CN114088790A - 葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法 - Google Patents

葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114088790A
CN114088790A CN202210058461.9A CN202210058461A CN114088790A CN 114088790 A CN114088790 A CN 114088790A CN 202210058461 A CN202210058461 A CN 202210058461A CN 114088790 A CN114088790 A CN 114088790A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glucose oxidase
black phosphorus
glucose
phosphorus nanosheet
aminohexyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210058461.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114088790B (zh
Inventor
沈薇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Zhongxing Medical Technology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Zhongxing Medical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Zhongxing Medical Technology Co ltd filed Critical Suzhou Zhongxing Medical Technology Co ltd
Priority to CN202210058461.9A priority Critical patent/CN114088790B/zh
Publication of CN114088790A publication Critical patent/CN114088790A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114088790B publication Critical patent/CN114088790B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G01N27/3272—Test elements therefor, i.e. disposable laminated substrates with electrodes, reagent and channels

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法，重组葡萄糖氧化酶的制备方法包括如下步骤：A）、葡萄糖氧化酶的脱辅基化；B）、金属络合物与黑磷纳米片和葡萄糖氧化酶的辅基偶联；C）、葡萄糖氧化酶的重组。本发明将葡萄糖氧化酶重组到含有电子传递接力点的黑磷纳米片上，成功地研制出了具有极低氧化还原电位的葡萄糖生物传感膜；由该葡萄糖生物传感膜制备的葡萄糖生物传感器，不仅保持了对葡萄糖的催化氧化性能，而且实现了在非常低的电位（‑100~0毫伏）下对葡萄糖进行监测，显著地改善了葡萄糖生物传感器的灵敏度、准确性、稳定性和专一性。

Description

葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法。
背景技术
近几年迅速发展起来的持续葡萄糖监测系统以其使用方便和实时监测等特点，受到越来越多的糖尿病患者的青睐。作为持续葡萄糖监测系统的核心部件，葡萄糖生物传感器的性能直接决定了持续葡萄糖监测系统的性能和使用寿命。现有的持续葡萄糖监测系统所使用的葡萄糖生物传感器可以分为两类。一类是通过电化学方法检测葡萄糖在葡萄糖氧化酶催化氧化过程中生成的过氧化氢来对葡萄糖进行间接监测，例如德康的Dexcom G5和G6和美敦力的Guardian和iPro 2。它们依赖组织液中的氧气来实现对葡萄糖的监测，而组织液中的氧气含量远远低于葡萄糖的含量，因此，组织液中氧气的含量就成了制约这类持续葡萄糖监测系统的性能的主要因素，也就是所谓的“氧匮乏”现象。更为重要的是，过氧化氢的电化学检测要求较高的检测电位，因而大大地降低了持续葡萄糖监测系统的抗干扰能力，特别是对常用药物如乙酰氨基酚的抗干扰能力。另外，过氧化氢对葡萄糖氧化酶具有很强的破坏作用，从而严重地影响传感器的稳定性和使用寿命。虽然经过40多年不懈的研究和探索，其性能还远远不能满足葡萄糖持续监测的需要。例如，美敦力的Guardian和iPro 2每天还需要进行两次校正，它们的使用寿命也只有一个星期。
为了克服以上问题，Dr. Heller等人引入了氧化还原高分子，开发出了可以用于生物传感器的“酶线技术”。基于此原理发展起来了另一类生物传感技术，即第二代生物传感技术。第二代生物传感技术目前已被广泛应用于生物传感器,特别是葡萄糖生物传感器，包括各种一次性血糖检测试纸条和持续葡萄糖监测系统，例如雅培糖尿病护理的FreeStyle Libre和FreeStyle Libre 2。通过对氧化还原高分子的分子设计和优化，葡萄糖的检测可以在50~100毫伏下进行。虽然持续葡萄糖监测系统的抗干扰能力得到了改善，但由于氧化还原高分子对抗坏血酸的电化学催化氧化作用，在此电位下，抗坏血酸的干扰非常严重。另外，由于氧化还原高分子为高分子材料，制备难于得到精确的控制，给动态血糖仪的性能带来不确定性。更重要的是这些氧化还原高分子必须与葡萄糖氧化酶进行相当程度的化学交联以后，才能够形成葡萄糖氧化酶所需的酶线。这一方面大大缩短了葡萄糖氧化酶溶液的使用寿命，无形中增加了动态血糖仪的生产成本。更为严重的是，随着使用时间的增加，化学交联反应越来越多，葡萄糖氧化酶溶液的粘度也越来越大，从而严重地影响到产品的一致性。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明在于提供葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法，该方法将葡萄糖氧化酶重组到带有电子传递接力点的黑磷纳米片上，成功地研制出了极低氧化还原电位的葡萄糖氧化酶的直接电化学。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：葡萄糖氧化酶的制备方法，包括如下步骤：
A）、葡萄糖氧化酶的脱辅基化：
A1）、将葡萄糖氧化酶溶于3~7mol/L的硫酸铵溶液中进行培养，然后进行离心分离；
A2）、弃上层离心液，沉淀溶于0.1~2mol/L的醋酸钠溶液中，并将醋酸钠溶液加入至3~7mol/L的硫酸铵溶液中进行培养，然后进行离心分离，重复该步骤多次；
A3）、弃上层离心液，用12~36mmol/L的第一磷酸缓冲溶液清洗沉淀物，然后将沉淀物在0.01~0.1mol/L的第二磷酸缓冲溶液中进行透析，最后进行干燥，得到脱辅基化的葡萄糖氧化酶；
B）、金属络合物与黑磷纳米片的偶联：
B1）、将黑磷纳米片和对叠氮苯甲酸加入至N，N-二甲基甲酰胺中进行混合，通氩气除氧，在剧烈搅拌下，室温反应1~5小时后，将温度升高至120~150℃，继续反应36~72小时；其中，所述黑磷纳米片和所述对叠氮苯甲酸的重量比为（0.1~1）：（0.5~5）；
B2）、将步骤B1）得到的反应液进行离心分离，并将得到的固态物分散在异丙醇中，再次离心分离，反复多次进行提纯；
B3）、在黑磷纳米片上接入电子传递接力点：将提纯后的羧基化的黑磷纳米片、带有游离氨基和羧基的金属络合物、碳化二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺进行混合反应；其中，所述提纯后的羧基化的黑磷纳米片、所述金属络合物、所述碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.1~2）：（0.01~0.5）：（0.05~0.3）：（0.001~0.1）；
B4）、反应结束后，再次离心分离，弃上层离心液，并清洗沉淀物，得到偶联后的黑磷纳米片；
C）、葡萄糖氧化酶的重组：
C1）、将偶联后的黑磷纳米片、N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入至磷酸缓冲溶液中进行反应；其中，所述N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸、所述碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（10~200）：（20~120）：（5~20）；
C2）、反应结束后，进行离心分离和清洗纯化，得到带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片；
C3）、将脱辅基化的葡萄糖氧化酶、带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片加入至HEPES缓冲溶液中进行培养；
C4）、培养结束后，加入硼氢化钠，继续进行反应；所述脱辅基化的葡萄糖氧化酶、所述带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片和所述硼氢化钠的重量比为（0.1~2）：（0.5~5）：（0.1~3）；
C5）、反应结束后，进行离心分离，并对沉淀物进行清洗和离心分离。
作为优选，在步骤A1）和步骤A2）中，所述硫酸铵的浓度均为4.5~6mol/L。
作为优选，在步骤A3）中，第一磷酸缓冲溶液的浓度为18~27mmol/L，第二磷酸缓冲溶液的浓度为0.03~0.08mol/L。
作为优选，在步骤B1）中，所述黑磷纳米片和所述对叠氮苯甲酸的重量比为（0.3~0.6）：（2.6~3.5）。
作为优选，在步骤B3）中，所述金属络合物中的金属包括铜、铁、镍、钌、或锇。
作为优选，在步骤B3）中，所述提纯后的羧基化的黑磷纳米片、所述金属络合物、所述碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.5~1.2）：（0.15~0.3）：（0.1~0.22）：（0.015~0.05）。
作为优选，在步骤C1）中，所述N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸和所述碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（80~150）：（30~60）：（8~15）。
作为优选，在步骤C4）中，所述脱辅基化的葡萄糖氧化酶、所述带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片和所述硼氢化钠的重量比为（0.5~1.2）：（1.5~3）：（0.5~2）。
上述所述的葡萄糖氧化酶的制备方法制备的葡萄糖氧化酶。
葡萄糖生物传感膜，其由以下方法制备而成：将上述所述的葡萄糖氧化酶溶液涂布在玻碳电极上，待溶剂挥发后，将玻碳电极移入含有戊二醛饱和蒸汽的培养箱中进行培养10~60分钟，进而在玻碳电极上形成葡萄糖生物传感膜。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本申请将葡萄糖氧化酶通过电子传递接力点重组到黑磷纳米片上，成功地研制出了具有极低氧化还原电位的葡萄糖生物传感膜；
2、由该葡萄糖生物传感膜制备的葡萄糖生物传感器，不仅保持了对葡萄糖的催化氧化性能，而且实现了在非常低的电位（-100~0毫伏）下对葡萄糖进行监测，显著地改善了葡萄糖生物传感器的灵敏度、准确性、稳定性和专一性；
3、在持续葡萄糖监测系统的干扰物质方面，包括抗坏血酸在内的干扰物质均没有对葡萄糖生物传感器产生任何干扰。
附图说明
图1为重组在黑磷纳米片上的葡萄糖氧化酶的电子传递路径示意图；
图2为紫外-可见吸收光谱，曲线1为脱FAD辅基后的葡萄糖氧化酶的紫外-可见吸收光谱，曲线2为天然葡萄糖氧化酶的紫外-可见吸收光谱；
图3为循环伏安图，曲线1为重组到黑磷纳米片上的葡萄糖氧化酶的薄膜在PBS缓冲溶液中的循环伏安图，曲线2为加入10毫摩尔/升的葡萄糖后的循环伏安图；
图4为含有偶联了黑磷纳米片葡萄糖氧化酶的葡萄糖生物传感器在-100毫伏检测电位下的抗干扰性能（5毫摩尔/升葡萄糖）。
具体实施方式
参照附图对本发明做进一步说明。
为了提高持续葡萄糖监测系统的准确性和抗干扰能力，并延长持续葡萄糖监测系统的使用寿命，同时大大地降低葡萄糖生物传感器的制作成本，我们将葡萄糖氧化酶重组到含有电子传递接力点的黑磷纳米片上，成功地研制出了极低氧化还原电位的葡萄糖氧化酶的直接电化学，也就是第三代生物传感技术，如图1所示。
实验表明：基于极低氧化还原电位葡萄糖氧化酶的直接电化学制作的葡萄糖生物传感器，不仅保持了其对葡萄糖的催化氧化性能，而且实现了在非常低的电位(-100~0毫伏)下对葡萄糖进行监测，显著地改善了葡萄糖生物传感器的灵敏度、准确性、稳定性、专一性和抗干扰能力。该葡萄糖生物传感器不仅可以用于制作持续葡萄糖监测系统所急需的高性能葡萄糖生物传感器，而且还可以应用于环保和食品工业等领域。首先，我们对葡萄糖氧化酶进行重组，具体如下所述：
葡萄糖氧化酶的制备方法，包括如下步骤：
A）、葡萄糖氧化酶的脱辅基化：
A1）、将葡萄糖氧化酶溶于3~7mol/L的硫酸铵溶液中，培养1~4小时，然后以每分钟10000~15000转的转速进行离心分离10~30分钟；优选的，硫酸铵的浓度均为4.5~6mol/L；
A2）、弃上层离心液，沉淀溶于0.1~2mol/L的醋酸钠溶液中，并将醋酸钠溶液缓慢加入至3~7mol/L硫酸铵溶液中，溶液pH为1.4，培养1~4小时，然后以每分钟10000~15000转的转速再次进行离心分离10~30分钟，重复该步骤多次；优选的，硫酸铵的浓度均为4.5~6mol/L；
A3）、弃上层离心液，用12~36mmol/L（优选的，18~27mmol/L）且pH为 7.0的磷酸缓冲溶液清洗沉淀物，然后将沉淀物在0.01~0.1mol/L（优选的，0.03~0.08mol/L）且pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析36~72小时，最后进行真空冷冻干燥，得到脱辅基化的葡萄糖氧化酶；利用分光光度法对各个组分进行分析，证实了葡萄糖氧化酶已被成功地脱去黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅基。
B）、金属络合物与黑磷纳米片的偶联：
B1）、将黑磷纳米片和对叠氮苯甲酸加入至N，N-二甲基甲酰胺中进行混合，通氩气除氧，在剧烈搅拌下，室温反应1~5小时后，将温度升高至120~150℃，继续反应36~72小时；其中，黑磷纳米片和对叠氮苯甲酸的重量比为（0.1~1）：（0.5~5）；
优选的，黑磷纳米片和对叠氮苯甲酸的重量比为（0.3~0.6）：（2.6~3.5）；
B2）、待溶液温度降到室温后，将步骤B1）得到的反应液进行离心分离，并将得到的固态物分散在异丙醇中，再次离心分离，反复多次进行提纯，得到羧基化的黑磷纳米片；
B3）、将提纯后的羧基化的黑磷纳米片与带有游离氨基和羧基的铜、铁、镍、钌、或锇络合物进行混合，并依次加入碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，混合后，在4~6℃条件下，反应12~48小时；其中，提纯后的羧基化的黑磷纳米片、金属络合物、碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.1~2）：（0.01~0.5）：（0.05~0.3）：（0.001~0.1）；
优选的，提纯后的羧基化的黑磷纳米片、金属络合物、碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.5~1.2）：（0.15~0.3）：（0.1~0.22）：（0.015~0.05）；
B4）、反应结束后，再次以每分钟10000~15000转的转速进行离心分离10~30分钟，弃上层离心液，并用5~50mmol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液清洗，得到偶联后的黑磷纳米片；经过上述处理后，游离氨基和羧基的铜、铁、镍、钌、锇等的络合物通过游离氨基被偶联在黑磷纳米片上；
C）、葡萄糖氧化酶的重组：
C1）、将偶联后的黑磷纳米片、N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入至5~50mmol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液中，并在摇床上反应36~72小时，反应温度为4~6℃；其中，N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸和碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（10~200）：（20~120）：（5~20）；
优选的，N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸和碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（80~150）：（30~60）：（8~15）；
C2）、反应结束后，进行离心分离，并用50mmol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液进行清洗纯化，得到带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片；经过上述处理后，N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸通过带有游离羧基的铜、铁、镍、钌、锇等的络合物偶联在黑磷纳米片上；
C3）、将脱辅基化的葡萄糖氧化酶、带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片加入至0.005~0.1mol/L且pH为7.2的HEPES缓冲溶液中，并在摇床上培养24~72小时，培养温度为4~6℃；
C4）、培养结束后，加入硼氢化钠，继续反应1~8小时，反应温度为4~6℃；其中，脱辅基化的葡萄糖氧化酶、带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片和硼氢化钠的重量比为（0.1~2）：（0.5~5）：（0.1~3）；
优选的，脱辅基化的葡萄糖氧化酶、带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片和硼氢化钠的重量比为（0.5~1.2）：（1.5~3）：（0.5~2）；
C5）、反应结束后，进行离心分离，并用pH为7.2的HEPES缓冲溶液对沉淀物进行多次清洗和离心分离。经过上述处理后，脱辅基的葡萄糖氧化酶被重组到含有电子传递接力点的黑磷纳米片上。
然后，将上述所述的葡萄糖氧化酶溶液涂布在玻碳电极上，待溶剂挥发后，将玻碳电极移入含有戊二醛饱和蒸汽的培养箱中进行培养10~60分钟，进而在玻碳电极上形成葡萄糖生物传感膜；将该葡萄糖生物传感膜应用在葡萄糖生物传感器上，使葡萄糖生物传感器不仅保持了其对葡萄糖的催化氧化性能，而且实现了在非常低的电位（-100~0毫伏）下对葡萄糖进行监测。
具体实施例：
实施例S1：
（1）、葡萄糖氧化酶的脱辅基化：
将2g的葡萄糖氧化酶溶于pH为1.4的5.6mol/L硫酸铵溶液中，培养2小时；然后，将得到的硫酸铵溶液倒入离心管中，以每分钟1300转的转速离心20分钟；弃上层离心液，沉淀溶于1mol/L的醋酸钠中；将醋酸钠溶液缓慢加入至5.6mol/L且pH为1.4的硫酸铵溶液中，培养2小时后，将得到的溶液倒入离心管中，以每分钟13000转的转速离心20分钟；弃上层离心液，沉淀溶于1mol/L的醋酸钠中；将醋酸钠溶液缓慢加入至5.6mol/L且pH为1.4的硫酸铵溶液中，培养2小时，然后将得到的溶液倒入离心管中，以每分钟13000转的转速离心20分钟；弃上层离心液，用20mmol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液清洗；然后，在50mmol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液中透析48小时，最后进行真空冷冻干燥；利用分光光度法对各个组分的分析，证实了葡萄糖氧化酶已被成功地脱去黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅基，如图2所示。
（2）、金属络合物与黑磷纳米片的偶联：
与此同时，我们对黑磷纳米片进行羧基化，具体如下所述：
在圆底烧瓶中加入N，N-二甲基甲酰胺，同时0.5g的黑磷纳米片与3g的对叠氮苯甲酸加入至圆底烧瓶中混合，通氩气除氧；在剧烈搅拌下，室温反应2小时后，将温度升高至140℃，继续反应48小时；待溶液温度降到室温后，离心分离，并将得到的固态物分散在异丙醇中，再次离心分离，反复5次进行提纯，得到羧基化的黑磷纳米片。
然后，将提纯后的1g的羧基化的黑磷纳米片与200mg的带有游离氨基和羧基的钌的络合物充分混合，并依次加入100mg和20mg的N-羟基琥珀酰亚胺，充分混合后，在4℃条件下，反应24小时；反应结束后，将溶液倒入离心管中，以每分钟13000转的转速离心20分钟；弃上层离心液，用20mmol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液清洗；经过上述处理后，游离氨基和羧基的钌的络合物通过游离氨基被偶联在黑磷纳米片上。
同时，钌的络合物上的游离羧基可以用来偶联氨基化的葡萄糖氧化酶的黄素腺嘌呤二核苷酸辅基，具体做法如下所述：
将偶联后的黑磷纳米片分散在20mmol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液中，并加入100mg的N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸和50mg的碳化二亚胺和10mg的N-羟基琥珀酰亚胺，在摇床上反应48小时，反应温度为4℃；反应结束后，进行离心分离，并用50mmol/L且pH为7.0的磷酸缓冲溶液清洗纯化，得到带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片；经过上述处理后，N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸通过带有游离羧基的钌的络合物偶联在黑磷纳米片上。
（3）、葡萄糖氧化酶的重组：
最后，我们将脱辅基后的葡萄糖氧化酶进行重组，使其与带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片一起培养，把葡萄糖氧化酶上的黄素腺嘌呤二核苷酸辅基重新植入到脱辅基后的葡萄糖氧化酶上，使其复原，同时引入一个高效的电子接力点。具体做法如下所述：
将1g的脱辅基化的葡萄糖氧化酶、2g的带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片加入至20mmol/L且pH为7.2的HEPES缓冲溶液中，并在摇床上培养48小时，培养温度为4℃；培养结束后，加入1g的硼氢化钠，充分混合后，继续反应2小时，反应温度为4℃；反应结束后，进行离心分离，并用pH为7.2的HEPES缓冲溶液对沉淀物进行3次清洗和离心分离。
虽然葡萄糖氧化酶经过上述一系列化学处理之后，成功地被重组到导电的纳米材料黑磷纳米片上，但是还需要确认，重组后的葡萄糖氧化酶的催化氧化葡萄糖的活性是否也得以复原。
因此，我们首先将带有重组葡萄糖氧化酶的黑磷纳米片溶液涂布在玻碳电极上，待溶剂挥发后，在戊二醛饱和蒸汽中培养30分钟，偶联了重组葡萄糖氧化酶的黑磷纳米片通过戊二醛交联形成一层稳定的膜，并固定在电极的表面，即在玻碳电极上形成葡萄糖生物传感膜。然后，利用循环伏安法在PBS缓冲溶液中对玻碳电极上的这层膜进行表征。
如图3曲线1所示，循环伏安图上的一对可逆的氧化还原峰清楚地表明，经过以上一系列的化学处理后，葡萄糖氧化酶被成功地赋予了电化学活性，而且，其氧化还原电位极低，低至-0.16伏。当在PBS缓冲溶液中加入10mmol/L的葡萄糖后，带有重组葡萄糖氧化酶的黑磷纳米片薄膜的循环伏安图清晰地表明，这层膜对葡萄糖具有良好的电化学催化作用，如图3曲线2所示，这就为开发极低氧化还原电位的葡萄糖生物传感器打下了基础。
如图3所示，葡萄糖通过偶联了黑磷纳米片重组葡萄糖氧化酶的电化学催化氧化发生在-100~-200毫伏之间，葡萄糖的检测电位可以在-100~100毫伏的任何电位。如图4所示，当我们把葡萄糖的检测电位定在-100毫伏时，在持续葡萄糖监测系统的干扰物质方面，包括抗坏血酸在内的干扰物质均没有对葡萄糖生物传感器产生任何干扰，这是迄今为止，干扰最少的且可用于动态血糖仪的葡萄糖生物传感器。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A）、葡萄糖氧化酶的脱辅基化：
A1）、将葡萄糖氧化酶溶于3~7mol/L的硫酸铵溶液中进行培养，然后进行离心分离；
A2）、弃上层离心液，沉淀溶于0.1~2mol/L的醋酸钠溶液中，并将醋酸钠溶液加入至3~7mol/L的硫酸铵溶液中进行培养，然后进行离心分离，重复该步骤多次；
A3）、弃上层离心液，用12~36mmol/L的第一磷酸缓冲溶液清洗沉淀物，然后将沉淀物在0.01~0.1mol/L的第二磷酸缓冲溶液中进行透析，最后进行干燥，得到脱辅基化的葡萄糖氧化酶；
B）、金属络合物与黑磷纳米片的偶联：
B1）、将黑磷纳米片和对叠氮苯甲酸加入至N，N-二甲基甲酰胺中进行混合，通氩气除氧，在剧烈搅拌下，室温反应1~5小时后，将温度升高至120~150℃，继续反应36~72小时；其中，所述黑磷纳米片和所述对叠氮苯甲酸的重量比为（0.1~1）：（0.5~5）；
B2）、将步骤B1）得到的反应液进行离心分离，并将得到的固态物分散在异丙醇中，再次离心分离，反复多次进行提纯；
B3）、在黑磷纳米片上接入电子传递接力点：将提纯后的羧基化的黑磷纳米片、带有游离氨基和羧基的金属络合物、碳化二亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺进行混合反应；其中，所述提纯后的羧基化的黑磷纳米片、所述金属络合物、所述碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.1~2）：（0.01~0.5）：（0.05~0.3）：（0.001~0.1）；
B4）、反应结束后，再次离心分离，弃上层离心液，并清洗沉淀物，得到偶联后的黑磷纳米片；
C）、葡萄糖氧化酶的重组：
C1）、将偶联后的黑磷纳米片、N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入至磷酸缓冲溶液中进行反应；其中，所述N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸、所述碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（10~200）：（20~120）：（5~20）；
C2）、反应结束后，进行离心分离和清洗纯化，得到带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片；
C3）、将脱辅基化的葡萄糖氧化酶、带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片加入至HEPES缓冲溶液中进行培养；
C4）、培养结束后，加入硼氢化钠，继续进行反应；所述脱辅基化的葡萄糖氧化酶、所述带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片和所述硼氢化钠的重量比为（0.1~2）：（0.5~5）：（0.1~3）；
C5）、反应结束后，进行离心分离，并对沉淀物进行清洗和离心分离。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤A1）和步骤A2）中，所述硫酸铵的浓度均为4.5~6mol/L。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤A3）中，第一磷酸缓冲溶液的浓度为18~27mmol/L，第二磷酸缓冲溶液的浓度为0.03~0.08mol/L。
4.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤B1）中，所述黑磷纳米片和所述对叠氮苯甲酸的重量比为（0.3~0.6）：（2.6~3.5）。
5.根据权利要求4所述的葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤B3）中，所述金属络合物中的金属包括铜、铁、镍、钌、或锇。
6.根据权利要求4所述的葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤B3）中，所述提纯后的羧基化的黑磷纳米片、所述金属络合物、所述碳化二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（0.5~1.2）：（0.15~0.3）：（0.1~0.22）：（0.015~0.05）。
7.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤C1）中，所述N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸和所述碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为（80~150）：（30~60）：（8~15）。
8.根据权利要求7所述的葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，在步骤C4）中，所述脱辅基化的葡萄糖氧化酶、所述带有N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸的黑磷纳米片和所述硼氢化钠的重量比为（0.5~1.2）：（1.5~3）：（0.5~2）。
9.权利要求1~8中任一项所述的葡萄糖氧化酶的制备方法制备的葡萄糖氧化酶。
10.葡萄糖生物传感膜，其特征在于，其由以下方法制备而成：将权利要求9所述的葡萄糖氧化酶溶液涂布在玻碳电极上，待溶剂挥发后，将玻碳电极移入含有戊二醛饱和蒸汽的培养箱中进行培养10~60分钟，进而在玻碳电极上形成葡萄糖生物传感膜。
CN202210058461.9A 2022-01-19 2022-01-19 葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法 Active CN114088790B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210058461.9A CN114088790B (zh) 2022-01-19 2022-01-19 葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210058461.9A CN114088790B (zh) 2022-01-19 2022-01-19 葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114088790A true CN114088790A (zh) 2022-02-25
CN114088790B CN114088790B (zh) 2022-04-19

Family

ID=80308519

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210058461.9A Active CN114088790B (zh) 2022-01-19 2022-01-19 葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114088790B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606210A (zh) * 2022-03-17 2022-06-10 苏州中星医疗技术有限公司 葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法
CN114609214A (zh) * 2022-03-17 2022-06-10 苏州中星医疗技术有限公司 还原型生物传感器、过氧化氢传感膜及其制备方法
CN115236158A (zh) * 2022-09-21 2022-10-25 苏州中星医疗技术有限公司 葡萄糖生物传感器、MXene纳米片及其制备方法
CN116287133A (zh) * 2023-05-16 2023-06-23 苏州中星医疗技术有限公司 核糖核酸生物传感器、及其制备方法和应用
CN116334317A (zh) * 2023-05-26 2023-06-27 苏州中星医疗技术有限公司 一种核糖核酸生物传感器及其制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108144059A (zh) * 2017-11-30 2018-06-12 中南大学 一种二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料及其制备方法和作为抗菌试剂的应用
CN110592171A (zh) * 2019-08-23 2019-12-20 江苏大学 一种新型固定化氧化还原酶电极及其制备方法
CN110907249A (zh) * 2019-12-13 2020-03-24 青岛农业大学 一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法
CN111870693A (zh) * 2020-08-12 2020-11-03 中国药科大学 一种黑磷促进精氨酸快速释放no的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108144059A (zh) * 2017-11-30 2018-06-12 中南大学 一种二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料及其制备方法和作为抗菌试剂的应用
CN110592171A (zh) * 2019-08-23 2019-12-20 江苏大学 一种新型固定化氧化还原酶电极及其制备方法
CN110907249A (zh) * 2019-12-13 2020-03-24 青岛农业大学 一种基于复合纳米酶系统的葡萄糖检测方法
CN111870693A (zh) * 2020-08-12 2020-11-03 中国药科大学 一种黑磷促进精氨酸快速释放no的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHENGCHENG GU 等: "Glucose Dehydrogenase-like Nanozyme Based on Black Phosphorus Nanosheets for High-Performance Biofuel Cells", 《ACS SUSTAINABLE CHEM. ENG.》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114606210A (zh) * 2022-03-17 2022-06-10 苏州中星医疗技术有限公司 葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法
CN114609214A (zh) * 2022-03-17 2022-06-10 苏州中星医疗技术有限公司 还原型生物传感器、过氧化氢传感膜及其制备方法
CN115236158A (zh) * 2022-09-21 2022-10-25 苏州中星医疗技术有限公司 葡萄糖生物传感器、MXene纳米片及其制备方法
CN115236158B (zh) * 2022-09-21 2022-12-13 苏州中星医疗技术有限公司 葡萄糖生物传感器、MXene纳米片及其制备方法
CN116287133A (zh) * 2023-05-16 2023-06-23 苏州中星医疗技术有限公司 核糖核酸生物传感器、及其制备方法和应用
CN116334317A (zh) * 2023-05-26 2023-06-27 苏州中星医疗技术有限公司 一种核糖核酸生物传感器及其制备方法
CN116334317B (zh) * 2023-05-26 2023-08-08 苏州中星医疗技术有限公司 一种核糖核酸生物传感器及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114088790B (zh) 2022-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114088790B (zh) 葡萄糖生物传感膜、葡萄糖氧化酶及其制备方法
Heller et al. Electrochemical glucose sensors and their applications in diabetes management
Schuhmann Electron-transfer pathways in amperometric biosensors. Ferrocene-modified enzymes entrapped in conducting-polymer layers
Dzyadevych et al. Amperometric enzyme biosensors: Past, present and future
Linke et al. Amperometric biosensor for in vivo glucose sensing based on glucose oxidase immobilized in a redox hydrogel
US20140216931A1 (en) Electron-Conducting Crosslinked Polyaniline-Based Redox Hydrogel, and Method of Making
EP0601720A1 (en) Techniques to improve the performance of electrochemical sensors
JP2021516764A (ja) バイオセンシングフィルムの製造方法、バイオセンシングフィルム及び監視装置
CN113317785B (zh) 一种选择性渗透的生物相容性膜及其制备方法与应用
JP7324871B2 (ja) 電気化学的バイオセンサ用センシング膜、電気化学的バイオセンサ
JPH05506102A (ja) 溶液中の成分の量を測定するセンサ
CN114606210A (zh) 葡萄糖传感器、葡萄糖脱氢酶及其制备方法
CN113717955A (zh) 葡萄糖生物传感器及其葡萄糖传感膜、葡萄糖脱氢酶
CN114152656A (zh) 一种葡萄糖生物传感器
CN114152657A (zh) 提高电化学活性的氧化还原酶及含有该氧化还原酶的生物传感器
Pan et al. Biomolecule-friendly conducting PEDOT interface for long-term bioelectronic devices
CN115236158B (zh) 葡萄糖生物传感器、MXene纳米片及其制备方法
Feng et al. A long-term stable and flexible glucose sensor coated with poly (ethylene glycol)-modified polyurethane
Hou et al. An amperometric enzyme electrode for glucose using immobilized glucose oxidase in a ferrocene attached poly (4-vinylpyridine) multilayer film
CN102954994A (zh) 一种具备抗干扰功能的生物电化学池
Wang et al. Achieving Nonenzymatic Blood Glucose Sensing by Uprooting Saturation
CN113717607B (zh) 生物相容性膜及其嵌段聚合物、应用
Zhang et al. Online electrochemical systems for continuous neurochemical measurements with low-potential mediator-based electrochemical biosensors as selective detectors
Iwuoha et al. Polymer-based amperometric biosensors
CN114149718B (zh) 生物传感器的成膜组合物及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 502, building 2, No. 188, Fuchunjiang Road, high tech Zone, Suzhou, Jiangsu 215000

Applicant after: Suzhou Zhongxing Medical Technology Co.,Ltd.

Address before: Room 309, B2 building, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu 215000

Applicant before: Suzhou Zhongxing Medical Technology Co.,Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant