CN116334317B - 一种核糖核酸生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核糖核酸生物传感器及其制备方法，制备方法包括如下步骤：1）将金电极在硫醇化寡核苷酸的捕获探针溶液中培养；2）将培养后的金电极、100~500重量份的N6‑（6‑氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸、40~200重量份的碳化二亚胺和5~50重量份的N‑羟基硫代琥珀酰亚胺进行混合反应，反应结束后，清洗金电极，得到生物传感器。本发明研制出了基于电化学检测的高灵敏度核糖核酸生物传感器，通过室温条件下核酸酶和葡萄糖脱氢酶的协同放大，提高了检测的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种核糖核酸生物传感器及其制备方法。
背景技术
目前有两种主要的新型冠状病毒检测方法：抗原检测和以聚合酶链反应 （PCR）为基础的实时荧光定量PCR。抗原检测以其快速方便等特点，非常适合家庭自检，但是，现阶段只能作为一种辅助手段。新型冠状病毒检测的“黄金标准”是实时荧光定量PCR，其严苛的样品处理和检测设备要求，使新型冠状病毒检测只能在基础设施完善的中心实验室进行。另外，电化学检测和电化学生物传感器以其体积小、响应快、使用方便等特点非常适合家庭自检，如血糖仪，但是其灵敏度需要得到大大的提高。
发明内容
在一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种核糖核酸生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
1）将金电极在硫醇化寡核苷酸的捕获探针溶液中培养2~24小时；
2）将培养后的金电极、100~500重量份的N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸、40~200重量份的碳化二亚胺和5~50重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行混合反应1~10小时，反应结束后，清洗金电极，得到生物传感器；
在检测时，将所述生物传感器放入0.000001~0.0001重量份的总核糖核酸样品溶液中，于20~30℃条件下培养10~60分钟，培养结束后，得到生物传感器A，将生物传感器A在含有0.000001~0.00005重量份的Surveyor®和0.000001~0.00005重量份的核酸酶I的磷酸缓冲溶液中培养5~30分钟，温度为20~40℃，得到生物传感器B；最后，将生物传感器B放入含有50~500mmol/L的葡萄糖和0.01~0.5重量份的去辅基葡萄糖脱氢酶中进行检测葡萄糖的电化学催化氧化电流。
作为优选，所述捕获探针包括5’-SH-AACTATACAACCTACTACCTCA-COOH-3’、 5’-SH-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-COOH-3’、或5’-SH-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-COOH-3’。
作为优选，在步骤1）中，所述金电极的直径为0.2~5mm。
作为优选，在步骤2）中，所述N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，150~300重量份；所述碳化二亚胺，80~150重量份；所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺，10~30重量份。
作为优选，所述总核糖核酸样品溶液，0.00001~0.00005重量份。
作为优选，所述Surveyor®，0.000005~0.00002重量份；所述核酸酶I，0.000005~0.00002重量份。
作为优选，所述葡萄糖的浓度为80~150mmol/L；所述去辅基葡萄糖脱氢酶，0.05~0.3重量份。
在另一个方面，上述所述的核糖核酸生物传感器的制备方法所制备的核糖核酸生物传感器。
在另一个方面，上述所述的核糖核酸生物传感器在检测新型冠状病毒中的应用。
本发明成功地研制出了基于电化学检测的高灵敏度核糖核酸生物传感器，通过室温条件下葡萄糖脱氢酶和电化学催化的协同放大，使检测灵敏度大大提高。
附图说明
图1为含有重组葡萄糖脱氢酶的核糖核酸生物传感器的结构示意图；
图2为核糖核酸生物传感器的工作原理图；
图3为电流响应曲线和工作曲线图；A为微核糖核酸let-7a生物传感器在0纳克（曲线1）和25纳克（曲线2）总核糖核酸中的电流响应曲线；B为微核糖核酸let-7a生物传感器的工作曲线图；
图4为GAPDH信使核糖核酸生物传感器在0纳克（曲线1）和25纳克（曲线2）总核糖核酸中的电流响应曲线；
图5为新型冠状病毒核糖核酸生物传感器在0纳克（曲线1）和25纳克（曲线2）总核糖核酸中的电流响应曲线。
具体实施方式
参照附图对本发明做进一步说明。
首先我们对葡萄糖脱氢酶进行去辅基化。具体做法是：将100~5000重量份的葡萄糖脱氢酶溶于pH 4.5的0.1M的醋酸缓冲溶液中，然后将该溶液倒入透析袋中，切割分子量：500~30000，在1~20℃条件下，于1~4.5M的溴化钾中透析24~150小时，然后在pH7.0的0.005~0.1M磷酸缓冲溶液中透析12~72小时。
本实施例公开了一种核糖核酸生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
1）将金电极在0.01~0.5重量份的硫醇化寡核苷酸（还携带有末端羧基）的捕获探针溶液中培养2~24小时，用水清洗1~5次；金电极的直径为0.2~5毫米；
2）将培养后的金电极、100~500重量份的N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸、40~200重量份的碳化二亚胺和5~50重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行混合反应1~10小时，反应结束后，用磷酸缓冲溶液清洗金电极1~5次，得到生物传感器；优选的，N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，150~300重量份；碳化二亚胺，80~150重量份；N-羟基硫代琥珀酰亚胺，10~30重量份；
在检测时，将生物传感器放入0.000001-0.0001重量份的总核糖核酸样品溶液中，于20~30℃条件下培养10~60分钟，培养结束后，得到生物传感器A，将生物传感器A在含有0.000001~0.00005重量份的Surveyor®和0.000001~0.00005重量份的核酸酶I的磷酸缓冲溶液中培养5~30分钟，温度为20~40℃，得到生物传感器B；最后，将生物传感器B放入含有50~500mmol/L的葡萄糖和0.01~0.5重量份的去辅基葡萄糖脱氢酶中进行检测葡萄糖的电化学催化氧化电流。优选的，总核糖核酸样品溶液，0.00001-0.00005重量份；Surveyor®，0.000005~0.00002重量份；核酸酶I，0.000005~0.00002重量份；葡萄糖的浓度为80~150mmol/L；去辅基葡萄糖脱氢酶，0.05~0.3重量份。
上述技术方案中，捕获探针包括5’-SH-AACTATACAACCTACTACCTCA-COOH-3’、 5’-SH-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-COOH-3’、或5’-SH-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-COOH-3’。
上述所述的核糖核酸生物传感器的制备方法所制备的核糖核酸生物传感器。
上述所述的核糖核酸生物传感器在检测新型冠状病毒中的应用。具体实施例如下所示：
对葡萄糖脱氢酶进行去辅基化：将1g的葡萄糖脱氢酶溶于pH4.5的0.1M的醋酸缓冲溶液中，然后将该溶液倒入透析袋中，切割分子量为10000，在4℃环境中，在3M的溴化钾中透析96小时，然后在pH7.0的0.05M磷酸缓冲溶液中透析48小时。
核糖核酸生物传感器的制备：金电极（1毫米直径）在0.05mg的硫醇化寡核苷酸（还携带末端羧基）捕获探针溶液中培养12小时后，用水清洗3次，然后放入200mg的N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，100mg的碳化二亚胺和25mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺，在摇床上4℃反应4小时，反应完成后，电极用pH7.0的0.05M磷酸缓冲溶液清洗3次。经过上述处理后，N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸偶联在了寡核苷酸上，制成核糖核酸生物传感器。其工作原理如图2所示。在传感器上的捕获探针与核糖核酸样品杂交以后，多余的没有杂交的捕获探针被核酸酶I消化掉，与捕获探针错配的核糖核酸被Surveyor®消化掉，在传感器上只剩下完全匹配的核糖核酸，当将此生物传感器放入含有葡萄糖和去辅基葡萄糖脱氢酶溶液中时，捕获探针末端的黄素腺嘌呤二核苷酸辅基与去辅基葡萄糖脱氢酶重组，嵌入到去辅基葡萄糖脱氢酶中，使其还原为原始的葡萄糖脱氢酶；然后，在外加电压下，与金电极进行直接的电子交换，产生与核糖核酸浓度有直接关系的葡萄糖氧化电流，如图1所示。
核糖核酸的检测：将 5’-SH-AACTATACAACCTACTACCTCA-COOH-3作为捕获探针（序列：AACTATACAACCTACTACCTCA，记为SEQ ID NO 1），制成核糖核酸生物传感器，这个生物传感器就成了对微核糖核酸let-7a具有高度选择性和灵敏性的生物传感器。将此生物传感器在25纳克的总核糖核酸样品溶液中，在25℃条件下培养30分钟，然后在含有10纳克Surveyor®和10纳克的核酸酶I的0.05mol/L的pH7.4的磷酸缓冲溶液中，在30℃条件下培养10分钟，最后，将处理过的生物传感器放入含有100mmol/L的葡萄糖和0.1mg的去辅基葡萄糖脱氢酶中，捕获探针末端的黄素腺嘌呤二核苷酸辅基与去辅基葡萄糖脱氢酶重组，嵌入到去辅基葡萄糖脱氢酶中，使其还原为原始的葡萄糖脱氢酶，实现葡萄糖脱氢酶的直接电化学，电化学催化葡萄糖的氧化，在100mV检测葡萄糖的电化学催化氧化电流 (如图3中A部分所示)。
实验发现，这个微核糖核酸let-7a生物传感器的电流信号与10~200纳克总核糖核酸样品中的微核糖核酸let-7a成线性关系（如图3中B部分所示）。
若将5’-SH-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-COOH-3’ （序列：TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG，记为SEQ ID NO 2）做为捕获探针，经过上述处理后，得到GAPDH信使核糖核酸生物传感器，对GAPDH信使核糖核酸具有非常灵敏的响应（如图4所示）。
最后，若将5’-SH-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-COOH-3’ （序列：TTGCTGCTGCTTGACAGATT，记为SEQ ID NO 3）做为捕获探针，经过上述处理后，得到新型冠状病毒核糖核酸生物传感器，总核糖核酸中的新型冠状病毒的核糖核酸可以被检出（如图5所示）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种核糖核酸生物传感器的制备方法，其特征是：包括如下步骤：
1）将金电极在硫醇化寡核苷酸的捕获探针溶液中培养2~24小时；
2）将培养后的金电极、100~500重量份的N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸、40~200重量份的碳化二亚胺和5~50重量份的N-羟基硫代琥珀酰亚胺进行混合反应1~10小时，反应结束后，清洗金电极，得到生物传感器；
在检测时，将所述生物传感器放入0.000001~0.0001重量份的总核糖核酸样品溶液中，于20~30℃条件下培养10~60分钟，培养结束后，得到生物传感器A，将生物传感器A在含有0.000001~0.00005重量份的Surveyor®和0.000001~0.00005重量份的核酸酶I的磷酸缓冲溶液中培养5~30分钟，温度为20~40℃，得到生物传感器B；最后，将生物传感器B放入含有50~500mmol/L的葡萄糖和0.01~0.5重量份的去辅基葡萄糖脱氢酶中进行检测葡萄糖的电化学催化氧化电流。
2.根据权利要求1所述的核糖核酸生物传感器的制备方法，其特征是：所述捕获探针包括5’-SH-AACTATACAACCTACTACCTCA-COOH-3’、 5’-SH-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-COOH-3’或5’-SH-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-COOH-3’。
3.根据权利要求1所述的核糖核酸生物传感器的制备方法，其特征是：在步骤1）中，所述金电极的直径为0.2~5mm。
4.根据权利要求3所述的核糖核酸生物传感器的制备方法，其特征是：在步骤2）中，所述N6-（6-氨基己基）黄素腺嘌呤二核苷酸，150~300重量份；所述碳化二亚胺，80~150重量份；所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺，10~30重量份。
5.根据权利要求4所述的核糖核酸生物传感器的制备方法，其特征是：所述总核糖核酸样品溶液，0.00001~0.00005重量份。
6.根据权利要求5所述的核糖核酸生物传感器的制备方法，其特征是：所述Surveyor®，0.000005~0.00002重量份；所述核酸酶I，0.000005~0.00002重量份。
7.根据权利要求6所述的核糖核酸生物传感器的制备方法，其特征是：所述葡萄糖的浓度为80~150mmol/L；所述去辅基葡萄糖脱氢酶，0.05~0.3重量份。
8.权利要求1~7中任一项所述的核糖核酸生物传感器的制备方法所制备的核糖核酸生物传感器。
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