CN112858435A

CN112858435A - 一种长期抗污染的基于人血清白蛋白分子印迹聚合凝胶的电化学生物传感器的制备方法

Info

Publication number: CN112858435A
Application number: CN202110035130.9A
Authority: CN
Inventors: 崔敏; 王帅; 车忠梅; 刘尹琪
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2021-01-12
Filing date: 2021-01-12
Publication date: 2021-05-28

Abstract

本发明属于电化学生物传感器领域，具体涉及一种长期抗污染的基于人血清白蛋白分子印迹聚合凝胶的电化学生物传感器的制备方法。该方法通过以下步骤实现：首先将玻碳电极预处理，制备海藻酸钠混合溶液，将混合溶液滴加至预处理的玻碳电极表面，滴加钙盐溶液，反应结束后，采用十二烷基硫酸钠溶液洗脱模板蛋白分子，得电化学生物传感器。本发明制备的蛋白质分子印迹聚合凝胶，在实现对目标分子的选择性检测的同时，能够长期（25天）有效地消除真实样品中其他蛋白质（细菌）在传感界面上的非特异性吸附，从而显著提高了传感器的特异性和准确性及抗污染能力，具有高度的选择性结合能力，准确性高，操作简单，灵敏度高且制备流程简单、成本低。

Description

一种长期抗污染的基于人血清白蛋白分子印迹聚合凝胶的电化学生物传感器的制备方法

技术领域

本发明属于电化学生物传感器领域，具体涉及一种长期抗污染的基于人血清白蛋白分子印迹聚合凝胶的电化学生物传感器的制备方法。

背景技术

分子印迹聚合物具有模拟天然受体的分子是被能力，越来越成为一类重要的人工合成材料。目前，现有的人血清白蛋白分子印迹聚合物主要以球形或柱状等其他形状的物质为依托制备而成，该方法存在以下缺点：其一，球形或其他形状的依托材料制备繁杂；其二，此类技术合成的分子印迹聚合物与电极表面的连接受限，导致其很难直接应用于传感器领域；其三，此类技术制备的分子印迹聚合物几乎没有消除或降低其他蛋白质非特异性吸附的能力，直接削弱了其在实际样品中对目标的分析检测能力。电化学是一种应用比较广泛的测试手段，其自身具有超高的灵敏性。因此，电化学技术与抗污染蛋白质分子印迹聚合凝胶的结合，能够有效的消除其他蛋白质的干扰，提高生物分析的选择性、灵敏度和准确性。

现有技术中，绝大多数生物传感器在实际样品（包括血液、血清、汗液、尿液、组织提取液、细胞粉碎液等）检测中遭遇其他蛋白质的非特异性吸附以及细胞的黏附从而导致传感器的选择性低、灵敏度差、准确性低等问题。目前，尚未有以人血清白蛋白为模板分子制备长期抗污染材料的相关报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种长期抗污染的基于人血清白蛋白分子印迹聚合凝胶的电化学生物传感器的制备方法。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种长期抗污染的基于人血清白蛋白分子印迹聚合凝胶的电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1）电极的预处理：玻碳电极GCE分别在不同浓度的氧化铝悬浮液中抛光，超声，先后用乙醇和水冲洗；

2）混合溶液的配制：将海藻酸钠溶解在KOH溶液中，搅拌混匀，加入蒸馏水，搅拌至均一得海藻酸钠溶液；加入人血清白蛋白，得混合溶液；

3）移取混合溶液滴加至预处理的玻碳电极表面，滴加钙盐溶液，反应结束后，采用十二烷基硫酸钠溶液洗脱模板蛋白分子，得电化学生物传感器。

进一步的，步骤（1）中，所述氧化铝悬浮液的浓度为1.0、0.3、0.05 µm；所述冲洗的时间为3min。

进一步的，步骤（2）中，所述海藻酸钠在KOH溶液中的浓度为0.05g/mL；所述KOH溶液的浓度为0.1 mol/L；所述蒸馏水和KOH溶液溶液的体积比为5：2。

进一步的，步骤（2）中，所述人血清白蛋白在混合溶液中的浓度为5.0 mg/mL。

进一步的，步骤（3）中，所述玻碳电极每1支表面滴加7.0 µL混合溶液；所述钙盐溶液的浓度为0.1 g/mL，滴加量为0.05-0.1mL；所述钙盐为氯化钙。

进一步的，步骤（3）中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为10% (W/V)。

本发明还提供了一种利用上述制备方法制备的电化学生物传感器在血清蛋白质检测中的应用。

本发明的有益效果为：

（1）本发明制备的蛋白质分子印迹聚合凝胶，在实现对目标分子的选择性检测的同时，能够长期（25天）有效地消除真实样品中其他蛋白质（细菌）在传感界面上的非特异性吸附，从而显著提高了传感器的特异性和准确性及抗污染能力。

（2）本发明制备的基于人血清白蛋白分子印迹聚合凝胶的生物传感器对目标蛋白质（人血清白蛋白）表现出高度的选择性结合能力，能够减少其他蛋白质在界面上的疏水吸附，传感器的特异性和准确度能够得到显著的提升。

（3）本发明制备的生物传感器进行检测时，具有操作简便、灵敏度高等显著优势，在生物传感领域应用广泛。

（4）本发明制备流程简单、制备成本低：直接将模板分子和功能单体分散在水溶液中，在引发剂的作用下直接完成在电极表面的聚合，成功制备具有长期抗污染性能的蛋白质分子印迹聚合凝胶电化学生物传感器。该技术的制备流程简单、操作方便、成本降低。

附图说明

图1为实施例1制备的电化学传感器电构建过程表征图；

其中，a为玻碳电极的EIS信号， b为人血清白蛋白分子印迹凝胶修饰的玻碳电极的EIS信号， c为采用十二烷基硫酸钠洗脱掉模板蛋白分子之后的电极界面的EIS信号，d是再结合模板蛋白分子之后的电极界面的EIS信号。

图2为实施例1制备的电化学传感器的传感性能分析图；

其中，a为该传感器随着目标蛋白浓度的增加（0, 10^-6, 10^-5, 10^-4, 10^-3, 5 ×10^-2, 10.0 ng/mL）EIS信号增大直至稳定；b为该传感器对目标检测的线性曲线；c为传感器的长期（30天）稳定性测试；d为传感器的特异性测试。

图3为制备的生物传感界面对细胞吸附的表征图。

图4为制备的生物传感界面对蛋白质非特异性吸附的表征图；

其中插图为玻碳电极的对照实验图。

图5为实施例1制备的生物传感器凝胶界面的长期抗污染情况图。

图6为制备的生物传感器对目标蛋白检测的线性图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

实施例1

1）电极的预处理：玻碳电极GCE分别在1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝悬浮液中抛光，超声，先后用乙醇和水冲洗3分钟；

2）混合溶液的配制：1 g海藻酸钠溶解在20 mL 0.1 mol/L的KOH溶液中，搅拌混匀；上述溶液中加入50 mL蒸馏水，搅拌至均一；

加入人血清白蛋白，使其最终浓度为5.0mg/mL；

移液枪移取7.0 µL上述均一的混合溶液滴加至预处理的玻碳电极表面，滴加0.05mL浓度为0.1 g/mL 氯化钙溶液的引发作用下进行反应，聚合30分钟之后，磷酸缓冲溶液冲洗，人血清白蛋白印迹的海藻酸钠凝胶薄膜在电极表面成功制备；

采用10% (W/V)的十二烷基硫酸钠洗脱模板蛋白分子20min，形成三维孔穴，磷酸缓冲溶液冲洗，传感器制备成功，室温保持24小时以稳定凝胶界面。

（一）将实施例1制备的电化学传感器采用电化学交流阻抗技术（EIS）对传感器的构建过程进行表征，如图1所示，图1中曲线a为玻碳电极的EIS信号，曲线b为人血清白蛋白分子印迹凝胶修饰的玻碳电极的EIS信号，曲线c为采用十二烷基硫酸钠洗脱掉模板蛋白分子之后的电极界面的EIS信号，曲线d是再结合模板蛋白分子之后的电极界面的EIS信号。每一步的信号变化验证了传感器的成功制备。

（二）传感性能分析：配制不同浓度的人血清白蛋白溶液，采用电化学交流阻抗（EIS）技术测试传感器对目标蛋白的识别能力。同时，采用电化学技术测试传感器的稳定性、重现性、特异性等传感性能。结果如图2所示：其中a为该传感器随着目标蛋白浓度的增加（0, 10^-6, 10^-5, 10^-4, 10^-3, 5 × 10^-2, 10.0 ng/mL）EIS信号增大直至稳定；b为该传感器对目标检测的线性曲线（线性范围从10^-6到5 × 10^-2 ng/mL）；c为传感器的长期（30天）稳定性测试；d为该传感器的特异性测试。以上结果表明，制备的基于蛋白质分子印迹凝胶的生物传感器能够实现对目标蛋白的测试，同时具有较高的稳定性和较高的特异性。

（三）传感界面的抗污染性能分析：采用荧光显微成像技术测试该蛋白质印迹的凝胶界面在Hela细胞孵化8小时之后对细胞的黏附情况，结果如图3所示；同时采用电化学交流阻抗（EIS）技术测试该蛋白质印迹的凝胶界面在不同稀释浓度（V/V）的胎牛血清（FBS）溶液中浸泡30分钟之后对血清中污染物（主要是非特异性蛋白质）的吸附情况（蛋白质的非特异性吸附能够增大电化学交流阻抗的影响信号），结果如图4所示，图4中插图是玻碳电极的对照实验。

进一步采用电化学交流阻抗（EIS）技术测试该蛋白质印迹的凝胶界面在20%（V/V）的胎牛血清FBS中浸泡不同的时间（从1天到25天）之后界面的信号变化情况，结果如图5所示：

其中插图是玻碳电极的对照实验。

（四）实用性能测试：采用本发明实施例1制备的生物传感器测试含有20%（V/V）的胎牛血清（FBS）的硫酸缓冲溶液中人血清白蛋白的含量，并与（二）中的检测结果对比，具体如图6所示，该结果与图2b的结果相同，即使在20%（V/V）的胎牛血清（FBS）存在的情况下，传感器对目标分析的性能并没有受到影响，表明制备的凝胶界面具有优异的抗污染性能。

Claims

1.一种长期抗污染的基于人血清白蛋白分子印迹聚合凝胶的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氧化铝悬浮液的浓度为1.0、0.3、0.05 µm；所述冲洗的时间为3min。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述海藻酸钠在KOH溶液中的浓度为0.05g/mL；所述KOH溶液的浓度为0.1 mol/L；所述蒸馏水和KOH溶液溶液的体积比为5：2。

4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述人血清白蛋白在混合溶液中的浓度为5.0 mg/mL。

5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述玻碳电极每1支表面滴加7.0 µL混合溶液；所述钙盐溶液的浓度为0.1 g/mL，滴加量为0.05-0.1mL；所述钙盐为氯化钙。

6. 根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为10% (W/V)。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的电化学生物传感器在血清蛋白质检测中的应用。