CN112986358A - 一种基于Ti3C2的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分析检测技术领域，公开了一种基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，包括：构建生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion：以pH值为7～7.4的PBS缓冲溶液为反应溶剂，将Ti3C2纳米材料与HRP、Nafion共孵育；电极的修饰：将HRP@Ti3C2/Nafion滴涂到玻碳电极表面，制得改性玻碳电极；构建电化学生物传感器：向待测溶液中加入不同浓度的过氧化氢，使用改性玻碳电极测定过氧化氢的DPV信号，建立标准曲线；样品检测：测得未知浓度的过氧化氢样品DPV信号，代入标准曲线得到样品中过氧化氢的浓度。本发明能够快速、高灵敏高选择性的检测过氧化氢。

Description

一种基于Ti3C2的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，涉及一种基于Ti3C2的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法，更具体地，涉及一种新型纳米片层材料Ti3C2和辣根过氧化物酶(HRP)的电化学生物传感器检测过氧化氢的方法。
背景技术
过氧化氢(H2O2)作为抗菌、氧化剂、还原剂和漂白剂，广泛应用于制药、临床、环境和化工等多个领域。在生物系统中，H2O2是有氧呼吸产生的，在多种信号通路中起信使作用。过氧化氢的积累导致氧化应激，这与许多心血管疾病有关，如急性心肌梗死(AMI)。因此，开发一种高灵敏度、可靠的过氧化氢检测方法具有重要意义。
目前，检测过氧化氢的方法有很多，如传统滴定法、荧光分光光度法、紫外分光光度法、纸层析法和色谱法。然而，与生物传感器相比，传统方法缺乏高灵敏度及特异性，且依赖昂贵的仪器、专业的人员、严格的实验环境，无法实现快速实时检测。生物传感器，特别是电化学酶生物传感器，具有选择性高、灵敏度高、操作简便等特点，可实现实时的现场检测，因而受到越来越多的关注。
辣根过氧化物酶是酶反应中应用最广泛的催化剂之一。近年来，辣根过氧化物酶因其具有高活性和高选择性、高抗逆性、高可操作性和高可靠性等优点而受到人们的广泛关注。然而，与其他酶一样，辣根过氧化物酶也存在稳定性低、寿命短、价格高、难以重复利用等缺点。为了解决这些缺点，酶固定化工艺可以大大提高酶的活性和稳定性，因为固定化酶可以广泛应用于不同的反应环境和恶劣的条件。生物传感器的商业化进程一直受到限制，主要原因是酶类生物传感器容易受到环境的影响，导致其活性和稳定性下降。因此，开发新型固定化平台以提高酶对环境的稳定性是实现酶传感器商业化的重要研究内容。
Ti3C2是MXene最典型的代表，因其优异的电化学响应、催化性能和电子传导能力而引起了电化学研究人员的广泛关注。将纳米材料与生物酶结合可以提高生物酶的稳定性，提高测定的灵敏度，是解决生物酶传感器缺点的良好策略。
综上所述，实现过氧化氢的快速检测能够强有力地辅助临床检测以及基础研究的转化，因此，开发高灵敏低成本的电化学生物传感器具有重要的科学意义。将低成本的电化学生物传感器应用于过氧化氢的检测，不仅是一种新颖的检测手段，也将为电化学生物传感器的设计开发带来新的切入点。
发明内容
本发明的目的是针对现有检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺点，提供一种基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，该方法能够快速、高灵敏高选择性地检测过氧化氢。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，包括如下步骤：
步骤(a)、构建生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion：以pH值为7～7.4的PBS缓冲溶液为反应溶剂，将Ti3C2纳米材料与HRP、Nafion共孵育，构建生物复合材料 HRP@Ti3C2/Nafion；
步骤(b)、电极的修饰：将步骤(a)构建的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion滴涂到玻碳电极(GCE)表面，制得改性玻碳电极；
步骤(c)、构建HRP@Ti3C2/Nafion/GCE电化学生物传感器：向待测溶液中加入不同浓度的过氧化氢，使用改性玻碳电极测定过氧化氢的DPV信号，建立标准曲线；
步骤(d)、样品检测：未知浓度的过氧化氢样品按步骤(c)测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中过氧化氢的浓度。
辣根过氧化物酶(HRP)对过氧化氢有特异性催化作用，发生氧化还原反应，释放电子，得到过氧化氢的DPV信号。本发明方法的检测机理为：基于辣根过氧化物酶对H2O2的特异性作用，以高比表面积、导电性好的新型二维纳米片层材料Ti3C2为基材，Nafion是一种磺化四氟乙烯基含氟聚合物共聚物，具有导电性能，为性能良好的成膜材料，被用作传感器电极制作的电极改进剂。HRP@Ti3C2/Nafion/GCE生物传感器中，Ti3C2作为载体的同时提供更多的辣根过氧化物酶结合位点，提高反应体系的灵敏度，辣根过氧化物酶作为特异性识别元件，Nafion使辣根过氧化物酶与纳米材料充分接触，缩短了酶活性中心与电极表面的距离，为酶与电极之间的直接电子转移提供了良好的环境。该电化学生物传感器对过氧化氢具有较高的灵敏度。电化学信号的高低与体系中过氧化氢的浓度相关，实现电化学传感检测过氧化氢，实现对目标物的定量检测。
步骤(a)中，Ti3C2由MAX相与HCl以及LiF制得。Ti3AlC2是制备Ti3C2最为常用的 MAX相。
Ti3C2的制备方法可为本领域公知的方法，具体操作如下：室温，将0.5～1.5g LiF完全溶解在15～25mL 6M盐酸中，得到LiF/HCl溶液，为防止过热，在5分钟内，将0.5～1.5 gTi3AlC2慢慢加入到LiF/HCl溶液中，得到悬浮液；再升温至35～40℃，充分搅拌20～25 h；3000～4000rpm离心，超纯水反复洗涤沉淀至滤液中性；再采用超纯水，通过超声将沉淀分散均匀，以8000～9000rpm离心，未分层的Ti3AlC2和多层的Ti3C2与单层Ti3C2实现分离，上层即为单层Ti3C2。
步骤(a)中，体系中Ti3C2的终浓度为0.5～1.5mg/mL，Ti3C2与HRP的质量比为1:1～5，优选为1:3；体系中Ti3C2与Nafion为1:50～100，优选为1:60。
孵育的温度为35～40℃，优选为37℃；孵育的时间为10～50min，优选为30min。
根据本发明，本领域技术人员可以根据上述原理设计底物的浓度，根据本发明一种优选实施方式，体系中，Ti3C2的浓度为0.5mg/mL，辣根过氧化物酶的浓度为1.5mg/mL，Ti3C2与HRP、Nafion的质量比为1:3:60。
优选以pH值为7.4的PBS缓冲溶液为反应溶剂。
步骤(b)中，所述的待测溶液由KCl、pH＝7.4的PBS缓冲溶液和水配制得到，待测溶液中，KCl浓度为1M，PBS浓度为0.5mM。
步骤(c)中，过氧化氢的终浓度为5～8000μM；根据本发明一种具体实施方式，多个过氧化氢的终浓度为5μM,100μM,200μM,300μM,400μM,800μM,900μM,1000μM,2000 μM,3000μM,5000μM,8000μM。
测定过氧化氢的电压可根据需要确定，优选为-0.8～0.2V。
步骤(d)、未知浓度的过氧化氢样品溶解在与步骤(c)等体积的待测溶液中，按步骤(c)测得DPV信号。
与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
1、本发明引入新型二维纳米材料Ti3C2，极大地提高了体系的灵敏度，而且引入过氧化氢特异性酶辣根过氧化物酶，提高了体系选择性，实现过氧化氢的高选择性高灵敏度检测。
2、基于本发明的传感策略，仪器设备简单便携，操作简单、快速，有利于推广应用。
附图说明
图1为本发明基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的原理图。
图2为实施例1所构建的检测体系中不同浓度过氧化氢对DPV峰电流的标准曲线图；其中，图2A中曲线由上至下依次表示：体系中过氧化氢终浓度为5μM,100μM,200μM, 300μM,400μM,800μM,900μM,1000μM,2000μM,3000μM,5000μM,8000μM；Ep表示电压；Ip表示电流。
图3为在不同pH缓冲溶液中构建的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion对过氧化氢检测的影响。
图4为实施例1所构建的检测体系对过氧化氢的选择性比较图。
图5为HRP@Ti3C2/Nafion、HRP@Ti3C2、Ti3C2所构建的检测体系对过氧化氢检测的影响。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
Ti3C2的制备方法如下：室温，LiF(1.0g)在搅拌下完全溶解在6M HCl(20mL)中，得到 LiF/HCl溶液，为防止过热，在5分钟内，将Ti3AlC2(1.0g)慢慢加入到LiF/HCl溶液中，得到悬浮液；再升温至35℃，充分搅拌24h；3500rpm离心，超纯水反复洗涤沉淀至滤液中性；再采用超纯水，通过超声将沉淀分散均匀，再以8000rpm离心将未分层的Ti3AlC2和多层的Ti3C2与单层Ti3C2实现分离，沉淀为未分层的Ti3AlC2和多层的Ti3C2，上层为单层 Ti3C2，即为目标Ti3C2。
实施例1
步骤(a)、构建生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion：将Ti3C2与HRP、1.4μL 5％Nafion溶液(Sigma–Aldrich)加入到pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，使Ti3C2的终浓度为0.5 mg/mL，HRP的终浓度为1.5mg/mL，Ti3C2、HRP和Nafion的质量比为1:3:60，37℃共孵育30min；
步骤(b)、电极的修饰：取15μL步骤(a)得到的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion，滴涂到玻碳电极(直径为5mm)表面上，室温干燥，制得改性玻碳电极；
步骤(c)、构建HRP@Ti3C2/Nafion/GCE电化学生物传感器：向2mL待测溶液(待测溶液由KCl、pH＝7.4的PBS缓冲溶液和水配制得到，1M KCl、0.5mM PBS)中加入不同浓度的过氧化氢(检测体系中过氧化氢终浓度分别为：0μM,5μM,100μM,200μM,300μM,400 μM,800μM,900μM,1000μM,2000μM,3000μM,5000μM,8000μM)，使用步骤(b)得到的改性玻碳电极测定过氧化氢的DPV信号，建立标准曲线：y＝0.0061x+2.5421，R2＝0.9959；
步骤(d)、样品检测：未知浓度的过氧化氢样品按照步骤(3)检测测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中过氧化氢的浓度。
实施例2
步骤(a)、构建生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion：将Ti3C2与HRP、1.4μL 5％Nafion溶液(Sigma–Aldrich)加入到pH值为6的PBS缓冲溶液中，使Ti3C2的终浓度为0.5mg/mL， HRP的终浓度为1.0mg/mL，Ti3C2、HRP和Nafion的质量比为1:2:60，37℃共孵育20 min；
步骤(b)、电极的修饰：取15μL步骤(a)得到的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion，滴涂到玻碳电极(直径为5mm)表面上，室温干燥，制得改性玻碳电极；
步骤(c)、构建HRP@Ti3C2/Nafion/GCE电化学生物传感器：向2mL待测溶液(同实施例1)中加入不同浓度的过氧化氢(检测体系中过氧化氢终浓度分别为：0μM,5μM,100 μM,200μM,300μM,400μM,800μM,900μM,1000μM,2000μM,3000μM,5000μM,8000 μM)，使用步骤(b)得到的改性玻碳电极测定过氧化氢的DPV信号，建立标准曲线；
步骤(d)、样品检测：未知浓度的过氧化氢样品按照步骤(3)检测测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中过氧化氢的浓度。
实施例3
步骤(a)、构建生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion：将Ti3C2与HRP、1.4μL 5％Nafion溶液(Sigma–Aldrich)加入到pH值为7的PBS缓冲溶液中，使Ti3C2的终浓度为0.5mg/mL， HRP的终浓度为2.0mg/mL，Ti3C2、HRP和Nafion的质量比为1:4:60，37℃共孵育40 min；
步骤(b)、电极的修饰：取15μL步骤(a)得到的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion，滴涂到玻碳电极(直径为5mm)表面上，室温干燥，制得改性玻碳电极；
步骤(c)、构建HRP@Ti3C2/Nafion/GCE电化学生物传感器：向2mL待测溶液(同实施例1)中加入不同浓度的过氧化氢(检测体系中过氧化氢终浓度分别为：0μM,5μM,100 μM,200μM,300μM,400μM,800μM,900μM,1000μM,2000μM,3000μM,5000μM,8000 μM)，使用步骤(b)得到的改性玻碳电极测定过氧化氢的DPV信号，建立标准曲线；
步骤(d)、样品检测：未知浓度的过氧化氢样品按照步骤(3)检测测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中过氧化氢的浓度。
实施例4
步骤(a)、构建生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion：将Ti3C2与HRP、1.4μL 5％Nafion溶液(Sigma–Aldrich)加入到pH值为8的PBS缓冲溶液中，使Ti3C2的终浓度为0.5mg/mL， HRP的终浓度为2.5mg/mL，Ti3C2、HRP和Nafion的质量比为1:5:60，37℃共孵育50 min；
步骤(b)、电极的修饰：取15μL步骤(a)得到的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion，滴涂到玻碳电极(直径为5mm)表面上，室温干燥，制得改性玻碳电极；
步骤(c)、构建HRP@Ti3C2/Nafion/GCE电化学生物传感器：向2mL待测溶液(同实施例1)中加入不同浓度的过氧化氢(检测体系中过氧化氢终浓度分别为：0μM,5μM,100 μM,200μM,300μM,400μM,800μM,900μM,1000μM,2000μM,3000μM,5000μM,8000 μM)，使用步骤(b)得到的改性玻碳电极测定过氧化氢的DPV信号，建立标准曲线；
步骤(d)、样品检测：未知浓度的过氧化氢样品按照步骤(3)检测测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中过氧化氢的浓度。
实施例5
步骤(a)、将实施例1步骤(a)中pH值为7.4的PBS缓冲溶液分别替换为pH值为5的PBS缓冲溶液、pH值为6的PBS缓冲溶液、pH值为7的PBS缓冲溶液、pH值为8的PBS 缓冲溶液，其余均与实施例1步骤(a)保持一致，构建不同的生物复合材料 HRP@Ti3C2/Nafion。
步骤(b)、电极的修饰：取15μL步骤(a)得到的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion，滴涂到玻碳电极(直径为5mm)表面上，室温干燥，制得改性玻碳电极；
步骤(c)、构建HRP@Ti3C2/Nafion/GCE电化学生物传感器：向2mL待测溶液(同实施例1)中加入过氧化氢，使检测体系中过氧化氢终浓度为5000μM，使用步骤(b)得到的改性玻碳电极测定过氧化氢的DPV信号，见图3。
由结果表明，在pH值为7～7.4的PBS缓冲溶液中构建的HRP@Ti3C2/Nafion对过氧化氢具有较优的催化性能，尤其是在pH值为7.4的缓冲溶液中构建的HRP@Ti3C2/Nafion对过氧化氢的催化性能最优。
应用实施例1
取2mL待测溶液(同实施例1)，分别加入过氧化氢标准品和其他干扰物标准品(抗坏血酸AA、尿酸UA、尿素Urea、柠檬酸CA、葡萄糖Glu)，使体系中过氧化氢标准品浓度为1000μM，其他干扰物标准品浓度为10000μM，按照实施例1的方法测定DPV信号，结果见图4，表明本发明方法对过氧化氢具有较高的选择性。
对比例1
构建生物复合材料HRP@Ti3C2：将Ti3C2与HRP加入到pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，使Ti3C2的终浓度为0.5mg/mL，HRP的终浓度为1.5mg/mL，37℃共孵育30min；取 15μL得到的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion，滴涂到玻碳电极(直径为5mm)表面上，室温干燥，制得改性玻碳电极。
应用实施例2
向2mL待测溶液(同实施例1)中加入过氧化氢，使检测体系中过氧化氢终浓度为1000μM，分别使用实施例1得到的改性玻碳电极、对比例1得到的改性玻碳电极(HRP@Ti3C2)、Ti3C2测定过氧化氢的DPV信号，见图5。
由结果表明，Ti3C2对H2O2不具有催化作用，而HRP@Ti3C2的催化性能远远不如 HRP@Ti3C2/Nafion的催化性能。
以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤(a)、构建生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion：以pH值为7～7.4的PBS缓冲溶液为反应溶剂，将Ti3C2纳米材料与HRP、Nafion共孵育，构建生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion；
步骤(b)、电极的修饰：将步骤(a)构建的生物复合材料HRP@Ti3C2/Nafion滴涂到玻碳电极表面，制得改性玻碳电极；
步骤(c)、构建HRP@Ti3C2/Nafion/GCE电化学生物传感器：向待测溶液中加入不同浓度的过氧化氢，使用改性玻碳电极测定过氧化氢的DPV信号，建立标准曲线；
步骤(d)、样品检测：未知浓度的过氧化氢样品按步骤(c)测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中过氧化氢的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(a)中，Ti3C2是由MAX相与HCl及LiF制得的。
3.根据权利要求1或2所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(a)中，体系中Ti3C2的终浓度为0.5～1.5mg/mL，Ti3C2与HRP的质量比为1:1～5；体系中Ti3C2与Nafion为1:50～100。
4.根据权利要求3所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(a)中，体系中Ti3C2与HRP的质量比为1:3；体系中Ti3C2与Nafion为1:60。
5.根据权利要求1所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(a)中，孵育的温度为35～40℃，孵育的时间为10～50min。
6.根据权利要求5所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(a)中，孵育的温度为37℃，孵育的时间为30min。
7.根据权利要求1所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(a)中，以pH值为7.4的PBS缓冲溶液为反应溶剂。
8.根据权利要求1所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(b)中，所述的待测溶液由KCl、pH＝7.4的PBS缓冲溶液和水配制得到；待测溶液中，KCl浓度为1M，PBS浓度为0.5mM。
9.根据权利要求1所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(c)中，过氧化氢的终浓度为5～8000μM。
10.根据权利要求1所述的基于Ti3C2的电化学生物传感器测定过氧化氢的方法，其特征在于：步骤(c)中，测定过氧化氢的电压为-0.8～0.2V。
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