CN110006977A - 一种CuFe2O4纳米微球电化学传感器的制备及对溶菌酶的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明研究了一种具有羧基修饰CuFe2O4纳米微球的分子印迹聚合物的制备方法,属于电化学传感领域。本发明通过水热法合成了粒径较小、尺寸均一羧基修饰CuFe2O4纳米微球。以羧基修饰CuFe2O4纳米微球为载体,通过表面印迹技术制备了CuFe2O4纳米微球分子印迹聚合物,然后将纳米粒子沉积在电极表面,制备出一种选择性强、响应快的新型传感器,不仅方便了操作,降低了成本,而且提高了复杂检测技术的效率和灵敏度。该传感器具有较高的比电容特性和良好的导电性,在优化条件下,构建的多功能传感器检测范围较大,对目标溶菌酶的检测限较低。进一步的竞争性选择实验结果表明,该传感材料对溶菌酶的测定具有较高的选择性和灵敏度,已成功应用于复杂生物样品中目标蛋白的检测,在疾病诊断、食品检测以及生物传感等研究领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于电化学传感领域,特别涉及一种羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物的制备方法。
背景技术
近年来,溶菌酶(lyz)被认为是诊断白血病等疾病的潜在生化标志物之一,可以标记人体器官、组织、细胞等的变化或损伤。事实上,溶菌酶广泛存在于植物、动物、微生物和人体组织中,其相对分子质量较低(14.4kDa)、耐热性强、耐寒性强、活性稳定,常被选为生化研究的靶蛋白。目前,溶菌酶的常规检测技术主要集中在酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、质谱法(MS)、荧光检测(FD)和毛细管凝胶电泳(CGE)。然而,这些方法往往需要复杂的仪器和昂贵的技术,这需要大量的时间和劳动力。因此,开发一种方便、快速的溶菌酶分析方法具有重要的意义。
近年来,各种电化学传感器和生物传感器因其响应速度快、灵敏度高、成本低、分析简单、实时等优点受到越来越多的关注。但这些传感器也存在各种不足和缺陷,如选择性差、重现性差。分子印迹技术是制备具有特殊识别能力和与模板分子结合能力的聚合物的一种简便方法。制备的分子印迹聚合物(MIPs)可以在空间、结构和尺寸上特异性地与模板分子结合。分子印迹聚合物(MIP)传感器具有很高的选择性和灵敏度,被广泛用于分析和检测病毒、蛋白质、细胞、核酸、药物和无机离子。
近年来,磁性纳米颗粒在各个应用领域,特别是电分析领域进行了大量的研究。磁性纳米颗粒(MNP)是一种具有超顺磁性的纳米材料,广泛应用于生物化学分离、生物工程、生物医学工程等领域。的确,MNPs可以通过磁性分离和富集目标分析物,这比传统的离心或过滤操作更加方便和准确。磁性纳米颗粒分离纯化蛋白质可以简化操作过程,避免蛋白质变性,减少样品加工过程中不必要的损失。MIPs修饰的磁性纳米粒子在实际疾病样品中对靶分子的选择和检测具有重要作用。将分子印迹技术和磁性分离特性集成到复合传感器中,制备了电化学分子印迹传感系统,有望开发出一种新的电化学传感器,具有广阔的分析前景。
尖晶石铁氧体-CuFe2O4是一种磁性金属氧化物,广泛应用于磁性材料、催化材料、吸波材料等。目前,在电化学电极材料中的应用报道也越来越多。CuFe2O4是一种分级多孔结构,是超级电容器的优良电极材料,具有比电容高,电导率好等优点。然而,据我们所知,CuFe2O4杂化材料MIP传感器尚未见报道。
本发明中,通过水热法合成羧基修饰CuFe2O4纳米微球,采用表面印迹技术制备了羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物材料,并作为目标分析物的电化学传感器应用于溶菌酶的检测分析。与传统的分子印迹聚合物相比,这种电化学传感器不仅保留了传统分子印迹聚合物的优点,将生物分子识别过程转换为电学信号分析;还展现了一些优异的新性能,包括响应时间快速、分析过程简单快捷、模板分子易于除去以及检出限更低等,具备作为一种电化学传感器特异识别和分析目标物的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备羧基修饰CuFe2O4纳米微球及其表面印迹聚合物的方法,该方法合成的CuFe2O4纳米微球粒径较小、尺寸均一,导电性能好,具有良好的分散性和稳定性;TEM透射电镜图片分析表明,制备的羧基修饰CuFe2O4纳米微球粒径约为150nm,羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物颗粒粒径约为170nm;制备的印迹聚合物对溶菌酶具有很好的选择性吸附能力,能迅速达到吸附平衡,对溶菌酶的电信号响应快速,且电化学响应值对溶菌酶的浓度有很好的线性关系。
本发明的目的主要通过以下技术手段实现:
本发明中羧基修饰CuFe2O4纳米微球及其表面印迹聚合物合成具体步骤如下:
1)称取一定量的六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、二水合氯化铜(CuCl2·2H2O)和柠檬酸三钠溶解于一定量的乙二醇中;
2)称取一定量的乙酸钠(NaAc)和一定量的聚乙二醇20000缓慢加入上述溶液,室温下剧烈搅拌24小时;
3)将上述反应产物转移到80mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中,在200℃下加热10小时,反应后高压反应釜自然冷却到室温。
4)将上述反应产物离心收集,先用乙醇/水(1:1;v:v)洗涤一次,再用去离子水洗涤两次,将产物冷冻干燥,即可得到CuFe2O4纳米微球;
5)称取一定量的CuFe2O4纳米微球分散在一定量柠檬酸缓冲溶液中(pH 6.4,0.02M),加入一定量的溶菌酶(Lysozyme),置于摇床中常温孵育1小时;
6)称取一定量的丙烯酰胺(AAm)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、甲基丙烯酸(MAA)和N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)分散在一定量的柠檬酸缓冲液中,混合均匀后加入(1)中混合液,置于摇床中常温孵育1小时;
7)将混合物吹氮气20分钟,并在机械搅拌下加入一定量的过硫酸铵(APS)溶液和四甲基乙二胺(TEMED),在氮气保护下反应24小时;
8)将反应后的混合物离心收集,先用乙醇/水(1:1;v:v)洗涤两次,再用去离子水洗涤一次;将所得产物置于冰箱冷冻20分钟后,转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥6小时,保存在4摄氏度的冰箱中备用,即得到CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物(MIP);非印迹聚合物(NIP)的合成过程中除不加溶菌酶外,其他均相同。
本发明中基于羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物作为电化学传感器对溶菌酶的特异性识别和检测方法如下:
8)称取一定量的CuFe2O4-MIP/NIP,加入一定量10%乙酸(v:v)-乙腈混合液洗脱,每隔5小时更换一次洗脱液,洗脱三次;将洗脱后的CuFe2O4-MIP/NIP,将所得产物置于冰箱冷冻20分钟后,转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥5小时,保存在4摄氏度的冰箱中备用;
9)称取一定量洗脱后的CuFe2O4-MIP/NIP并溶解在柠檬酸缓冲液(pH 6.4,0.02M)中配成母液,用移液枪称取一定量母液滴加到玻碳电极表面,烘干备用。
10)将各个电极传感器浸入到含[K3Fe(CN)6]的KCl溶液中,随后对各个电极传感器进行电化学循环伏安法扫描和交流阻抗法测量,扫描后便可得到相应的循环伏安(CV)图和交流阻抗(EIS)图。
11)分子印迹电化学传感器去除模版后,浸入含有一定浓度的溶菌酶标准溶液的柠檬酸缓冲液(pH 6.4,0.02M),不同时间测试DPV响应值,以时间与DPV响应值做图。
12)选用细胞色素C(Cytochrome C)和核糖核酸酶A(Ribonuclease A)作为溶菌酶的结构类似物来测定CuFe2O4-MIP/NIP的选择性。在本研究中,峰电流的比值(ΔI/I0)被用于计算印迹电极的选择识别能力,其中ΔI=I0-Ic,I0和Ic分别是印迹电极吸附溶菌酶之前和之后的电流值
附图说明
图1是合成的羧基修饰CuFe2O4纳米微球磁颗粒(CuFe2O4-MNPs)HRTEM透射电镜图
图2不同电极在含有K3Fe(CN)6的KCl溶液中的循环伏安(CV)图
图3是印迹传感器(CuFe2O4-MIP)孵育时间测定图
图4是电化学传感器(CuFe2O4-MIP)响应值与溶菌酶浓度的线性关系图
具体实施方式
实施例1
羧基修饰CuFe2O4纳米微球的合成:
1)称取4.8mmol六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、2.4mmol二水合氯化铜(CuCl2·2H2O)和2mol柠檬酸三钠溶解于60mL的乙二醇中,超声溶解;
2)称取3.6g乙酸钠(NaAc)和1g聚乙二醇20000缓慢加入上述溶液,室温下剧烈搅拌24小时;
3)将上述反应产物转移到80mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中,在200℃下加热10小时,反应后高压反应釜自然冷却到室温。
4)将上述反应产物离心收集,先用乙醇/水(1:1;v:v)洗涤一次,再用去离子水洗涤两次,将产物冷冻干燥,即可得到CuFe2O4纳米微球;
实施例2
羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物的合成:
1)称取100mg的CuFe2O4纳米微球分散在20ml柠檬酸缓冲溶液中(pH 6.4,0.02M),加入20mg的溶菌酶(Lysozyme),置于摇床中常温孵育1小时;
2)称取30mg丙烯酰胺(AAm)、100mg N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、30μl甲基丙烯酸(MAA)和25mg N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)分散在20ml的柠檬酸缓冲液中,混合均匀后加入(1)中混合液,置于摇床中常温孵育1小时;
7)将混合物吹氮气20分钟,并在机械搅拌下加入质量分数10%100μl的过硫酸铵(APS)溶液和30μl四甲基乙二胺(TEMED),在氮气保护下反应24小时;
8)将反应后的混合物离心收集,先用乙醇/水(1:1;v:v)洗涤两次,再用去离子水洗涤一次;将所得产物置于冰箱冷冻20分钟后,转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥6小时,保存在4摄氏度的冰箱中备用,即得到CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物(MIP);非印迹聚合物(NIP)的合成过程中除不加溶菌酶外,其他均相同。
实施例3
基于羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物作为电化学传感器对溶菌酶的特异性识别和检测:
1)称取100mg CuFe2O4-MIP/NIP于200mL锥形瓶中,加入乙腈(90%,v:v)和乙酸(10%,v:v)混合液,在机械搅拌下洗脱;每隔5小时更换一次洗脱液,洗脱三次;将洗脱后的CuFe2O4-MIP/NIP置于冰箱冷冻20分钟后,转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥6小时,保存在4摄氏度的冰箱中备用;
2)将洗脱后的CuFe2O4-MIP/NIP并溶解在柠檬酸缓冲液(pH 6.4,0.02M)中配成1mg/ml母液,用移液枪称取20μl母液滴加到玻碳电极表面,烘干备用。
3)将各个电极传感器浸入到含50mmol/l[K3Fe(CN)6]的0.1mol/l KCl溶液中,随后对各个电极传感器进行电化学循环伏安法扫描和交流阻抗法测量,扫描后便可得到相应的循环伏安(CV)图和交流阻抗(EIS)图。
4)分子印迹电化学传感器去除模版后,浸入含有0,50,100,200,400,600和800ng/ml的溶菌酶标准溶液的柠檬酸缓冲液(pH 6.4,0.02M),不同时间测试DPV响应值,以时间与DPV响应值做图。
5)选用细胞色素C(Cytochrome C)和核糖核酸酶A(Ribonuclease A)作为溶菌酶的结构类似物来测定CuFe2O4-MIP/NIP的选择性。在本研究中,峰电流的比值(ΔI/I0)被用于计算印迹电极的选择识别能力,其中ΔI=I0-Ic,I0和Ic分别是印迹电极吸附溶菌酶之前和之后的电流值
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物的制备方法,包括
1)称取一定量的六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、二水合氯化铜(CuCl2·2H2O)和柠檬酸三钠溶解于一定量的乙二醇中;
2)称取一定量的乙酸钠(NaAc)和一定量的聚乙二醇20000缓慢加入上述溶液,室温下剧烈搅拌24小时;
3)将上述反应产物转移到80mL聚四氟乙烯衬里的不锈钢高压釜中,在200℃下加热10小时,反应后高压反应釜自然冷却到室温。
4)将上述反应产物离心收集,先用乙醇/水(1:1;v:v)洗涤一次,再用去离子水洗涤两次,将产物冷冻干燥,即可得到羧基修饰CuFe2O4纳米微球;
5)称取一定量的CuFe2O4纳米微球分散在一定量柠檬酸缓冲溶液中(pH 6.4,0.02M),加入一定量的溶菌酶(Lysozyme),置于摇床中常温孵育1小时;
6)称取一定量的丙烯酰胺(AAm)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、甲基丙烯酸(MAA)和N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)分散在一定量的柠檬酸缓冲液中,混合均匀后加入(1)中混合液,置于摇床中常温孵育1小时;
7)将混合物吹氮气20分钟,并在机械搅拌下加入一定量的过硫酸铵(APS)溶液和四甲基乙二胺(TEMED),在氮气保护下反应24小时;
8)将反应后的混合物离心收集,先用乙醇/水(1:1;v:v)洗涤两次,再用去离子水洗涤一次;将所得产物置于冰箱冷冻20分钟后,转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥6小时,保存在4摄氏度的冰箱中备用,即得到CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物(MIP);非印迹聚合物(NIP)的合成过程中除不加溶菌酶外,其他均相同。
2.根据权利要求1所述的一种羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中六水合氯化铁:二水合氯化铜:柠檬酸三钠的摩尔比范围为3:1.5:1~2:1:1,优选条件为2.4:1.2:1。
3.根据权利要求1所述的一种羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(6)中丙烯酰胺:N-异丙基丙烯酰胺:甲基丙烯酸:N,N-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比范围为2:5:1.5:1~4:8:3:1,优选条件为2.5:5.4:2:1。
4.根据权利要求1所述的一种羧基修饰CuFe2O4纳米微球表面印迹聚合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(5)和(7)中CuFe2O4纳米微球:N,N-亚甲基双丙烯酰胺:过硫酸铵:四甲基乙二胺的摩尔比范围为4:3.5:2:1~6:5:3:1,优选条件为5.3:4.5:2.3:1。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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