CN114235916B - 电化学生物传感器及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器及其制备方法与应用。本发明的microRNA电化学生物传感器包括工作电极和连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2‑Au Pd分散液；所述工作电极包括玻碳电极和修饰在玻碳电极表面的Ti3C2‑rGO‑Au纳米复合材料，所述Ti3C2‑rGO‑Au纳米复合材料连接有DNA捕获探针。本发明制备microRNA电化学生物传感器的方法简单，价格低廉，易于控制；所制备的生物传感器具备较宽线性范围和较低的检测限，优异的特异性和真实样品适用性等特点。
Description
技术领域
本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器及其制备方法与应用。
技术背景
微小RNA(microRNA)是一类由18-22个核苷酸组成的内源性非编码RNA 分子，通过抑制转录而调节蛋白编码基因的表达，microRNA组织特异性强，容易放大信号通路，能被反复冷冻、解冻，且以一个非常稳定的形式存在于体液中，其临床检测可操作性强。根据最新的报道，某些种类的microRNA与人类的疾病有着密切的联系，microRNA-21就是其中的一种。现有的研究表明，急性肾损伤患者尿液中的microRNA-21含量会急剧上升，这意味着其可用作检测AKI的尿液生物标志物。
目前有多种检测miRNA的方法，如Northern印迹，定量逆转录酶-聚合酶链反应(qRT-PCR)、滚环扩增和微阵列等；但是这些技术较为耗时且价格昂贵，具有交叉污染和操作复杂性的高风险，存在灵敏度低且特异性差等问题。 CN109706225A公开了一种基于滚环扩增介导的钯纳米颗粒对microRNA的电化学检测方法，检测过程复杂，线性范围较窄，且需要用酶催化实验操作复杂。电化学生物传感器因使用简便，测定时间短，所需样品量少，高灵敏度，高精度和低成本等优势而收到广泛的关注。
发明内容
本发明针对现有技术的不足之处，提供了一种基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器，该传感器具备较宽线性范围和较低的检测限，优异的特异性和真实样品适用性等特点。
本发明的目的通过以下技术方案实施实现：
基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器，包括工作电极和连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液；所述工作电极包括玻碳电极和修饰在玻碳电极表面的Ti3C2-rGO-Au纳米复合材料，所述Ti3C2- rGO-Au纳米复合材料连接有DNA捕获探针。
优选的，所述DNA捕获探针5′端修饰巯基，通过金硫键与Ti3C2-rGO-Au相连接，同时DNA捕获探针含有能够与microRNA杂交的序列；
优选的，所述DNA信号探针3′端修饰巯基，通过金硫键与Ti3C2-Au Pd相连接，同时DNA信号探针含有能够与microRNA杂交的序列；
优选的，所述连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液的浓度为 0.8-1.2mg/mL。
优选的，所述microRNA为microRNA-21；
优选的，所述DNA捕获探针由5′端到3′端的序列为5′-(SH)TCAACATCAGT- 3′；
优选的，所述DNA信号探针由5′端到3′端的序列为5′-CTGATAAGCTA(SH)- 3′；
优选的，所述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器还包括参比电极、对电极；进一步优选的，所述参比电极为Ag/AgCl，所述对电极为铂丝。
上述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将Ti3C2纳米材料分散在去离子水中，超声处理，得到Ti3C2分散液；
(2)将步骤(1)制备得到的Ti3C2分散液中加入还原石墨烯超声使其分散，再加入HAuCl4溶液，室温下反应，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在去离子水中，得到Ti3C2-rGO-Au分散液；
(3)将步骤(2)制备得到的Ti3C2-rGO-Au分散液滴加在玻碳电极的表面，在空气中静置2-3小时后，得到Ti3C2-rGO-Au纳米复合材料修饰的玻碳电极；
(4)将步骤(3)制备得到的Ti3C2-rGO-Au纳米复合材料修饰的玻碳电极与DNA捕获探针溶液在0-5摄氏度下孵育10-14小时，然后与封闭剂孵育，得到工作电极；
(5)将步骤(1)制备得到的Ti3C2分散液中加入HAuCl4溶液和H2PdCl4溶液，室温下反应，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在去离子水中，得到Ti3C2-Au Pd分散液；
(6)将步骤(5)制备得到的Ti3C2-Au Pd分散液中加入DNA信号探针溶液在0-5摄氏度反应10-14小时后，再加入Thi溶液在0-5摄氏度反应10-14小时，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液中，得到连接有Thi和 DNA信号探针Ti3C2-Au Pd分散液。
优选的，步骤(1)中所述Ti3C2纳米材料与去离子水的质量体积比为3-10mg： 4-12mL；步骤(1)所述Ti3C2纳米材料为二维层状结构，层数为1-3层；步骤 (1)所述超声处理的时间为30-50分钟；
优选的，步骤(2)中所述Ti3C2分散液与还原石墨烯的体积质量比为1:2- 2:1，所述HAuCl4溶液与Ti3C2分散液的体积比为1:12-1:15；所述HAuCl4溶液的摩尔浓度为40-55mM；所述反应时间为20-40分钟；所述离心洗涤采用的是去离子水，次数为3-5次。
优选的，步骤(3)中，所述玻碳电极需经过预处理，预处理的步骤如下：将玻碳电极在Al2O3抛光粉上呈“8”字形研磨直至表面光亮，并在去离子水中超声10-30分钟后，用氮气将其表面吹干，得到玻碳电极；所述Ti3C2-rGO-Au分散液的用量与电极的表面积比值为8-10μL:7mm2；
优选的，步骤(4)中，所述DNA捕获探针溶液的浓度为0.5-3μM；所述封闭剂为MCH溶液，浓度为0.1-1.5mM。
优选的，步骤(5)中，所述HAuCl4溶液：H2PdCl4溶液：Ti3C2分散液的体积比为1:2:24-1:3:30；所述HAuCl4溶液的摩尔浓度为40-55mM；所述H2PdCl4溶液的摩尔浓度为10-25mM；所述反应时间为20-40分钟；所述离心洗涤采用的是去离子水，次数为3-5次；
优选的，步骤(6)中，所述Ti3C2-Au Pd分散液与DNA信号探针溶液的体积比为1:2-3:1；所述Thi溶液与Ti3C2-Au Pd分散液的体积比为1:3-1:1；所述DNA 信号探针溶液的浓度为0.5-3μM；所述Thi溶液的浓度为2-5mM；所述离心洗涤采用的是去离子水，次数为3-5次；所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为7-9。
上述的基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器在 microRNA检测中的应用，包括以下步骤：
(A)将所述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的工作电极与待测溶液孵育30-90分钟；然后与所述连接有Thi和DNA的信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液孵育90-150分钟；
(B)打开电化学工作站，将步骤(A)所述基于Ti3C2基纳米复合材料的 microRNA电化学生物传感器在室温下进行电化学实验，在缓冲溶液中进行，采用差分脉冲伏安法进行测试得到电流，根据电流、浓度曲线，计算待测溶液中 microRNA的浓度。
优选的，步骤(B)中，所述差分脉冲伏安法的电压范围是(-0.6)-0.1V。
优选的，所述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器在加入microRNA溶液后电流响应时间为30-60s，所述工作电极在1fM-1nM的浓度范围内表现出电化学响应；
优选的，所述microRNA为microRNA-21时，线性关系曲线为 y＝8.165x+152.903，R2＝0.994，灵敏度为0.418fM，其中，x为microRNA-21浓度/M取对数后的数值，y为电流/μA。
本发明的有益效果为：
1.本发明通过Ti3C2(MXene)的自还原作用制备得到了Ti3C2(MXene)-rGO-Au 和Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料，用于制备microRNA电化学生物传感器，合成方法简单，价格低廉有，易于控制。
2.本发明所制备的生物传感器具备较宽线性范围和较低的检测限，优异的特异性和真实样品适用性等特点。
附图说明
图1是本发明基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备和工作原理图；
图2是实施例1制备的Ti3C2(MXene)-rGO-Au(A)和Ti3C2(MXene)-Au Pd (B)纳米复合材料的透射电子显微镜图；
图3是实施例1制备的基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器与不同浓度的DNA捕获探针结合时测得的电流响应；
图4是实施例2制备的基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器与不同浓度的DNA信号探针结合时测得的电流响应；
图5是实施例3制备的基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器在不同浓度microRNA-21条件下测得的差分脉冲伏安法(DPV) 曲线与校准曲线；
图6是实施例4制备的基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器在与不同序列的RNA结合时的差分脉冲伏安法(DPV)曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下通过具体的实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的技术方案用于检测microRNA；本发明基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备和工作原理图如图1所示；
以下实施例以microRNA-21为例进行说明；
实施例中的探针序列及microRNA-21如下表1
表1
实施例1
基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤：
(1)工作电极的制备
Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的的制备
Ti3C2(MXene)-rGO-Au通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：
将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；将5mg的rGO纳米材料加入Ti3C2(MXene)分散液，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)-rGO分散液，然后加入350μL浓度为48.56mM的HAuCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料。本实施例制备的Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料的透射电子显微镜图如图2 中的A所示。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在Al2O3抛光粉上呈“8”字形研磨直至表面光亮，并在去离子水中超声10分钟后，用氮气将其表面吹干，得到玻碳电极；用移液枪吸取10μL上述制备的Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料，滴加在打磨光滑的玻碳电极表面，在空气中静置2小时，得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au修饰的玻碳电极，将上述制备得到的电极与分别与不同浓度(0.5μM、1.0μM、1.5μM、 2.0μM、2.5μM)的DNA捕获探针(CP)溶液(DNA捕获探针溶解在pH为8的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在4摄氏度下孵育12个小时后，与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时，封闭未结合单独活性位点。
(2)连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液的制备
Ti3C2(MXene)-Au Pd通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：
将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；然后同时加入175μL浓度为48.56mM的HAuCl4溶液和425μL浓度为20mM的H2PdCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料。本实施例制备的Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料的透射电子显微镜图如图2中的B所示。
连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液制备方法如下：
取500μL上述制备得到的Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料分散液，加入 250μL浓度为2μM的DNA信号探针溶液(DNA信号探针溶解在pH为8的Tris- HCl缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液)，在4摄氏度下反应12小时后，加入500μL浓度为3mM的Thi溶液，再在4摄氏度下反应12小时,离心洗涤后收集沉淀，重新分散在500μL的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，制备得到连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2(MXene)-Pd修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系，其中铂丝电极做为对电极，Ag/AgCl做为参比电极，构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
工作电极与浓度为100fM的microRNA-21在37摄氏度下孵育1小时，然后与连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液在37摄氏度下孵育2小时。
打开电化学工作站，在室温下进行电化学实验，在0.01M PBS缓冲溶液中进行，采用差分脉冲伏安法，差分脉冲伏安法的电压范围是(-0.6)-0.1V。
本实施例制备的电化学生物传感器与不同浓度的DNA捕获探针结合产生的电流响应如图3所示，当DNA捕获探针的浓度为2μM时，制备的电化学生物传感器性能最佳。
实施例2
基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤：
(1)工作电极的制备
Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的的制备
Ti3C2(MXene)-rGO-Au通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；将5mg的rGO纳米材料加入Ti3C2(MXene)分散液，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)-rGO分散液，然后加入350μL浓度为48.56mM的HAuCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在Al2O3抛光粉上呈“8”字形研磨直至表面光亮，并在去离子水中超声10分钟后，用氮气将其表面吹干，得到玻碳电极；用移液枪吸取10μL上述制备的Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料，滴加在打磨光滑的玻碳电极表面，在空气中静置2小时，得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au修饰的玻碳电极，将上述制备得到的电极与浓度为2μM的DNA捕获探针溶液(DNA捕获探针溶解在pH为8的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在 4摄氏度下孵育12个小时后，与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时，封闭未结合单独活性位点。
(2)连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液的制备
Ti3C2(MXene)-Au Pd通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；然后同时加入175μL浓度为48.56mM的HAuCl4溶液和425μL浓度为20mM的H2PdCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料。
连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液制备方法如下：取 500μL上述制备得到的Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料分散液，加入250μL 不同浓度(0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM)的DNA信号探针溶液(DNA 信号探针溶解在pH为8的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液)，在4摄氏度下反应12小时后，加入500μL浓度为3mM的Thi溶液，再在4摄氏度下反应12小时,离心洗涤后收集沉淀，重新分散在500μL的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，制备得到连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2(MXene)-Pd修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系，其中铂丝电极做为对电极，Ag/AgCl做为参比电极，构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
工作电极与浓度为100fM的microRNA-21在37摄氏度下孵育1小时，然后与连接有Thi和不同浓度(0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM)的DNA 信号探针的Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液在37摄氏度下孵育2小时。
打开电化学工作站，在室温下进行电化学实验，在0.01M PBS缓冲溶液中进行，采用差分脉冲伏安法，差分脉冲伏安法的电压范围是(-0.6)-0.1V。
本实施例制备的电化学生物传感器与不同浓度的DNA捕获探针结合产生的电流响应如图4所示，当DNA信号探针的浓度为2μM时，制备的电化学生物传感器性能最佳。
实施例3
基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤：
(1)工作电极的制备
Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的的制备
Ti3C2(MXene)-rGO-Au通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；将5mg的rGO纳米材料加入Ti3C2(MXene)分散液，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)-rGO分散液，然后加入350μL浓度为 48.56mM的HAuCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在Al2O3抛光粉上呈“8”字形研磨直至表面光亮，并在去离子水中超声10分钟后，用氮气将其表面吹干，得到玻碳电极；用移液枪吸取10μL上述制备的Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料，滴加在打磨光滑的玻碳电极表面，在空气中静置2小时，得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au修饰的玻碳电极，将上述制备得到的电极与浓度为2μM的DNA捕获探针溶液(DNA捕获探针溶解在pH为8的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在 4摄氏度下孵育12个小时后，与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时，封闭未结合单独活性位点。
(2)连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液的制备
Ti3C2(MXene)-Au Pd通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；然后同时加入175μL浓度为48.56mM的HAuCl4溶液和425μL浓度为20mM的H2PdCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料。
连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液制备方法如下：取 500μL上述制备得到的Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料分散液，加入250μL 浓度为2μM的DNA信号探针溶液(DNA信号探针溶解在pH为8的Tris-HCl 缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液)，在4摄氏度下反应12小时后，加入 500μL浓度为3mM的Thi溶液，再在4摄氏度下反应12小时,离心洗涤后收集沉淀，重新分散在500μL的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，制备得到连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2(MXene)-Pd修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系，其中铂丝电极做为对电极，Ag/AgCl做为参比电极，构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
工作电极与不同浓度的microRNA-21(0,10-15,5×10-15,10-14,10-13,10-12,10-11,10-10,10-9M)在37摄氏度下孵育1小时，然后与连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液在37摄氏度下孵育2小时。
打开电化学工作站，在室温下进行电化学实验，在0.01M PBS缓冲溶液中进行，采用差分脉冲伏安法，差分脉冲伏安法的电压范围是(-0.6)-0.1V。
本实施例制备的基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器在含有不同浓度microRNA-21的PBS缓冲溶液条件中测得的差分脉冲伏安法(DPV)曲线与校准曲线如图5所示，并绘制了电流-浓度的校准曲线，随着microRNA-21浓度的增大，电流响应也急剧增加。电极在1fM-1nM的范围内表现出良好的电化学响应，线性关系曲线为y＝8.165x+152.903，R2＝0.994，灵敏度为0.418fM，其中，x为microRNA-21浓度/M取对数后的数值，y为电流 /μA。
实施例4
本实施例电化学检测过程中所使用的检测序列如下表2
表2
基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤：
(1)工作电极的制备
Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的的制备
Ti3C2(MXene)-rGO-Au通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；将5mg的rGO纳米材料加入Ti3C2(MXene)分散液，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)-rGO分散液，然后加入350μL浓度为 48.56mM的HAuCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在Al2O3抛光粉上呈“8”字形研磨直至表面光亮，并在去离子水中超声10分钟后，用氮气将其表面吹干，得到玻碳电极；用移液枪吸取10μL上述制备的Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料，滴加在打磨光滑的玻碳电极表面，在空气中静置2小时，得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au修饰的玻碳电极，将上述制备得到的电极与浓度为2μM的DNA捕获探针溶液(DNA捕获探针溶解在pH为8的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在 4摄氏度下孵育12个小时后，与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时，封闭未结合单独活性位点。
(2)连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液的制备
Ti3C2(MXene)-Au Pd通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；然后同时加入175μL浓度为48.56mM的HAuCl4溶液和425μL浓度为20mM的H2PdCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料。
连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液制备方法如下：取 500μL上述制备得到的Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料分散液，加入250μL 浓度为2μM的DNA信号探针溶液(DNA信号探针溶解在pH为8的Tris-HCl 缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液)，在4摄氏度下反应12小时后，加入 500μL浓度为3mM的Thi溶液，再在4摄氏度下反应12小时,离心洗涤后收集沉淀，重新分散在500μL的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，制备得到连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2(MXene)-Pd修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系，其中铂丝电极做为对电极，Ag/AgCl做为参比电极，构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
工作电极与与浓度为100fM的不同序列的microRNA(分别是表2中目标 microRNA-21、与目标microRNA-21有一个碱基错位的序列、与目标microRNA- 21有三个碱基错位的序列、与目标microRNA-21碱基完全错错位的序列)在37 摄氏度下孵育1小时，然后与连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd 分散液在37摄氏度下孵育2小时。
打开电化学工作站，在室温下进行电化学实验，在0.01M PBS缓冲溶液中进行，采用差分脉冲伏安法，差分脉冲伏安法的电压范围是(-0.6)-0.1V。
本实施例制备的基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器，与不同序列的目标结合产生的电流响应如图6所示，电流响应有显著性差异，表明制备的传感器具有优异的特异性，具备实际应用的价值。
实施例5
基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤：
(1)工作电极的制备
Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的的制备
Ti3C2(MXene)-rGO-Au通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；将5mg的rGO纳米材料加入Ti3C2(MXene)分散液，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)-rGO分散液，然后加入350μL浓度为 48.56mM的HAuCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料。
修饰工作电极
将玻碳电极(直径3mm)在Al2O3抛光粉上呈“8”字形研磨直至表面光亮，并在去离子水中超声10分钟后，用氮气将其表面吹干，得到玻碳电极；用移液枪吸取10μL上述制备的Ti3C2(MXene)-rGO-Au纳米复合材料，滴加在打磨光滑的玻碳电极表面，在空气中静置2小时，得到Ti3C2(MXene)-rGO-Au修饰的玻碳电极，将上述制备得到的电极与浓度为2μM的DNA捕获探针溶液(DNA捕获探针溶解在pH为8的Tris-HCl缓冲溶液中配置得到DNA捕获探针溶液)在 4摄氏度下孵育12个小时后，与1mM的封闭剂MCH(6-mercapto-1-hexanol)孵育1小时，封闭未结合单独活性位点。
(2)连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液的制备
Ti3C2(MXene)-Au Pd通过Ti3C2(MXene)的自还原作用合成，具体方法如下：将5mg的Ti3C2(MXene)纳米材料分散在5mL去离子水中，超声处理30分钟后，得到Ti3C2(MXene)分散液；然后同时加入175μL浓度为48.56mM的HAuCl4溶液和425μL浓度为20mM的H2PdCl4溶液，室温下反应40分钟，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在5mL去离子水中；制备得到Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料。
连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液制备方法如下：
取500μL上述制备得到的Ti3C2(MXene)-Au Pd纳米复合材料分散液，加入 250μL浓度为2μM的DNA信号探针溶液(DNA信号探针溶解在pH为8的Tris- HCl缓冲溶液中配置得到DNA信号探针溶液)，在4摄氏度下反应12小时后，加入500μL浓度为3mM的Thi溶液，再在4摄氏度下反应12小时,离心洗涤后收集沉淀，重新分散在500μL的pH为8的Tris-HCl缓冲溶液，制备得到连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液。
(3)电化学microRNA传感器的构建
步骤(1)制备的Ti3C2(MXene)-Pd修饰的玻碳电极(工作电极)与对电极和参比电极组成了三电极体系，其中铂丝电极做为对电极，Ag/AgCl做为参比电极，构建microRNA传感器。
步骤(2)制备的连接有Thi和DNA信号探针的Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液与工作电极配合使用。
(4)检测microRNA
将小鼠尿液用PBS缓冲溶液稀释五十倍后，加入microRNA-21，制备得到浓度为100fM的microRNA-21尿液样品。
工作电极与上述制备得到浓度为100fM的microRNA-21尿液样品在37摄氏度下孵育1小时，最后与连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2(MXene)-Au Pd分散液在37摄氏度下孵育2小时。
打开电化学工作站，在室温下进行电化学实验，在0.01M PBS缓冲溶液中进行，采用差分脉冲伏安法，差分脉冲伏安法的电压范围是(-0.6)-0.1V。
本实施例制备的基于Ti3C2(MXene)基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器，在实际尿液样品中进行，结果如表2所示，结果表明本实施例制备的生物传感器可以在临床分析中检测应用。
表2
以上对本发明做了示例性的描述，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，在不脱离本发明核心的情况下，任何简单的变形，修改或者同等替换均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器及其制备方法与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaacatcag t 11
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgataagct a 11
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uagcuuaucg gacugauguu ga 22
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uugcuuaucg gacugaucuu ga 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
guaaggcauc ugaccgaagg ca 22
Claims (9)
1.基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器，其特征在于，包括工作电极以及连接有硫堇Thi和DNA信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液；所述工作电极包括玻碳电极和修饰在玻碳电极表面的Ti3C2-rGO-Au纳米复合材料，所述Ti3C2-rGO-Au纳米复合材料连接有DNA捕获探针；
所述DNA捕获探针5′端修饰巯基，通过金硫键与Ti3C2-rGO-Au相连接，同时DNA捕获探针含有能够与microRNA杂交的序列；
所述DNA信号探针3′端修饰巯基，通过金硫键与Ti3C2-Au Pd相连接，同时DNA信号探针含有能够与microRNA杂交的序列。
2.根据权利要求1所述的基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器，其特征在于，
所述microRNA为microRNA-21；
所述DNA捕获探针由5′端到3′端的序列为5′-(SH)TCAACATCAGT-3′；
所述DNA信号探针由5′端到3′端的序列为5′-CTGATAAGCTA(SH)-3′；
所述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器还包括参比电极、对电极；所述参比电极为Ag/AgCl，所述对电极为铂丝。
3.权利要求1-2任一项所述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将Ti3C2纳米材料分散在去离子水中，超声处理，得到Ti3C2分散液；
（2）将步骤（1）制备得到的Ti3C2分散液中加入还原石墨烯超声使其分散，再加入HAuCl4溶液，室温下反应，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在去离子水中，得到Ti3C2-rGO-Au分散液；
（3）将步骤（2）制备得到的Ti3C2-rGO-Au分散液滴加在玻碳电极的表面，在空气中静置2-3小时后，得到Ti3C2-rGO-Au纳米复合材料修饰的玻碳电极；
（4）将步骤（3）制备得到的Ti3C2-rGO-Au纳米复合材料修饰的玻碳电极与DNA捕获探针溶液在0-5摄氏度下孵育10-14小时，然后与封闭剂孵育，得到工作电极；
（5）将步骤（1）制备得到的Ti3C2分散液中加入HAuCl4溶液和H2PdCl4溶液，室温下反应，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在去离子水中，得到Ti3C2-Au Pd分散液；
（6）将步骤（5）制备得到的Ti3C2-Au Pd分散液中加入DNA信号探针溶液在0-5摄氏度反应10-14小时后，再加入Thi溶液在0-5摄氏度反应10-14小时，离心洗涤后收集沉淀，重新分散在Tris-HCl缓冲溶液中，得到连接有Thi和DNA信号探针Ti3C2-Au Pd分散液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述Ti3C2纳米材料与去离子水的质量体积比为3-10mg：4-12mL；步骤（1）所述Ti3C2纳米材料为二维层状结构，层数为1-3层；步骤（1）所述超声处理的时间为30-50分钟；
步骤（2）中所述还原石墨烯与Ti3C2分散液的质量体积比为4-8mg：3-7mL，所述HAuCl4溶液与Ti3C2分散液的体积比为1:12-1:15；所述HAuCl4溶液的摩尔浓度为40-55 mM；所述反应时间为20-40分钟；所述离心洗涤采用的是去离子水，次数为3-5次。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述玻碳电极需经过预处理，预处理的步骤如下：将玻碳电极在Al2O3抛光粉上呈“8”字形研磨直至表面光亮，并在去离子水中超声10-30分钟后，用氮气将其表面吹干，得到玻碳电极；所述Ti3C2-rGO-Au分散液的用量与电极的表面积比值为8-10μL:7mm2；
步骤（4）中，所述DNA捕获探针溶液的浓度为0.5-3μM；所述封闭剂为MCH溶液，浓度为0.1-1.5mM。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述HAuCl4溶液：H2PdCl4溶液：Ti3C2分散液的体积比为1:2:24-1:3:30;所述HAuCl4溶液的摩尔浓度为40-55 mM;所述H2PdCl4溶液的摩尔浓度为10-25 mM；所述反应时间为20-40分钟；所述离心洗涤采用的是去离子水，次数为3-5次；
步骤（6）中，所述Ti3C2-Au Pd分散液与DNA信号探针溶液的体积比为1:2-3:1；所述Thi溶液与Ti3C2-Au Pd分散液的体积比为1:3-1:1;所述DNA信号探针溶液的浓度为0.5-3μM；所述Thi溶液的浓度为2-5mM；所述Ti3C2-Au Pd分散液的浓度为0.8-1.2mg/mL；所述离心洗涤采用的是去离子水，次数为3-5次；所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为7-9。
7.权利要求1-2任一项所述的基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器在microRNA检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（A）将所述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器的工作电极与待测溶液孵育30-90分钟；然后与所述连接有Thi和DNA的信号探针的Ti3C2-Au Pd分散液孵育90-150分钟；
（B）打开电化学工作站，将步骤（A）所述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器在室温下进行电化学实验，在缓冲溶液中进行，采用差分脉冲伏安法进行测试得到电流，根据电流、浓度曲线，计算待测溶液中microRNA的浓度。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（B）中，所述差分脉冲伏安法的电压范围是-0.6 ~ 0.1V。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基于Ti3C2基纳米复合材料的microRNA电化学生物传感器在加入microRNA溶液后电流响应时间为30-60s，所述工作电极在1fM-1nM的浓度范围内表现出电化学响应；
所述microRNA为microRNA-21时，线性关系曲线为y=8.165x+152.903，R2=0.994，灵敏度为0.418fM，其中，x为microRNA-21浓度/M取对数后的数值，y为电流/μA。
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