実施形態において本開示は、前記の電池を用いる発電方法を提供する。別の実施形態では、本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を含む電池が提供される。
（本開示の燃料電池）
　ある実施形態において本開示は、燃料電池用のアノード又はカソード及び当該アノード又はカソードを備えた燃料電池を提供する。この燃料電池は本開示のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を含む。ある実施形態において本開示は、前記のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を含む電池を使用した発電方法、並びに、グルコースデヒドロゲナーゼをアノード電極に固定化し、グルコースデヒドロゲナーゼに対応した基質、例えばグルコースを燃料とし、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の存在下で発電を行う方法を提供する。
　ある実施形態において、本開示の燃料電池は、前記のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤、アノード又はカソード、燃料槽、カソード、グルコースデヒドロゲナーゼを有するアノード、及び電解質を備えている。アノード又はカソードには、人工電子メディエータを吸着させてもよい。人工電子メディエータとしては上記に記載の公知のメディエータや、特許第6484741号及び特許6484742号に記載のフェニレンジアミン系化合物が挙げられるがこれに限らない。また本開示の燃料電池は、必要に応じて、アノードとカソードとの間に負荷抵抗を配置することができ、そのための配線を備えうる。ある実施形態において負荷抵抗は、本開示の燃料電池の一部である。ある実施形態において、負荷抵抗は、本開示の燃料電池の一部ではなく、本開示の燃料電池は、適当な負荷抵抗に接続できるよう構成されている。本開示の燃料電池において酸化還元酵素（GDH）はアノードの一部を構成する。例えば酸化還元酵素はアノードに近接若しくは接触していてもよく、固定化されていてもよく、又は吸着していてもよい。燃料槽は電極に固定化された酸化還元酵素の基質となる化合物を含む。例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを電極に固定化した場合、燃料はグルコースであり得る。ある実施形態において本開示の燃料電池はアノードとカソードを分離するイオン交換膜を有し得る。イオン交換膜は1nm～20nmの孔を有し得る。アノードは炭素電極のような一般的な電極であり得る。例えば、カーボンブラック、グラファイト、活性炭等の導電性炭素質からなる電極や、金、白金等の金属からなる電極を用いることができる。具体的には、カーボンペーパー、カーボンクロス、グラッシーカーボン、カーボンナノチューブ、HOPG（高配向性熱分解グラファイト）等が挙げられる。対をなすカソードとしては、例えば、白金や白金合金等、燃料電池において一般的に用いられている電極触媒を、カーボンブラック、グラファイト、活性炭のような炭素質材料、又は金、白金等からなる導電体に担持させた電極や、白金や白金合金等の電極触媒そのものからなる導電体をカソード電極として用い、酸化剤（カソード側基質、酸素等）を電極触媒に供給するような形態とすることができる。
　別の実施形態では、上記のような基質酸化型酵素電極からなるアノードと対をなすカソードとして、基質還元型酵素電極を使用しうる。酸化剤を還元する酸化還元酵素としては、ラッカーゼやビリルビンオキシターゼなど公知の酵素が挙げられる。酸化剤を還元する触媒として酸化還元酵素を用いる場合には、必要に応じて、公知の電子伝達メディエータを用いてもよい。酸化剤としては、酸素等が挙げられる。
　ある実施形態において、カソードにおける電極反応を妨害する不純物（アスコルビン酸や尿酸等）による影響を回避するために、酸素選択性の膜（例えばジメチルポリシロキサンの膜）をカソード電極の周囲に配置することができる。
　本開示の発電方法は、酸化還元酵素を有するアノードに燃料となる酸化還元酵素の基質となる化合物を供給する工程を含む。酸化還元酵素を有するアノードに燃料が供給されると、基質が酸化され、同時に生成した電子を、酸化還元酵素は、該酸化酵素と電極との間の電子伝達を仲介する電子伝達メディエータ、例えばフェニレンジアミン系化合物へと受け渡し、該電子伝達メディエータによって導電性基材（アノード電極）へ電子が受け渡される。アノード電極から配線（外部回路）を通って電子がカソード電極に到達することで、電流が発生する。
　上記過程において発生するプロトン(H+)は、電解質溶液内をカソード電極まで移動する。そして、カソード電極では、電解質溶液内をアノードから移動してきたプロトンと、外部回路を経てアノード側から移動してきた電子と、酸素や過酸化水素等の酸化剤（カソード側基質）とが反応して水が生成される。これを利用し発電を行うことができる。
　ある実施形態において、アノードの燃料として生体内のグルコースを用いることができる。この場合、生体内のマルトースと反応してしまうと想定以上の電流が流れることもありえ、電流を制御するためにはグルコースのみに作用する基質特異性がグルコースデヒドロゲナーゼに求められると考えられる。本開示の基質特異性改変剤はこのような用途にも利用することができる。
　本開示のいくつかの説明では、グルコースデヒドロゲナーゼの、マルトースに対する反応性とグルコースに対する反応性との比（Mal/Glu）を「改変する」ことができる、と表現した。ここでいう「改変」は、「増大」及び「低減」を包含しうる。例えばグルコース濃度を測定するに当たりマルトースの影響を低減したい場合は、比（Mal/Glu）を低減することが好ましい。また、例えばグルコースとマルトースの混合物を燃料とする燃料電池にグルコースデヒドロゲナーゼを用いる場合、より高い電流値を得るために、比（Mal/Glu）を増大させることが好ましい。したがって、ある実施形態において本開示は、グルコースデヒドロゲナーゼの比（Mal/Glu）を低減する方法のみならず、比（Mal/Glu）を増大させる方法、及びそのための基質特異性改変剤を提供する。これらの実施形態では、各説明における「改変」を「低減」又は「増大」と読み替えるものとする。本開示によれば、グルコースデヒドロゲナーゼを遺伝子操作により改変することなく、上記の基質特異性改変剤を用いて、GDHの基質特異性を、用途に応じて変化させることができる。
　ある実施形態において、本開示はグルコースアナログであり低分子化合物であるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を用いることにより、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法を提供する。別の実施形態において、本開示は、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変するための、グルコースアナログであり低分子化合物であるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤の使用を提供する。別の実施形態において、本開示は、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性の改変に使用するための、グルコースアナログであり低分子化合物であるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を提供する。ある実施形態において本開示の方法は医療行為を含まない。
　以下の実施例により、本発明をさらに例証する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
[実施例１]Mucor属由来GDH遺伝子の宿主への導入とGDH活性の確認
　特許第4648993号に記載のMucor属由来GDH(MpGDH)のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に示す。特開2013-176363号の開示を参考に、配列番号３のアミノ酸配列を有するMrdGDHをコードする塩基配列を全合成した（配列番号４）。プラスミドpUC19のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるMpGDH遺伝子又はMrdGDH遺伝子を常法により挿入させたDNAコンストラクトを作製した。具体的には、pUC19は、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック社）に付属されているpUC19 linearized Vectorを用いた。pUC19のマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH遺伝子又はMrdGDH遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド(pUC19-MpGDH、pUC19-MrdGDH)を得た。
　これらの遺伝子をコウジカビ（Aspergillus sojae；アスペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのGDH活性を評価した。
　具体的には、MpGDH又はMrdGDHを取得することを目的として、GDH遺伝子を用いて、Double-joint PCR(Fungal Genetics and Biology, 2004年, 第41巻, p. 973-981）を行い、5’アーム領域－pyrG遺伝子－TEF1プロモーター遺伝子－フラビン結合型GDH遺伝子－3’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株由来pyrG破壊株（pyrG遺伝子の上流48bp、コード領域896bp、下流240bp欠損株）の形質転換に用いた。なお、pyrG遺伝子はウラシル栄養要求性マーカーである。500ml容三角フラスコ中の20mMウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地100mlに、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株由来pyrG破壊株の分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgの対象遺伝子挿入DNAコンストラクトを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで0.5%(w/v)寒天及び1.2Mソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地（ディフコ社；pH6）を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。
　得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるpyrGが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。得られた菌株の中から目的の形質転換体を、PCRで確認して選抜した。
　MpGDH又はMrdGDHの遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いて、それぞれのGDH生産を行った。
　200ml容三角フラスコ中のDPY液体培地(1%(w/v)ポリペプトン、2%(w/v)デキストリン、0.5%(w/v)酵母エキス、0.5%(w/v)KH2PO4、0.05%(w/v)MgSO4・7H20；pH未調整）40mlに、各菌株の分生子を接種し、30℃で4日間、160rpmで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をろ過し、得られた培地上清画分をAmicon Ultra-15, 30K NMWL（ミリポア社製）で10mLまで濃縮・脱塩し、150mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)に置換した。続いて、150mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pg（GEヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、GDH活性を示す画分を回収し、MpGDHの精製標品を得た。同様にしてMrdGDHの精製標品を得た。なお、これらの酵素はそのFAD結合部位を介してFADと結合している状態のものである（ホロ酵素）。
[実施例２]固定化酵素を用いた際の基質特異性改変剤の効果
　12mg/mlのMpGDH精製標品を10μL、15mMの各グルコースアナログを10μL、20mM リン酸K緩衝液を10μL混合し、2時間以上静置した。SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens社製、製品番号DRP-C110)上に、N-イソプロピル-N'-フェニル-p-フェニレンジアミン(IPPD)を吸着固定させ、各MpGDHを12μg分を塗布し、室温乾燥させた。最後に、25%のグルタルアルデヒド蒸気中に電極を入れ、得られた電極を純粋で洗浄し、IPPD・MpGDH固定化電極とした。次に、専用コネクター（DRP-CAC)を用いてALS 電気化学アナライザー 814Dに接続し、PBS中にIPPD・GDH固定化電極とAg/AgCl参照極、白金対極を浸漬させ、クロノアンペロメトリ測定を行った。印加電圧は+250mV(Ag/AgCl)とした。このとき、電流値が十分に安定した後(測定開始から約100秒後)、PBS中で終濃度1mMとなるようにマルトースを添加した。次に、マルトース溶液添加後、再度電流値が十分に安定した後（マルトース添加から約100秒後）、終濃度1mMとなるようにグルコース溶液を添加した。マルトース添加前後の応答電流の差異をマルトースの応答電流値と記録し、グルコース添加前後の応答電流の差異をグルコースの応答電流値と記録した。マルトースの応答電流値をグルコースの応答電流値で割った値をマルトース/グルコース(%)として算出した。結果を表１に示す。ソルビトール、リビトール、L-グロース、D-イジトールは基質特異性を改変させた。さらに基質特異性改変剤を添加しなかったMpGDHのマルトース/グルコースを100%とした場合、D-グルカールを添加した場合は69%となり基質特異性を改変させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　同様にして、Glucose Dehydrogenase(FAD-dependent)(BBI社製、Product Code:GLD1、以下GLD1と表記する）を用いて、基質特異性改変剤の効果を検証した。結果を表２に示す。L-グロース、D-イジトール、L－イジトール、トレハロース、D-グルカールは基質特異性を改変させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　同様にして、MrdGDHを用いて、基質特異性改変剤の効果を検証した。結果を表３に示す。ソルビトール、D-イジトール、トレハロース、D-グルカールは基質特異性を改変させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
[実施例３]固定化していない酵素を用いた際の基質特異性改変剤の効果
　12mg/mlのMpGDH精製標品を10μL、15mMの各グルコースアナログを10μL、20mM リン酸K緩衝液を10μL混合し、2時間以上静置した。SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens社製、製品番号DRP-C110)上に、PBSを80μL、各MpGDH溶液を5μL、2mg/mlのmPMS溶液を10μL塗布・混合させた。印加電圧は+100mV(Ag/Ag+)とし、クロノアンペロメトリ測定を行った。電流値が十分に安定した後(測定開始から約100秒後)、終濃度5mMとなるようにマルトース溶液を添加し、ピペッティングにより混合した。電流値が十分に安定したところで測定を止め、マルトース添加前後の差異をマルトースの応答電流値とした。なお、マルトース溶液の代わりに純水を等量添加したところ、応答電流の増加は見られなかった。使用した印刷電極を超純水で十分に洗浄し、乾燥させ、上記と同様にクロノアンペロメトリ測定を行った。マルトース溶液の代わりにグルコース溶液を添加し、グルコースの応答電流値を計測した。マルトースの応答電流値をグルコースの応答電流値で割った値をマルトース/グルコース(%)として算出した。MpGDHのマルトース/グルコースを100%とした場合、ソルビトールを添加した場合は67%となり、リビトールを添加した場合は58%となり、L-グロースを添加した場合は56%となり、D-イジトールを添加した場合は84%となり、L-イジトールを添加した場合は68%となり、トレハロースを添加した場合は72%となり基質特異性を改変させた。酵素を固定化しない場合には、L-イジトールは基質特異性改変剤として働くことが分かった。
　同様にして、GLD1を用いて、基質特異性改変剤の効果を検証した。結果を表４に示す。リビトール、L-グロース、L－イジトール、トレハロース、D-グルカールは基質特異性を改変させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　同様にして、MrdGDHを用いて、基質特異性改変剤の効果を検証した。結果を表５に示す。ソルビトール、リビトール、L-グロース、D-イジトール、トレハロースは基質特異性を改変させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
[実施例４]カーボンクロス電極を用いた際の基質特異性改変剤の効果
　80μlのN’N-ジフェニル-p-フェニレンジアミン(DPPD)を吸着固定した多層カーボンナノチューブ溶液(1.4 wt%、MWCNT溶液)を、5 mm角のカーボンクロス(東陽テクニカ社製)へ複数回に分けて塗布した。これを十分に乾燥させた後、超純水を用いて洗浄を行った。続いて、40 mg/ml野生型MpGDHと、超純水に溶解した100 mM各種グルコースアナログ20μlを等量混合した溶液を、MWCNT/DPPD固定化電極に20μl塗布し、室温で乾燥させた後、25%グルタルアルデヒド蒸気中に20分間入れることでMpGDHを架橋固定した。その後、上記と同様に超純水で洗浄を行い、MWCNT/DPPD/MpGDH固定化電極とした。次に、これをALS電気化学アナライザー814Dに接続し、PBS中にMWCNT/DPPD/MpGDH固定化電極、Ag/AgCl参照極、及び白金対極を浸漬させ、クロノアンペロメトリ測定を行った。印加電圧は+250 mV (Ag/AgCl)とした。この時、電流値が十分に安定した後(測定開始から約100秒後)、PBS中で終濃度1 mMとなるようにマルトースを添加した。次に、マルトース溶液添加後、再度電流値が十分に安定した後(マルトース添加から約50秒後)、終濃度1 mMとなるようにグルコース溶液を添加した。マルトース添加前後の応答電流の差異をマルトースの応答電流値として記録し、グルコース添加前後の応答電流の差異をグルコースの応答電流値として記録した。マルトースの応答電流値をグルコースの応答電流値で割った値をマルトース/グルコース(%)として算出した。これらの結果を下記の表に示す。L-グロース、L-イジトール、D-マンニトール、グリセロール、及びキシリトールはGDHの基質特異性を改変させた。また電極の形状に関わらず、各種グルコースアナログはGDHの基質特異性を改変できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
[実施例５]カーボンクロス電極における、基質特異性改変剤の組み合わせによる効果
　実施例４と同様に、MWCNT/DPPD/MpGDH固定化電極を作製した。ただし、40 mg/ml 野生型MpGDH 20μlと、超純水に溶解した100 mM グリセロール及び100 mM L-イジトールをそれぞれ10 μl混合した溶液を、MWCNT/DPPD固定化電極に20 μl塗布する工程のみ変えて作製した。その後、実施例４に記載の方法でクロノアンペロメトリ測定を行い、マルトース/グルコース (%)を算出した。その結果、基質特異性改変剤を添加しなかったMpGDHのマルトース/グルコース応答電流比を100%とした場合、グリセロールとL-イジトールを共に添加した場合は8%となり基質特異性を改変させた。したがって、25 mMのL-イジトールおよびグリセロールを共に添加した場合、50 mMの各物質を単独で用いた場合と比較して、基質特異性改変効果が大きく、異なるグルコースアナログを組み合わせることで基質特異性改変効果は相乗的に改変できることが分かった。
[実施例６]燃料電池の構築
　実施例４で作製した、精製GDHとD-マンニトールを含む溶液を用いたカーボンクロス電極をアノード電極とした。ただしこの時、メディエータとしてDPPDの代わりにIPPDを用いた。また、多層カーボンナノチューブ溶液(1.4 wt%、MWCNT溶液)を吸着させたカーボンクロスに、10mg/mlのビリルビンオキシダーゼ（BOD、シグマ社製）を吸着固定することでカソード電極を作製した。アノード電極とカソード電極を結ぶ配線の間に、可変抵抗を接続し、さらにALS 電気化学アナライザー 814D接続した。燃料槽は、PBS (pH 7.4) と200 mM D-グルコースを含む電解質溶液を用い、上記のアノード電極とカソード電極を浸漬させた。室温にてポテンショスタットのテクニックであるオープンサーキットポテンシャルを利用して測定した。その結果、10 kΩ接続時に0.125 mA/cm2の電流値を得た。
　特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本開示の燃料電池について以下のように考察される。すなわち、実施例４において各種グルコースアナログの存在下GDHを固定化した電極を用いることで、高い基質特異性をもってグルコースと反応することができた。したがって例えば本開示のアノード電極を用いた燃料電池であれば、マルトースとグルコースが共存するような生体内の成分を燃料とする場合、例えば食事や輸液などを摂取し、一時的にマルトース濃度が上昇した際においた場合においても、一定の電流を流すことを可能とすることが期待される。基質特異性を改変するために、遺伝子操作を経て酵素を改変することがあり得るが、時間がかかり煩雑である。本開示によれば、用途に合わせてGDHの基質特異性を改変することができる。これは種々の用途において有利となる。
　本開示により、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変することができる。これによりグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料のグルコース濃度を測定するときに、マルトースによる影響を低減することができ、より正確なグルコース濃度測定が可能となる。これは糖尿病患者の血糖値管理などに有用であり得る。また、マルトースへの反応性を増大させるようにグルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変すれば、グルコースとマルトースの混合物を燃料に含めた燃料電池を用いるときに、より高い電流値を得ることが可能となる。
　本明細書において言及された文献はいずれも、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
配列の簡単な説明
配列番号１　Mucor prainii由来GDH（MpGDH） aa
配列番号２　MpGDH遺伝子DNA
配列番号３　Mucor RD056860 GDH(MrdGDH) aa
配列番号４　MrdGDH遺伝子DNA

Claims (20)

  1. 　グルコースアナログであり低分子化合物であるグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を用いることにより、グルコースデヒドロゲナーゼの基質特異性を改変する方法であって、FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を用いてグルコース測定を行うときに、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤とグルコースデヒドロゲナーゼとを共存させることを含み、該改変剤の不在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）と比較して、該改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）が改変される、前記方法。
  2. 　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤がソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、トレハロース、D-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　グルコースデヒドロゲナーゼがムコール属又はアスペルギルス属由来のグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　グルコースデヒドロゲナーゼが固相表面に固定化されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　グルコースデヒドロゲナーゼが固相表面に固定化されていない、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤であって、該改変剤はグルコースのアナログである低分子化合物であり、該改変剤の不在下でのFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）のマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）と比較して、該改変剤の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）が改変される、前記グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤。
  7. 　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤がソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、トレハロース、D-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、請求項６に記載の改変剤。
  8. 　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤がソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、D-マンニトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、請求項６に記載の改変剤。
  9. 　グルコースデヒドロゲナーゼがムコール属又はアスペルギルス属由来のグルコースデヒドロゲナーゼである、請求項６～８のいずれか１項に記載の改変剤。
  10. 　請求項６～９のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及び固相表面に固定化されたグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用システム。
  11. 　請求項６～９のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及び固相表面に固定化されていないグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用システム。
  12. 　請求項６～９のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用組成物又はグルコース測定試薬。
  13. 　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤と、グルコースデヒドロゲナーゼとを、個別の試薬として含む、請求項１２に記載のグルコース測定用組成物又はグルコース測定試薬。
  14. 　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤と、グルコースデヒドロゲナーゼとを、同一試薬中に含む、請求項１２に記載のグルコース測定用組成物又はグルコース測定試薬。
  15. 　請求項６～９のいずれか１項に記載の改変剤又は請求項１０若しくは１１に記載のシステム、又は請求項１２～１４のいずれか１項に記載の組成物若しくは試薬を用いた、グルコース測定方法。
  16. 　以下の工程を含む、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤のスクリーニング方法、
    i)　グルコースデヒドロゲナーゼを用意する工程、
    ii)　該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）を決定する工程、
    iii)　前記i)のグルコースデヒドロゲナーゼとグルコースのアナログである低分子化合物である候補物質とを接触させ、その後、候補物質の存在下での該グルコースデヒドロゲナーゼのマルトースに対する反応性（Mal）とグルコースに対する反応性（Glu）の比（Mal/Glu）を決定する工程、
    iv)　前記ii)における比（Mal/Glu）と、iii)における候補物質の存在下での比（Mal/Glu）とを比較する工程、及び
    v) 前記ii)における比（Mal/Glu）よりも、iii)における候補物質の存在下での比（Mal/Glu）が改変されている場合には、当該候補物質を、グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤とする工程。
  17. 　請求項１６に記載の方法により同定されたグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤を、グルコース測定試薬又はグルコース測定組成物に配合することを含む、グルコース測定試薬又はグルコース測定組成物の製造方法。
  18. 　請求項１６に記載の方法により同定されたグルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定試薬。
  19. 　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含む電極、ここで前記グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、ソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、トレハロース、D-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、前記電極。
  20. 　グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤及びFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（FAD-GDH）を含む電池、ここで前記グルコースデヒドロゲナーゼ基質特異性改変剤は、ソルビトール、D-イジトール、L-イジトール、D-グルカール、リビトール、L-グロース、トレハロース、D-マンニトール、キシリトール、及びグリセロールからなる群より選択される１以上の化合物を含む、前記電池。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606210A (zh) * 2022-03-17 2022-06-10 苏州中星医疗技术有限公司 葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013224971A (ja) * 2006-04-19 2013-10-31 Panasonic Corp バイオセンサ
JP2014018096A (ja) * 2012-07-13 2014-02-03 Kikkoman Corp フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法
WO2015060150A1 (ja) * 2013-10-21 2015-04-30 東洋紡株式会社 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ
JP2015139376A (ja) * 2014-01-27 2015-08-03 東洋紡株式会社 グルコースデヒドロゲナーゼ組成物
WO2017195765A1 (ja) * 2016-05-09 2017-11-16 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP2018068287A (ja) * 2016-10-20 2018-05-10 キッコーマン株式会社 フラビン化合物を用いたグルコース酸化還元反応及びグルコース測定用組成物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001025776A (ja) 1999-07-13 2001-01-30 Toyobo Co Ltd 感光性樹脂版の廃液処理方法
JP2005054840A (ja) 2003-07-31 2005-03-03 Tokai Rubber Ind Ltd 車高調整機能付ショックアブソーバ
JP4458802B2 (ja) 2003-10-02 2010-04-28 パナソニック株式会社 血液中のグルコースの測定方法およびそれに用いるセンサ
JP2008154573A (ja) 2006-03-31 2008-07-10 Toyobo Co Ltd 可溶性グルコースデヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）を含む組成物の安定性を向上する方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013224971A (ja) * 2006-04-19 2013-10-31 Panasonic Corp バイオセンサ
JP2014018096A (ja) * 2012-07-13 2014-02-03 Kikkoman Corp フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼを含む組成物の安定性を向上する方法
WO2015060150A1 (ja) * 2013-10-21 2015-04-30 東洋紡株式会社 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ
JP2015139376A (ja) * 2014-01-27 2015-08-03 東洋紡株式会社 グルコースデヒドロゲナーゼ組成物
WO2017195765A1 (ja) * 2016-05-09 2017-11-16 キッコーマン株式会社 フラビン結合型グルコースデヒドロゲナーゼ改変体
JP2018068287A (ja) * 2016-10-20 2018-05-10 キッコーマン株式会社 フラビン化合物を用いたグルコース酸化還元反応及びグルコース測定用組成物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606210A (zh) * 2022-03-17 2022-06-10 苏州中星医疗技术有限公司 葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法

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