CN114606210A - 葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法,该制备方法包括如下步骤:A)、葡萄糖脱氢酶的去辅基化和修饰;B)、葡萄糖脱氢酶的重组。本申请通过对葡萄糖脱氢酶进行精确的修饰,从葡萄糖脱氢酶的活性中心到其表面构建了一条电子传递通道,实现了葡萄糖脱氢酶的直接电化学,进而从根本上消除了氧气对葡萄糖检测的制约,提高了葡萄糖动态检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法。
背景技术
糖尿病是威胁人类健康和生命的三大顽症之一,其典型临床症状是患者体内血糖过高,长期的高血糖会引起各种并发症,甚至威胁到患者生命。虽然目前尚无根治糖尿病的方法,但是尽可能地把血糖控制在正常范围以内,可以非常有效地减少和延缓糖尿病并发症的出现。因此,对于糖尿病患者而言,血糖的监测和调控就成了生活的一部分。近年来出现的植入式葡萄糖持续监测系统为成千上万的糖尿病患者提供了一个全方位调控血糖的工具。
现有的植入式葡萄糖持续监测系统的工作原理均是利用葡萄糖氧化酶的高选择性和高效催化性能,通过电化学方法对葡萄糖进行监测。它们或者存在“氧匮乏”的问题,例如依赖组织液的氧气来实现对葡萄糖的监测(如美敦力的Guardian和德康的Dexcom G5和6);或者有潜在的氧气干扰问题(如雅培的Libre和libre 2)。因为氧气作为葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖的自然媒介体,不可避免地参与葡萄糖的催化氧化。为了最大限度地消除氧气的干扰,人们不得不通过各种算法进行校正和引入各种可以有效地拟制氧气通过的生物相容性膜。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明在于提供葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法,由该制备方法所制备的葡萄糖脱氢酶可以与电极进行直接的电子交换,进而从根本上消除了氧气对葡萄糖检测的制约。
为实现上述目的,本发明提供了如下技术方案:葡萄糖脱氢酶的制备方法,包括如下步骤:
A)、葡萄糖脱氢酶的去辅基化和修饰:
A1)、将葡萄糖脱氢酶溶于含有溴化钾的缓冲溶液中,并将缓冲溶液倒入透析袋中透析;
A2)、然后,在磷酸缓冲溶液中再次透析,得到去辅基化的葡萄糖脱氢酶;
A3)、对步骤A2)得到的去辅基化的葡萄糖脱氢酶进行化学修饰,得到经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶;
B)、葡萄糖脱氢酶的重组:
B1)、将带有羧基的氧化石墨烯、N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸、碳化二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺进行混合反应;
B2)、反应结束后,对步骤B1)得到的反应液进行离心分离,离心结束后,进行清洗纯化,得到带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯;
B3)、将所述经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶、所述带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯和氯化钙进行混合反应;
B4)、反应结束后,加入硼氢化钠,继续反应;
B5)、反应结束后,进行离心分离,并对得到的葡萄糖脱氢酶进行清洗和分离,得到重组后的葡萄糖脱氢酶。
作为优选,在步骤A1)中,溴化钾的浓度为1~4.5mol/L。
作为优选,在步骤B1)中,所述带有羧基的氧化石墨烯、所述N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸、所述碳化二亚胺以及所述N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为(0.5~5):(0.06~0.15):(0.02~0.12):(0.012~0.03)。
作为优选,在步骤B)中,所述经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶、所述带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯、所述氯化钙以及所述硼氢化钠的重量比为(0.1~5):(0.2~5):(0.1~1):(0.1~5)。
上述所述的葡萄糖脱氢酶的制备方法所制备的葡萄糖脱氢酶。
葡萄糖传感器,由以下方法制备:
1)、将上述所述的葡萄糖脱氢酶与化学交联剂进行混合40~100分钟后,然后将化学交联后的葡萄糖脱氢酶涂布在电极的表面,得到葡萄糖传感膜;
2)、将生物相容性膜溶液涂布在所述葡萄糖传感膜上,并进行干燥。
作为优选,所述葡萄糖脱氢酶和所述化学交联剂的重量比为(0.6~1.8):(0.0001~0.01)。
作为优选,所述化学交联剂包括戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚(二甲基硅氧烷)-二缩水甘油醚、四环氧丙基-4,4-二氨基二苯甲烷、聚乙二醇二縮水甘油醚或4-(2,3-环氧丙氧基)-N,N-二(2,3-环氧丙基)苯胺。
作为优选,在步骤2)中,干燥温度为22~30℃,干燥时间为30~100分钟,相对湿度为50~80%。
作为优选,所述生物相容性膜溶液以旋转镀膜法涂布在所述葡萄糖传感膜上。
综上所述,本发明具有以下有益效果:
1、本申请通过对葡萄糖脱氢酶进行精确的修饰,从葡萄糖脱氢酶的活性中心到其表面构建了一条电子传递通道,实现了葡萄糖脱氢酶的直接电化学,进而从根本上消除了氧气对葡萄糖检测的制约,提高了葡萄糖动态检测的准确性;
2、本申请利用修饰后的葡萄糖脱氢酶和纳米材料制备出的葡萄糖传感器,可以实现在非常低的电位(10~100毫伏)下对葡萄糖进行监测。
附说明
图1为含有石墨烯偶联的化学修饰后的葡萄糖脱氢酶的葡萄糖生物传感器的结构示意图;
图2为处理后的葡萄糖脱氢酶经过戊二醛交联以后的循环伏安图(曲线a)和加入5mmol/L葡萄糖后的循环伏安图(曲线b);
图3a为葡萄糖生物传感膜的葡萄糖浓度-电流曲线图;
图3b为葡萄糖生物传感膜在8mmol/L葡萄糖溶液中的稳定性测试图;
图4为葡萄糖生物传感器的结构示意图;
图5a为覆盖有生物相容性膜的葡萄糖生物传感器的葡萄糖浓度-电流曲线图;
图5b为覆盖有生物相容性膜的葡萄糖生物传感器在15mmol/L葡萄糖溶液中的稳定性测试图;
图6为覆盖有生物相容性膜的葡萄糖生物传感器在含有10mmol/L葡萄糖的PBS缓冲溶液的抗干扰性能测试图。
具体实施方式
参照附对本发明做进一步说明。
为了从根本上消除氧气对葡萄糖检测的制约,提高葡萄糖动态检测的准确性,我们最近成功地研制出了可以与电极进行直接的电子交换的葡萄糖脱氢酶。如图1所示,通过对葡萄糖脱氢酶进行精确的修饰,从葡萄糖脱氢酶的活性中心到其表面构建了一条电子传递通道,实现了葡萄糖脱氢酶的直接电化学。
利用修饰过的葡萄糖脱氢酶和纳米材料制备出的葡萄糖生物传感器,可以实现在非常低的电位(10~100毫伏)下对葡萄糖进行监测。更重要的是,葡萄糖脱氢酶催化氧化葡萄糖是无需氧气参与的,这就从根本上解决了植入式持续葡萄糖监测系统中氧气的问题;同时,还大大地简化了它对选择性滲透膜的要求,这个选择性滲透膜除了有高度的生物相容性之外,只需要能够有效地调控葡萄糖即可。
为实现上述目的,一方面,本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法,包括如下步骤:
A)、葡萄糖脱氢酶的去辅基化和修饰:
A1)、将葡萄糖脱氢酶溶于含有溴化钾的0.1mol/L且pH为4.5的醋酸缓冲溶液中,并将缓冲溶液倒入透析袋中透析80~120小时,切割分子量为5000~30000,优选的,切割分子量为10000;其中,溴化钾的浓度为1~4.5mol/L,透析温度为1~10℃;
A2)、然后,在0.005~0.1mol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液中再次透析36~60小时,得到去辅基化的葡萄糖脱氢酶;
A3)、对步骤A2)得到的去辅基化的葡萄糖脱氢酶进行化学修饰,得到经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶;
B)、葡萄糖脱氢酶的重组:
B1)、将带有羧基的氧化石墨烯、N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸、碳化二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺加入至0.05mol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液中进行混合,并在摇床上反应36~72小时,反应温度为4~6℃;其中,带有羧基的氧化石墨烯、N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸、碳化二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为(0.5~5):(0.06~0.15):(0.02~0.12):(0.012~0.03);
B2)、反应结束后,对步骤B1)得到的反应液进行离心分离,并用0.05mol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液进行清洗纯化,得到带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯;
B3)、将经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶、带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯和氯化钙在pH为7.4的HEPES缓冲溶液中培养12~72小时,培养温度为4~6℃;
B4)、培养结束后,加入硼氢化钠,继续反应1~4小时;其中,经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶、带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯、氯化钙以及硼氢化钠的重量比为(0.1~5):(0.2~5):(0.1~1):(0.1~5);
B5)、反应结束后,离心分离,并用pH为7.4的HEPES缓冲溶液对培养后的葡萄糖脱氢酶进行多次清洗和离心分离,得到重组后的葡萄糖脱氢酶。
在上述的技术方案中,在步骤A3)中,去辅基化的葡萄糖脱氢酶在高浓度的尿素中将其打开,通过对其表面和内部的游离羧基进行化学修饰,将电化学性能优越的氧化还原小分子,例如钴-卟啉络合物、铁-卟啉络合物、钌-氨络合物、钴-络合物、铜-氨络合物、钌-联咪唑络合物、锇-联咪唑络合物、锇-联吡啶络合物等共价键合到葡萄糖脱氢酶上,建立起电子传递接力点,葡萄糖脱氢酶的催化活性中心就可以通过这些接力点将葡萄糖氧化产生的电子传递出来。去辅基化的葡萄糖脱氢酶的化学修饰的方法具体如下所述:
1)、将去辅基化的葡萄糖脱氢酶在含有的尿素的PBS缓冲溶液培养8~24小时,培养温度为4℃,得到葡萄糖脱氢酶一次培养液;
2)向葡萄糖脱氢酶一次培养液中加入带有游离氨基的钌或锇的络合物,使其与去辅基化的葡萄糖脱氢酶混合,同时依次加入碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行反应,反应温度为4~6℃,反应时间为8~24小时;去辅基化的葡萄糖脱氢酶、尿素、带有游离氨基的钌或锇的络合物、碳化二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为(0.5~5):(30~180):(0.1~3):(0.05~1):(0.005~0.2);
3)然后,利用超滤袋透析,对修饰过葡萄糖脱氢酶进行分离和提纯,切割分子量为1000~30000,优选的,切割分子量为10000,得到经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶。
另外,去辅基化的葡萄糖脱氢酶的化学修饰亦可参考中国专利CN113717955A。
另一方面,本发明还公开了葡萄糖传感器,由以下方法制备:
1)、将上述的经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶与化学交联剂加入至PBS缓冲溶液中进行混合40~100分钟后,然后将化学交联后的葡萄糖脱氢酶涂布在电极的表面,得到葡萄糖传感膜;其中,葡萄糖脱氢酶和化学交联剂的重量比为(0.6~1.8):(0.0001~0.01);
2)、将生物相容性膜溶液以旋转镀膜法涂布在葡萄糖传感膜上,并进行干燥,干燥温度为22~30℃,相对湿度为50~80%,干燥时间为30~100分钟。
在优选的实施方式中,化学交联剂包括戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚(二甲基硅氧烷)-二缩水甘油醚、四环氧丙基-4,4-二氨基二苯甲烷、聚乙二醇二縮水甘油醚或4-(2,3-环氧丙氧基)-N,N-二(2,3-环氧丙基)苯胺。
具体实施例:
实施例S1:
(1)、葡萄糖脱氢酶的去辅基化:
为了在葡萄糖脱氢酶内建立一条高效的电子通道,首先要对葡萄糖脱氢酶进行去辅基化。具体如下:将2g的葡萄糖脱氢酶溶于含有溴化钾的0.1mol/L的醋酸缓冲溶液中,并将醋酸缓冲溶液倒入透析袋中(切割分子量:10000)透析96小时,醋酸缓冲溶液pH为4.5,溴化钾的浓度为3mol/L,透析温度为4℃;然后,在0.05mol/L的磷酸缓冲溶液中再次透析48小时,磷酸缓冲溶液pH为7.0,得到去辅基化的葡萄糖脱氢酶。
(2)、葡萄糖脱氢酶的重组:
然后,将去辅基化的葡萄糖脱氢酶在高浓度的尿素中将其打开,通过对其表面和内部的游离羧基进行化学修饰,将电化学性能优越的氧化还原小分子,例如钌或锇的络合物等共价键合到葡萄糖脱氢酶上,建立起电子传递接力点,葡萄糖脱氢酶催化活性中心就可以通过这些接力点将葡萄糖氧化产生的电子传递出来,具体做法:将2g的去辅基化的葡萄糖脱氢酶在含有90g的尿素的PBS缓冲溶液中培养12小时,培养温度为4℃,得到葡萄糖脱氢酶一次培养液;然后,向葡萄糖脱氢酶一次培养液中加入1g的带有游离氨基的钌或锇的络合物,使其与去辅基化的葡萄糖脱氢酶混合,同时依次加入0.2g的碳化二亚胺和0.05g的N-羟基琥珀酰亚胺进行反应,反应温度为4℃,反应时间为12小时;然后,利用超滤袋透析(切割分子量:10000)对经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶进行分离和提纯。
同时,将2g的带有羧基的氧化石墨烯、100mg的N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸、50mg的碳化二亚胺和20mg的N-羟基琥珀酰亚胺加入至0.05mol/L的磷酸缓冲溶液中进行混合,并在摇床上反应48小时,磷酸缓冲溶液pH为7.0,反应温度为4℃;反应结束后,对得到的反应液进行离心分离,并用0.05mol/L的磷酸缓冲溶液进行清洗纯化,磷酸缓冲溶液pH为7.0,经过上述处理后,N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸通过氧化石墨烯上的羧基被偶联在氧化石墨烯上。
为了进一步提高葡萄糖脱氢酶与电极进行更为快速的电子交换,我们将提纯后的脱辅基的葡萄糖脱氢酶与带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯一起培养,把葡萄糖脱氢酶的黄素腺嘌呤二核苷酸辅基重新植入到去辅基的葡萄糖脱氢酶上,使其复原。具体做法:将2g的经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶、2g的带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯、0.4g的氯化钙在pH为7.4的HEPES缓冲溶液中培养24小时,培养温度为4℃;培养结束后,加入1g的硼氢化钠,,继续反应4小时,反应温度为4℃;反应结束后,离心分离,并用pH为7.4的HEPES缓冲溶液对培养后的葡萄糖脱氢酶进行多次清洗和离心分离,得到重组后的葡萄糖脱氢酶。
经过以上处理以后,葡萄糖脱氢酶从内到外已经被彻底的电化学活化,而且,在葡萄糖脱氢酶分子之间也形成一个高效的电子传递网络。另外,其它导电性好的纳米材料,如纳米导电玻璃材料(FTO、ITO、AZO)、金属纳米材料、导电高分子、纳米碳、纳米碳管、纳米黑磷等也可以用来与电化学活化后的葡萄糖脱氢酶分子之间建立高效的电子传递网络。
(3)、葡萄糖传感器的制备:
为了确保经过重组后的葡萄糖脱氢酶可以用于植入式葡萄糖传感器,我们将重组后的葡萄糖脱氢酶用双功能化学交联剂戊二醛进行化学交联,制备出稳定的生物传感膜。具体做法:将1g的重组后的葡萄糖脱氢酶在PBS缓冲溶液中与1mg的戊二醛溶液进行混合60分钟后,以滴落涂布法将化学交联后的葡萄糖脱氢酶涂布在电极的表面,得到葡萄糖传感膜。
然后,我们利用循环伏安法对含有重组后的葡萄糖脱氢酶的生物传感膜进行表征,如图2所示,图2曲线a上位于0伏左右的一对氧化还原峰清楚地表明,经过上述处理后,电化学性能优越的氧化还原小分子已经成功地偶联到了葡萄糖脱氢酶上。当在PBS缓冲溶液中加入5mmol/L的葡萄糖后,生物传感膜的循环伏安图清晰地展示了一个典型的电化学催化过程,如图2曲线b所示。与之相反,在没有上述处理的葡萄糖脱氢酶没有任何的电化学活性。
虽然,我们成功地对葡萄糖脱氢酶进行了电化学活化处理,并将其制成葡萄糖生物传感膜,可是要用于葡萄糖持续监测,特别是用于植入式葡萄糖持续监测系统的葡萄糖生物传感器,我们还要保证它有足够宽的线性响应范围和高度的稳定性,很可惜,这个葡萄糖传感膜的线性响应范围非常窄,只有0~4mmol/L,如图3a所示,而且其稳定性也不理想,如图3b所示,这些都可以通过在葡萄糖传感膜上覆盖并优化生物相容性膜来改善。
进一步的,我们将生物相容性膜溶液(参考中国专利:CN113325049A)在10万级的洁净室和含有饱和溶剂蒸汽的环境中,以旋转镀膜法均匀地涂布在葡萄糖传感膜上,制成葡萄糖传感器;然后,将葡萄糖传感器在严格控制的环境中进行干燥,干燥温度为25℃,相对湿度为60%,干燥时间为60分钟;待溶剂完全蒸发后,葡萄糖传感器的表面被一层薄薄的生物相容性膜完全覆盖,如图4所示。为了增加生物相容性膜的厚度,以上过程可以反复多次,通常2~8次(优选的:反复4次)便可达到所需要的厚度。由于该生物相容性膜是通过多次成膜过程而形成的,最终对葡萄糖的调控性能可以非常方便和有效地通过对膜的厚度(旋转镀膜次数)和生物相容性膜溶液的配方进行优化,从而达到预期的效果。
如图5a和图5b所示,虽然葡萄糖传感器对葡萄糖的响应时间从60秒被延长到了120秒,电流信号却被该生物相容性膜很好地调控了;而且,葡萄糖传感器的稳定性也得到了显著的改善。与此同时,葡萄糖的可监测范围从0~4mmol/L被大幅地拓展到了0~50mmol/L,完全满足了植入式葡萄糖持续监测系统的需要,如图5a所示。另外,葡萄糖传感器的稳定性也得到了显著的改善。例如,经过长达十天的连续测试中,电流信号只有不到2%的衰减,如图5b所示,相比之下,没有覆盖生物相容性膜的葡萄糖传感器的电流信号在12小时的连续测试中衰减了70%以上,如图3b所示。
如上所述,现有的植入式葡萄糖生物传感器都是在葡萄糖氧化酶的基础上制备的,在进行葡萄糖检测时,氧气就成了制约植入葡萄糖持续监测系统性能的一个主要因素。而我们这个葡萄糖生物传感器中的葡萄糖脱氢酶氧化葡萄糖时,不需要氧气的参与,实验结果也证实了氧气对葡萄糖的检测无任何干扰,如图6所示,当在含有10mmol/L的葡萄糖的PBS缓冲溶液中通入氧气时,和当溶液中的氧气被氩气完全除去后,覆盖有生物相容性膜的葡萄糖生物传感器的电流没有任何的衰减。另外,由于葡萄糖的检测是在非常低的电位下(10~100毫伏)进行的,对乙酰水杨酸和乙酰氨基酚的抗干扰能力得到了非常显著地改善。
实施例S2~S5和对比例S6:
工艺参数与S1相同,区别之处在于调整了溴化钾的浓度、带有羧基的氧化石墨烯的用量、N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的用量,具体如下表1所示:
表1
综上所述,在基于重组后的葡萄糖脱氢酶发展起来的葡萄糖生物传感器完全克服了氧气对葡萄糖检测的制约,当覆盖一层生物相容性膜时,可以非常简单、有效和精确地对葡萄糖进行调控;更重要的是,该生物相容性膜显著地拓展了葡萄糖的可监测范围,并大大地提高了葡萄糖传感器的稳定性,且简化了生产工艺,为免校正植入式持续葡萄糖监测系统的批量生产打下了基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.葡萄糖脱氢酶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
A)、葡萄糖脱氢酶的去辅基化和修饰:
A1)、将葡萄糖脱氢酶溶于含有溴化钾的缓冲溶液中,并将缓冲溶液倒入透析袋中透析;
A2)、然后,在磷酸缓冲溶液中再次透析,得到去辅基化的葡萄糖脱氢酶;
A3)、对步骤A2)得到的去辅基化的葡萄糖脱氢酶进行化学修饰,得到经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶;
B)、葡萄糖脱氢酶的重组:
B1)、将带有羧基的氧化石墨烯、N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸、碳化二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺进行混合反应;
B2)、反应结束后,对步骤B1)得到的反应液进行离心分离,离心结束后,进行清洗纯化,得到带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯;
B3)、将所述经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶、所述带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯和氯化钙进行混合反应;
B4)、反应结束后,加入硼氢化钠,继续反应;
B5)、反应结束后,进行离心分离,并对得到的葡萄糖脱氢酶进行清洗和分离,得到重组后的葡萄糖脱氢酶。
2.权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的制备方法,其特征在于,在步骤A1)中,所述溴化钾的浓度为1~4.5mol/L。
3.权利要求2所述的葡萄糖脱氢酶的制备方法,其特征在于,在步骤B1)中,所述带有羧基的氧化石墨烯、所述N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸、所述碳化二亚胺以及所述N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为(0.5~5):(0.06~0.15):(0.02~0.12):(0.012~0.03)。
4.权利要求3所述的葡萄糖脱氢酶的制备方法,其特征在于,在步骤B)中,所述经化学修饰后的葡萄糖脱氢酶、所述带有N6-(6-氨基己基)黄素腺嘌呤二核苷酸的氧化石墨烯、所述氯化钙以及所述硼氢化钠的重量比为(0.1~5):(0.2~5):(0.1~1):(0.1~5)。
5.权利要求1~4中任一项所述的葡萄糖脱氢酶的制备方法所制备的葡萄糖脱氢酶。
6.葡萄糖传感器,其特征在于,由以下方法制备:
1)、将权利要求5所述的葡萄糖脱氢酶与化学交联剂进行混合40~100分钟后,然后将化学交联后的葡萄糖脱氢酶涂布在电极的表面,得到葡萄糖传感膜;
2)、将生物相容性膜溶液涂布在所述葡萄糖传感膜上,并进行干燥。
7.权利要求6所述的葡萄糖传感器,其特征在于,所述葡萄糖脱氢酶和所述化学交联剂的重量比为(0.6~1.8):(0.0001~0.01)。
8.权利要求7所述的葡萄糖传感器,其特征在于,所述化学交联剂包括戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚(二甲基硅氧烷)-二缩水甘油醚、四环氧丙基-4,4-二氨基二苯甲烷、聚乙二醇二縮水甘油醚或4-(2,3-环氧丙氧基)-N,N-二(2,3-环氧丙基)苯胺。
9.权利要求6所述的葡萄糖传感器,其特征在于,在步骤2)中,干燥温度为22~30℃,干燥时间为30~100分钟,相对湿度为50~80%。
10.权利要求6所述的葡萄糖传感器,其特征在于,在步骤2)中,所述生物相容性膜溶液以旋转镀膜法涂布在所述葡萄糖传感膜上。
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