CN115236158A - 葡萄糖生物传感器、MXene纳米片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了葡萄糖生物传感器、MXene纳米片及其制备方法；本发明将葡萄糖脱氢酶化学偶联到导电性优越的MXene纳米片上，实现了从葡萄糖脱氢酶到MXene纳米片，然后到基体电极的电子传递，即葡萄糖脱氢酶的直接电化学，也就是第三代生物传感技术。

Description

葡萄糖生物传感器、MXene纳米片及其制备方法
技术领域
本发明涉及葡萄糖生物传感器、MXene纳米片及其制备方法。
背景技术
自上世纪60年代Clark和Lyon开发出第一个基于氧电极的葡萄糖生物传感器以来，经过半个多世纪的发展，葡萄糖生物传感器已经从通过监测葡萄糖氧化过程中所消耗的氧气或产生的过氧化氢来间接地检测葡萄糖的第一代生物传感技术，逐步发展到了通过葡萄糖氧化酶的直接电化学对葡萄糖进行直接检测。特别是近几年迅速发展起来的持续葡萄糖监测系统，它们以其使用方便和实时监测等特点，受到越来越多的糖尿病患者的青睐。现有的持续葡萄糖监测系统所使用的葡萄糖生物传感器可以分为两类，一类是通过电化学方法检测葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化氧化过程中氧气被还原所生成的过氧化氢来对葡萄糖进行间接地监测，例如美敦力的Guardian和iPro2，德康的Dexcom G5和G6。当葡萄糖生物传感器依赖组织液中的氧气来实现对葡萄糖的监测时，由于组织液中的氧气的含量（0.2~0.3毫摩尔/升）远远低于葡萄糖的含量（5~10毫摩尔/升)，组织液中氧气的含量就成了制约这类持续葡萄糖监测系统的性能的主要因素，特别是灵敏度，也就是所谓的“氧匮乏”现象；另一类是基于以氧化还原高分子为基础发展起来的“酶线技术”为传感原理的葡萄糖生物传感器，例如雅培糖尿病护理的FreeStyle Libre和FreeStyle Libre 2。通过对氧化还原高分子的分子设计和优化，葡萄糖的监测可以在50~100毫伏下进行，大大地改善了系统的抗干扰能力，同时摆脱了对氧气的依赖。但由于“酶线”为高分子材料，其制备难以得到精确的控制，这给这类持续葡萄糖监测系统的性能带来不确定性。更重要的是，这些氧化还原高分子必须与葡萄糖氧化酶进行相当程度的化学交联以后，才能够形成持续葡萄糖监测系统所需的生物传感膜。这一方面大大缩短了生物传感膜溶液的使用寿命，无形中增加了持续葡萄糖监测系统的生产成本。更为严重的是，随着使用时间的增加，化学交联反应越来越多，生物传感膜溶液的粘度变得越来越大，从而严重地影响到产品的一致性。另一方面，虽然通过酶线技术可以实现了葡萄糖的直接电化学检测，氧气作为葡萄糖氧化酶催化氧化葡萄糖的自然媒介体，不可避免地参与葡萄糖的催化氧化，成为葡萄糖监测的一个重要的干扰因素。为了提高这类葡萄糖生物传感器的性能，人们引入了各种生物相容性膜，一方面最大限度地消除氧气的干扰，另一方面拓展葡萄糖的可监测范围。
发明内容
一方面，本发明提供了一种MXene纳米片的制备方法，包括如下步骤：
1）、将0.1~5重量份的去辅基的葡萄糖氧化还原酶与0.1~5重量份的修饰后的MXene纳米片加入至HEPES缓冲溶液中培养24~72小时；其中，修饰后的MXene纳米片包括带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片或带有吡咯喹啉醌的MXene纳米片；
2）、培养结束后，加入0.1~5重量份的硼氢化钠，充分混合后继续反应1~5小时；反应结束后，离心分离，并用HEPES缓冲溶液对沉淀物清洗，然后离心分离，得到带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片；
3）、将0.2~5重量份的带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片与0.1~0.5重量份的带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇的络合物进行混合，然后加入0.1~0.6重量份的碳化二亚胺和0.01~0.2重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后进行反应12~48小时；然后，对反应液进行离心处理，弃去上层离心液，并用磷酸缓冲溶液对沉淀物进行清洗。
作为优选，在步骤1）中，所述去辅基的葡萄糖氧化还原酶包括去辅基的葡萄糖脱氢酶、去吡咯喹啉醌辅基的葡萄糖脱氢酶或去辅基的葡萄糖氧化酶。
作为优选，在步骤1）中，所述去辅基的葡萄糖氧化还原酶，0.5~2重量份；所述修饰后的MXene纳米片，0.5~2重量份。
作为优选，在步骤1）中，培养时间为36~56小时。
作为优选，在步骤2）中，所述硼氢化钠，0.5~3重量份。
作为优选，在步骤2）中，反应时间为1~3小时。
作为优选，在步骤3）中，所述带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片，0.5~2重量份；所述带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇的络合物，0.12~0.3重量份；所述碳化二亚胺，0.12~0.5重量份；所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺，0.03~0.12重量份。
作为优选，在步骤3）中，反应时间为18~36小时。
另一方面，本发明还提供了上述所述的MXene纳米片的制备方法所制备的MXene纳米片。
另一方面，本发明还提供了葡萄糖生物传感器，其由以下方法制备：将上述所述的MXene纳米片的溶液涂在碳电极上，待溶剂挥发后，在戊二醛饱和蒸汽中进行培养。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
本发明将葡萄糖脱氢酶化学偶联到导电性优越的MXene纳米片上，实现了从葡萄糖脱氢酶到MXene纳米片，然后到基体电极的电子传递，即葡萄糖脱氢酶的直接电化学，也就是第三代生物传感技术。
附图说明
图1为MXene纳米片与FAD-葡萄糖脱氢酶的化学偶联示意图；
图2为循环伏安图和电流响应曲线图；其中，A为偶联了FAD-葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片薄膜在PBS缓冲溶液中的循环伏安图（曲线1）和加入10毫摩尔/升的葡萄糖后的循环伏安图（曲线2）；B为覆盖且偶联了FAD-葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片薄膜在10毫摩尔/升的葡萄糖的PBS缓冲溶液的电流响应曲线图；
图3为含有偶联了FAD-葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片薄膜的葡萄糖生物传感器在0毫伏时的抗干扰测试（10毫摩尔/升葡萄糖，1.0毫摩尔/升干扰物）；
图4为MXene纳米片与PQQ-葡萄糖脱氢酶的化学偶联示意图；
图5为循环伏安图；其中，曲线1为偶联了PQQ-葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片薄膜在PBS缓冲溶液中的循环伏安图；曲线2为加入10毫摩尔/升的葡萄糖后的循环伏安图；
图6为循环伏安图；其中，曲线1为偶联了葡萄糖氧化酶的MXene纳米片薄膜在PBS缓冲溶液中的循环伏安图和曲线2为加入10毫摩尔/升的葡萄糖后的循环伏安图。
具体实施方式
参照附图对本发明做进一步说明。
为了提高葡萄糖生物传感器的准确性和抗干扰能力，特别是完全消除氧气对葡萄糖检测的制约，与现有的持续葡萄糖监测系统中以葡萄糖氧化酶作为生物传感机制不同，我们将葡萄糖脱氢酶化学偶联到导电性优越的MXene纳米片上，实现了从葡萄糖脱氢酶到MXene纳米片，然后到基体电极的电子传递，即葡萄糖脱氢酶的直接电化学（如图1所示），也就是第三代生物传感技术。
在此基础上，我们成功地研制出了基于葡萄糖脱氢酶直接电化学的葡萄糖生物传感器。实验表明，这个葡萄糖生物传感器不仅保持了其对葡萄糖的催化氧化性能，而且实现了在非常低的电位（0~50毫伏）下对葡萄糖进行监测，显著地改善了葡萄糖生物传感器的灵敏度、准确性、稳定性和抗干扰能力。更重要的是，由于葡萄糖脱氢酶催化氧化葡萄糖的过程是无需氧气参与的，这就从根本上解决了持续葡萄糖监测系统中的氧气依赖和氧气干扰问题。另一方面，葡萄糖脱氢酶的使用还大大地简化了葡萄糖生物传感器的选择性渗透膜/生物相容性膜的设计和制作，完全不用理会氧气的影响，这个选择性渗透膜除了有高度的生物相容性之外，只需要能够有效地调控葡萄糖就满足要求了。该葡萄糖生物传感器不仅可以用于制作持续葡萄糖监测系统所急需的高性能葡萄糖生物传感器，而且还可以应用于环保和食品工业等领域。
为了在葡萄糖脱氢酶与MXene纳米片之间建立一条高效的电子通道，首先，我们对羧基化的MXene纳米片进行功能化，例如将羧基化的MXene纳米片进行功能化，具体如下所述：
一种MXene纳米片的制备方法，包括如下步骤：
1）、将0.1~5重量份的去辅基的葡萄糖氧化还原酶与0.1~5重量份的修饰后的MXene纳米片加入至pH7.2的0.01~0.1摩尔/升的HEPES缓冲溶液中，在摇床上4℃培养24~72小时；其中，修饰后的MXene纳米片包括带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片或带有吡咯喹啉醌的MXene纳米片；优选的，去辅基的葡萄糖氧化还原酶包括去辅基的葡萄糖脱氢酶、去吡咯喹啉醌辅基的葡萄糖脱氢酶或去辅基的葡萄糖氧化酶；去辅基的葡萄糖氧化还原酶，0.5~2重量份；修饰后的MXene纳米片，0.5~2重量份；培养时间为36~56小时；
2）、培养结束后，加入0.1~5重量份的硼氢化钠，充分混合后继续4℃反应1~5小时；反应结束后，离心分离，并用HEPES缓冲溶液对沉淀物清洗，然后离心分离，得到带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片；优选的，硼氢化钠，0.5~3重量份；反应时间为1~3小时；
3）、将0.2~5重量份的带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片与0.1~0.6重量份的带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇的络合物进行混合，然后加入0.1~0.6重量份的碳化二亚胺和0.01~0.2重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后进行4℃反应12~48小时；然后，对反应液进行离心处理，弃去上层离心液，并用pH7.0且5~50毫摩尔/升的磷酸缓冲溶液对沉淀物进行清洗。优选的，带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片，0.5~2重量份；带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇的络合物，0.12~0.3重量份；碳化二亚胺，0.12~0.5重量份；N-羟基硫代琥珀酰亚胺，0.03~0.12重量份；反应时间为18~36小时。
本发明将葡萄糖脱氢酶化学偶联到导电性优越的MXene纳米片上，实现了从葡萄糖脱氢酶到MXene纳米片，然后到基体电极的电子传递，即葡萄糖脱氢酶的直接电化学，也就是第三代生物传感技术。
上述所述的MXene纳米片的制备方法所制备的MXene纳米片。
葡萄糖生物传感器，其由以下方法制备：将上述所述的MXene纳米片的溶液涂在碳电极上，待溶剂挥发后，在戊二醛饱和蒸汽中培养20~120分钟。
1、在去辅基的葡萄糖氧化还原酶为去辅基的葡萄糖脱氢酶时：
1）、将0.1~2重量份的羧基化的MXene纳米片与0.01~0.2重量份的N6-(6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，0.02~0.2重量份的碳化二亚胺和0.005~0.05重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行混合，在摇床上4℃反应8~72小时后，离心分离，并用pH7.0的50毫摩尔/升的磷酸缓冲溶液清洗纯化，得到带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片；优选的，羧基化的MXene纳米片，0.5~1.5重量份；N6-(6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，0.05~0.12重量份；碳化二亚胺，0.06~0.15重量份；N-羟基硫代琥珀酰亚胺，0.01~0.04重量份；反应时间为36~56小时；
2）、将0.1~5重量份的去辅基的葡萄糖脱氢酶与0.2~5重量份的带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片加入至pH7.2的0.01~0.1摩尔/升的HEPES缓冲溶液中，在摇床上4℃培养24~72小时；优选的，去辅基的葡萄糖脱氢酶，0.5~2重量份；带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片，0.5~2重量份；培养时间为36~56小时；
3）、培养结束后，加入0.1~5重量份的硼氢化钠，充分混合后继续反应1~5小时；反应结束后，离心分离，并用HEPES缓冲溶液对沉淀物清洗，然后离心分离，得到带有葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片；优选的，硼氢化钠，0.5~3重量份；反应时间为1~5小时；
4）、将0.2~5重量份的带有葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片与0.1~0.5重量份的带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇的络合物充分混合，然后加入0.1~0.6重量份的碳化二亚胺和0.01~0.2重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后进行反应12~48小时；然后，对反应液进行离心处理，弃去上层离心液，并用磷酸缓冲溶液对沉淀物进行清洗；优选的，带有葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片，0.5~2重量份；带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇的络合物，0.12~0.3重量份；碳化二亚胺，0.12~0.2重量份；N-羟基硫代琥珀酰亚胺，0.03~0.06重量份；反应时间为18~36小时。
具体实施例1：
羧基化的MXene纳米片进行功能化：
具体做法：将1g的羧基化的MXene纳米片与100mg的N6-(6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，100mg的碳化二亚胺和25mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在摇床上于4℃反应48小时；离心分离，并用pH 7.0的50毫摩尔/升的磷酸缓冲溶液清洗纯化；经过上述处理后，N6-(6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸偶联在了MXene纳米片上。
然后，我们将去黄素腺嘌呤二核苷酸辅基的葡萄糖脱氢酶与MXene纳米片上的黄素腺嘌呤二核苷酸进行重组，把葡萄糖脱氢酶的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅基植入到去辅基的葡萄糖脱氢酶上，使其复原。具体做法是：
将含有1g的去辅基的葡萄糖脱氢酶与1g的带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片加入至pH 7.2的0.02摩尔/升的HEPES缓冲溶液中，在4℃条件下，于摇床上培养48小时，培养结束后，加入2g的硼氢化钠，充分混合后，在4℃条件下反应2小时，反应结束后，离心分离，并用pH 7.2的HEPES缓冲溶液对沉淀物进行4次清洗和离心分离。
最后，我们将1g的带有葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片与200mg的电化学性能优越并带有游离氨基的过渡金属络合物如铜、铁、镍、钌、锇等的络合物充分混合，然后依次加入200mg的碳化二亚胺和50mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后，在4℃条件下反应24小时；然后将溶液倒入离心管中，以10000 rpm的转速离心30分钟；弃去上层离心液，用pH 7.0的25毫摩尔/升的磷酸缓冲溶液清洗；经过上述处理后，游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇等的络合物通过游离氨基被偶联在MXene纳米片和葡萄糖脱氢酶上。
虽然经过上述一系列化学处理以后，葡萄糖脱氢酶和被用做电子传递接力点的过渡金属络合物被成功地偶联到导电性能优越的MXene纳米片上，但是还需要确认这些化学处理和MXene纳米片的存在并没有显著地影响到葡萄糖脱氢酶催化氧化葡萄糖的活性。因此，我们首先将偶联了葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片溶液涂在碳电极上，待溶剂挥发以后，在戊二醛饱和蒸汽中培养60分钟，将偶联了葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片通过戊二醛交联，形成一层稳定的膜，固定在碳电极表面。
然后利用循环伏安法在PBS缓冲溶液中对电极上的这层膜进行表征。如图2的A部分中曲线1所示，经过上述一系列的化学处理后，其循环伏安图上出现的一对可逆的氧化还原峰清楚地表明，MXene纳米片被成功地赋予了电化学活性，而且，其氧化还原电位在极低的-0.08伏。当在PBS缓冲溶液中加入10毫摩尔/升的葡萄糖后，偶联了葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片薄膜的循环伏安图清晰地表明这层膜对葡萄糖具有良好的电化学催化作用，如图2的A部分中曲线2所示，另外，如图2的A部分中曲线1所示，偶联了葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片在连续循环伏安扫描时，表现出了一个电荷和膜结构重组的过程，经过反复循环伏安扫描后，其氧化峰和还原峰的峰电位差逐渐缩小，表明偶联了葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片薄膜的电化学阻抗逐渐减小，电子传递速度逐渐加快。与此同时，膜的稳定性没有受到显著的影响 （如图2的A部分和B部分所示）。例如，在长达一个星期的连续测试中，平均每天的灵敏度衰减不到4%，这就为开发以葡萄糖脱氢酶为生物传感机制的高灵敏度、高准确性和高稳定性的持续葡萄糖监测系统创造了条件。
如图2所示，葡萄糖通过偶联了葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片的电化学催化氧化发生在-100毫伏到0毫伏之间，葡萄糖的检测电位可以在0~50毫伏的任何电位。如图3所示，当我们把葡萄糖的检测电位定在0毫伏时，常见的持续葡萄糖监测系统的干扰物质都没有对葡萄糖生物传感器产生任何干扰。这是迄今为止，干扰最少的可用于动态血糖仪的葡萄糖生物传感器。更重要的是，如前所述，现有的持续葡萄糖监测系统的葡萄糖生物传感器都是在葡萄糖氧化酶的基础上制备的，在对葡萄糖检测时，氧气就成了制约持续葡萄糖监测系统性能的一个主要因素，或者出现 “氧匮乏”，极大地限制了灵敏度，或者成为葡萄糖监测时的一个不可忽视的干扰因素，影响葡萄糖生物传感器的线性和准确性。而我们这个葡萄糖生物传感器中的葡萄糖脱氢酶在氧化葡萄糖时不需要氧气参与，完全消除了氧气的影响。实验结果也证实氧气对葡萄糖检测无任何干扰（如图3所示）。如图3所示，当在含有10毫摩尔/升的葡萄糖的PBS缓冲溶液中通入氧气时和当溶液中的氧气被氩气完全除去后，葡萄糖生物传感器的电流没有任何的变化。
2、在去辅基的葡萄糖氧化还原酶为去吡咯喹啉醌辅基的葡萄糖脱氢酶时：
除了以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的葡萄糖脱氢酶，还有一类以吡咯喹啉醌（PQQ）为辅基的葡萄糖脱氢酶。由于吡咯喹啉醌分子本身有可以用来化学偶联的羧基，利用氨基化的MXene纳米片可以将吡咯喹啉醌偶联到MXene纳米片上，然后通过与去吡咯喹啉醌辅基的葡萄糖脱氢酶进行重组，可以将PQQ-葡萄糖脱氢酶复原并偶联在MXene纳米片上(如图4所示)。具体做法是：
将0.1~5重量份的氨基化的MXene纳米片与0.05~0.2重量份的吡咯喹啉醌（PQQ），0.01~0.5重量份的碳化二亚胺和0.005~0.1重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在摇床上4℃反应8~72小时；离心分离，并用pH7.0的50毫摩尔/升磷酸缓冲溶液清洗纯化；经过上述处理后，吡咯喹啉醌偶联在MXene纳米片上。
然后，我们将去吡咯喹啉醌辅基的葡萄糖脱氢酶与MXene纳米片上的吡咯喹啉醌进行重组，把葡萄糖脱氢酶的吡咯喹啉醌辅基植入到去辅基的葡萄糖脱氢酶上，使其复原。具体做法是：将0.1~5重量份的去吡咯喹啉醌辅基的葡萄糖脱氢酶与0.1~5重量份的带有吡咯喹啉醌的MXene纳米片加入至pH7.2的0.01~0.1摩尔/升的HEPES缓冲溶液中，在摇床上4℃条件下培养24~72小时，培养结束后，加入0.1~5重量份的硼氢化钠，充分混合后，在4℃条件下反应1~5小时；反应结束后，离心分离，并用pH7.2的HEPES缓冲溶液对沉淀物进行2~6次清洗和离心分离。
与以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的葡萄糖脱氢酶相似，我们进一步将0.2~5重量份带有葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片与0.01~0.5重量份的电化学性能优越并带有游离氨基的过渡金属络合物如铜、铁、镍、钌、锇等的络合物充分混合，然后依次加入0.001~0.5重量份的碳化二亚胺和0.001~0.1重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后，在4℃条件下反应12~48小时。然后再次将溶液倒入离心管中，以5000~15000 rpm的转速离心20~60分钟。弃去上层离心液，用pH7.0的5~50毫摩尔/升的磷酸缓冲溶液清洗。经过上述处理后，带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇等的络合物通过游离氨基被偶联在MXene纳米片和葡萄糖脱氢酶上。然后经过戊二醛交联以后，在碳电极上形成一层稳定的膜。我们对此膜进行电化学表征时发现，经过上述一系列化学处理以后，PQQ-葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的电化学氧化有良好的催化活性。
具体实施例2：
将1g的氨基化的MXene纳米片与100mg的吡咯喹啉醌（PQQ），100mg的碳化二亚胺和25mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行混合，在摇床上4℃条件下反应48小时；离心分离，并用pH7.0的50毫摩尔/升磷酸缓冲溶液清洗纯化。经过上述处理后，吡咯喹啉醌偶联在了MXene纳米片上。
将含有1g的去吡咯喹啉醌辅基的葡萄糖脱氢酶与1g的带有吡咯喹啉醌的MXene纳米片加入至pH7.2的0.02摩尔/升的HEPES缓冲溶液中，在摇床上4℃条件下培养48小时，培养结束后，加入2g的硼氢化钠，充分混合后在4℃条件下反应2小时，反应结束后，离心分离，并用pH7.2的HEPES缓冲溶液对沉淀物进行4次清洗和离心分离。
将1g带有葡萄糖脱氢酶的MXene纳米片与200mg的电化学性能优越并带有游离氨基的过渡金属络合物如铜、铁、镍、钌、锇等的络合物充分混合，然后依次加入200mg的碳化二亚胺和50mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后，在4℃条件下反应24小时。然后再次将溶液倒入离心管中，以10000rpm的转速离心30分钟。弃去上层离心液，用pH7.0的25毫摩尔/升的磷酸缓冲溶液清洗。经过上述处理后，带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇等的络合物通过游离氨基被偶联在MXene纳米片和葡萄糖脱氢酶上。然后经过戊二醛交联以后，在碳电极上形成一层稳定的膜。我们对此膜进行电化学表征时发现，经过上述一系列化学处理以后，PQQ-葡萄糖脱氢酶对葡萄糖的电化学氧化有良好的催化活性(如图5所示)。
3、在去辅基的葡萄糖氧化还原酶为去辅基的葡萄糖氧化还原酶时：
另外，由于葡萄糖氧化酶的辅基也是黄素腺嘌呤二核苷酸，我们也可以将去黄素腺嘌呤二核苷酸辅基的葡萄糖氧化酶偶联到MXene纳米片上，制备出以葡萄糖氧化酶为基础的葡萄糖生物传感器。具体做法是：将含有0.1~5重量份的去辅基的葡萄糖氧化酶与0.1~5重量份的带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片加入至pH7.2的0.01~0.1摩尔/升的HEPES缓冲溶液中，在摇床上4℃条件下培养24~72小时，培养结束后，加入0.1~5重量份的硼氢化钠，充分混合后在4℃条件下反应1~5小时，反应结束后，离心分离，并用pH7.2的HEPES缓冲溶液对沉淀物进行2~6次清洗和离心分离。然后，我们将0.1~5重量份的带有葡萄糖氧化酶的MXene纳米片与0.01~0.5重量份的电化学性能优越并带有游离氨基的过渡金属络合物如铜、铁、镍、钌、锇等的络合物充分混合，然后依次加入0.02~2重量份的碳化二亚胺和0.01~0.5重量份的 N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后，在4℃条件下反应12~48小时。然后再次将溶液倒入离心管中，以5000~15000rpm的转速离心20~60分钟。弃去上层离心液，用pH7.0的5~50毫摩尔/升的磷酸缓冲溶液清洗。经过上述处理后，游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇等的络合物通过游离氨基被偶联在MXene纳米片和葡萄糖氧化酶上。
与葡萄糖脱氢酶相似，当我们将偶联了葡萄糖氧化酶的MXene纳米片溶液涂在碳电极上，并用戊二醛交联形成一层稳定的膜固定在碳电极表面。
具体实施例3：
将含有1g的去辅基的葡萄糖氧化酶与1g的带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片加入至pH 7.2 的0.02摩尔/升的HEPES缓冲溶液中，在摇床上4℃条件下培养48小时，培养结束后，加入2g的硼氢化钠，充分混合后在4℃条件下反应2小时，反应结束后，离心分离，并用pH 7.2的HEPES缓冲溶液对沉淀物进行4次清洗和离心分离。然后，我们将1g的带有葡萄糖氧化酶的MXene纳米片与200mg的电化学性能优越并带有游离氨基的过渡金属络合物如铜、铁、镍、钌、锇等的络合物充分混合，然后依次加入500mg的碳化二亚胺和100mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后，在4℃条件下反应24小时。然后再次将溶液倒入离心管中，以10000rpm的转速离心30分钟。弃去上层离心液，用pH7.0的25毫摩尔/升的磷酸缓冲溶液清洗。经过上述处理后，游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇等的络合物通过游离氨基被偶联在MXene纳米片和葡萄糖氧化酶上。
我们将偶联了葡萄糖氧化酶的MXene纳米片溶液涂在碳电极上，并用戊二醛交联形成一层稳定的膜固定在碳电极表面。然后利用循环伏安法在PBS缓冲溶液中对碳电极上的这层膜进行表征。如图6曲线1所示，其循环伏安图上出现的一对可逆的氧化还原峰，表明经过以上一系列的化学处理后，MXene纳米片被成功地赋予了电化学活性，而且，其氧化还原电位在极低的-0.07伏。当在PBS缓冲溶液中加入10毫摩尔/升的葡萄糖后，偶联了葡萄糖氧化酶的MXene纳米片薄膜的循环伏安图清晰地表明这层膜对葡萄糖具有良好的电化学催化作用（如图6曲线2所示），这为开发以葡萄糖氧化酶为基础的高灵敏度的持续葡萄糖监测系统创造了条件。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种MXene纳米片的制备方法，其特征是：包括如下步骤：
1）、将0.1~5重量份的去辅基的葡萄糖氧化还原酶与0.1~5重量份的修饰后的MXene纳米片加入至HEPES缓冲溶液中培养24~72小时；其中，修饰后的MXene纳米片包括带有黄素腺嘌呤二核苷酸的MXene纳米片或带有吡咯喹啉醌的MXene纳米片；
2）、培养结束后，加入0.1~5重量份的硼氢化钠，充分混合后继续反应1~5小时；反应结束后，离心分离，并用HEPES缓冲溶液对沉淀物清洗，然后离心分离，得到带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片；
3）、将0.2~5重量份的带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片与0.1~0.5重量份的带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇的络合物进行混合，然后加入0.1~0.6重量份的碳化二亚胺和0.01~0.2重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，充分混合后进行反应12~48小时；然后，对反应液进行离心处理，弃去上层离心液，并用磷酸缓冲溶液对沉淀物进行清洗。
2.根据权利要求1所述的MXene纳米片的制备方法，其特征是：在步骤1）中，所述去辅基的葡萄糖氧化还原酶包括去辅基的葡萄糖脱氢酶、去吡咯喹啉醌辅基的葡萄糖脱氢酶或去辅基的葡萄糖氧化酶。
3.根据权利要求2所述的MXene纳米片的制备方法，其特征是：在步骤1）中，所述去辅基的葡萄糖氧化还原酶，0.5~2重量份；所述修饰后的MXene纳米片，0.5~2重量份。
4.根据权利要求3所述的MXene纳米片的制备方法，其特征是：在步骤1）中，培养时间为36~56小时。
5.根据权利要求4所述的MXene纳米片的制备方法，其特征是：在步骤2）中，所述硼氢化钠，0.5~3重量份。
6.根据权利要求5所述的MXene纳米片的制备方法，其特征是：在步骤2）中，反应时间为1~3小时。
7.根据权利要求6所述的MXene纳米片的制备方法，其特征是：在步骤3）中，所述带有葡萄糖氧化还原酶的MXene纳米片，0.5~2重量份；所述带有游离氨基的铜、铁、镍、钌、锇的络合物，0.12~0.3重量份；所述碳化二亚胺，0.12~0.5重量份；所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺，0.03~0.12重量份。
8.根据权利要求7所述的MXene纳米片的制备方法，其特征是：在步骤3）中，反应时间为18~36小时。
9.根据权利要求8所述的MXene纳米片的制备方法所制备的MXene纳米片。
10.葡萄糖生物传感器，其特征是：其由以下方法制备：将权利要求1~9中任一项所述的MXene纳米片的溶液涂在碳电极上，待溶剂挥发后，在戊二醛饱和蒸汽中进行培养。
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