CN102619089A - 一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法。制备方法是：将纤维放入丙烯酸水溶液中，加入阻聚剂硫酸亚铁铵，通入氮气，用紫外灯照射0.2～1小时，得到接枝聚丙烯酸的纤维，用氢氧化钠水溶液中和，得到聚丙烯酸钠接枝的纤维。配制质量百分比浓度分别为0.1％～5％的蛋白质、2％～5％的海藻酸钠和0.05％～5％的水溶性添加剂的混合水溶液，同时配制质量百分比浓度为1％～10％的氯化钙水溶液。将接枝聚丙烯酸钠的纤维浸泡入蛋白质、水溶性添加剂和海藻酸钠的混合水溶液中，随后将其立即放入氯化钙水溶液中交联0.5～2小时，最后洗脱掉模板蛋白质，得到基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜。

Description

一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法，属于功能高分子材料领域。

背景技术

分子印迹技术作为一种制备对特定目标分子具有高度亲和性的聚合物技术，目前，其对小分子的特异识别作用的研究已经取得了很大的进步，例如氨基酸类、糖及其衍生物和药物等。但是关于生物大分子的印迹，如蛋白质的研究，远不如小分子印迹研究的系统和深入。蛋白质分子印迹聚合物由于在医学诊断、生物分离及药物传递等领域的潜在应用前景而成为当前研究的热点【化学进展.2008，20(8)：957-968】。由于蛋白质分子体积庞大、容易变性、空间结构十分复杂，对蛋白质大分子印迹的研究思路和实验手段都还处于摸索阶段。近年来，人们越来越多地用聚合物水凝胶来进行蛋白质分子印迹的研究。水凝胶的精巧结构使其能在外界pH值、离子强度、温度等因素的刺激下表现出反复的溶胀变化。相对于硬质的材料，水凝胶更适于蛋白质的印迹。

海藻酸盐具有良好的亲水性，在多价阳离子Ca²⁺的存在下，能够迅速发生凝胶化反应，其温和的凝胶条件有利于保持生物蛋白质的活性，海藻酸盐凝胶的软湿特性有利于生物蛋白质保持其构象、有利于模板分子的洗脱和识别过程中对模板分子的再吸附，海藻酸盐凝胶对于环境参数诸如离子强度、pH值等的可响应性也给蛋白质印迹海藻酸盐凝胶的设计参数提供了较宽的选择余地。直接采用带有功能基团的天然聚合物海藻酸钠代替传统分子印迹体系中的功能单体，简化了印迹聚合物的合成过程。张凤菊等首次以海藻酸盐为大分子单体制备了BSA印迹水凝胶，但是只用海藻酸盐做印迹材料，其印迹效率较低【Reactive and FunctionalPolymers，2006，66，(7)：712-719】。赵孔银等制备了蛋白质印迹聚丙烯酸/海藻酸钙、磷酸/海藻酸钙杂化凝胶微球【200710057640.6，200710057639.3】，然而在制备过程中需要用到有机物和分散剂，可能引起蛋白质的变性，而残留的有机物和分散剂不利于生物领域的应用。

纤维材料具有良好的柔韧性和机械强度，传质距离短，有效官能团多，吸附速率高，可以制备成各种不同的形状，使用方便。近年来，出现了在纤维材料表面接枝聚合印迹小分子的报道。王兵等以苄基海因和药物磺胺嘧啶为模板分子，在中空纤维基体上制备出分子印迹中空纤维分离膜。T.Hideaki等以异丙基丙烯酰胺为单体，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过等离子体引发聚合在聚丙烯无纺布上接枝印迹了铜离子【Reactive & Functional Polymers，2008，68：182-188】。

本专利把纤维材料强度大、韧性高、比表面积大等优点与蛋白质分子印迹水凝胶的软湿特性结合起来，通过在纤维基体表面刮膜，以钙离子交联海藻酸钠与水溶性添加剂的混合水溶液，制备基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜。这在国内外还没有相关报道。该制备方法简单、反应过程易于控制，可得到能批量生产、生物相容性好的蛋白质印迹膜材料，在蛋白质分离、控制释放、组织工程、生物医用领域有广泛的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是蛋白质遇到有机物会变性，单纯的海藻酸钙水凝胶强度低、印迹效率低等问题。

本发明解决所述的蛋白质遇到有机物会变性，单纯的海藻酸钙水凝胶强度低、印迹效率低等问题的技术方案，是设计一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜。

本发明提供了一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法，其特征是该制备方法包括以下步骤：

a)将纤维放入体积百分数为1％～50％的丙烯酸水溶液中，加入质量百分比浓度为0.5～3％的阻聚剂硫酸亚铁铵，通入氮气作保护，在室温下用500W的紫外灯照射0.2～1小时，取出后用水冲洗3～5次，除去未反应的单体和均聚物，得到接枝聚丙烯酸的纤维，随后用质量百分比浓度为1％～10％的氢氧化钠水溶液中和，得到聚丙烯酸钠接枝的纤维；

b)向质量百分比浓度为0.1％～5％的蛋白质溶液中加入海藻酸钠和水溶性添加剂，搅拌使其充分溶解，得到质量百分比浓度为2％～5％的海藻酸钠和0.05％～5％的水溶性添加剂的混合溶液，静置消泡后待用，同时配制质量百分比浓度为1％～10％的氯化钙水溶液；

c)将步骤a)制备的接枝聚丙烯酸钠的纤维浸入蛋白质、水溶性添加剂和海藻酸钠的混合水溶液中0.5～2小时，取出后滴淌2～5分钟，用刮刀刮去粘附的过多粘稠溶液，使纤维表面的附着液尽量均匀，立即将其放入步骤b)配制的氯化钙水溶液中，交联0.5～2小时，用去离子水冲洗3～5遍，得到包含蛋白质的纤维接枝海藻酸钙杂化凝胶膜；

d)将步骤c)制备的包含蛋白质的纤维接枝海藻酸钙杂化凝胶膜放置在锥形瓶中，在5～25℃的温度下，经过pH＝7.0～9.5的含1％CaCl₂的Tris-HCl溶液洗脱12～36h，得到基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜。

本发明中纤维可选择聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈和聚砜等各种基材，其形态包括无纺布、丝束、纤维单丝和中空纤维等。水溶性添加剂包括羟丙基甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、水溶性淀粉、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、磷酸氢二铵、碳酸钠、硅酸钠。蛋白质包括牛血清白蛋白、牛血红蛋白、卵白蛋白、溶菌酶、细胞色素C、过氧化氢酶、γ球蛋白、胰岛素。

本发明方法操作简单，不使用任何有机溶剂，因此具有优良的生物相容性。基于以上特性，本发明的一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜可以用于蛋白质吸附分离、药物控制释放、固定化酶、组织工程等领域。

具体实施方式

下面介绍本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。

实施例1.基于聚丙烯纤维无纺布载体的牛血清白蛋白印迹磷酸/海藻酸钙杂化凝胶膜

将聚丙烯纤维无纺布放入体积百分数为1％的丙烯酸水溶液中，加入质量百分比浓度为0.5％的阻聚剂硫酸亚铁铵，通入氮气作保护，在室温下用500W的紫外灯照射1小时，取出后用水冲洗3～5次，除去未反应的单体和均聚物，得到接枝丙烯酸的聚丙烯纤维无纺布，随后用质量百分比浓度为1％的氢氧化钠水溶液中和，得到聚丙烯酸钠接枝的聚丙烯纤维无纺布；

向质量百分比浓度为0.1％的牛血清白蛋白溶液中加入海藻酸钠和磷酸氢二铵，搅拌使其充分溶解，得到质量百分比浓度为2％的海藻酸钠和0.05％的磷酸氢二铵的混合溶液，静置消泡后待用，同时配制质量百分比浓度为1％的氯化钙水溶液；

将接枝聚丙烯酸钠的聚丙烯纤维无纺布浸入牛血清白蛋白、磷酸氢二铵和海藻酸钠的混合水溶液中0.5小时，取出后滴淌2分钟，用刮刀刮去粘附的过多粘稠溶液，使纤维表面的附着液尽量均匀，立即将其放入氯化钙水溶液中，交联0.5小时，用去离子水冲洗3～5遍，得到包含牛血清白蛋白的聚丙烯纤维接枝磷酸/海藻酸钙杂化凝胶膜；

将包含牛血清白蛋白的聚丙烯纤维接枝磷酸/海藻酸钙杂化凝胶膜置于锥形瓶中，在5℃的温度下，经过pH＝7.5的含1％CaCl₂的Tris-HCl溶液洗脱12h，得到基于聚丙烯纤维无纺布载体的牛血清白蛋白印迹磷酸/海藻酸钙杂化凝胶膜。

实施例2.基于聚丙烯纤维无纺布载体的溶菌酶印迹磷酸/海藻酸钙杂化凝胶膜

将聚丙烯纤维无纺布放入体积百分数为5％的丙烯酸水溶液中，加入质量百分比浓度为0.5％的阻聚剂硫酸亚铁铵，通入氮气作保护，在室温下用500W的紫外灯照射1小时，取出后用水冲洗3～5次，除去未反应的单体和均聚物，得到接枝丙烯酸的聚丙烯纤维无纺布，随后用质量百分比浓度为5％的氢氧化钠水溶液中和，得到聚丙烯酸钠接枝的纤维无纺布；

向质量百分比浓度为0.1％的溶菌酶溶液中加入海藻酸钠和磷酸氢二铵，搅拌使其充分溶解，得到质量百分比浓度为3％的海藻酸钠和5％的磷酸氢二铵的混合溶液，静置消泡后待用，同时配制质量百分比浓度为10％的氯化钙水溶液；

将接枝聚丙烯酸钠的聚丙烯纤维无纺布浸入溶菌酶、磷酸氢二铵和海藻酸钠的混合水溶液中0.5小时，取出后滴淌5分钟，用刮刀刮去粘附的过多粘稠溶液，使纤维表面的附着液尽量均匀，立即将其放入氯化钙水溶液中，交联1小时，用去离子水冲洗3～5遍，得到包含溶菌酶的聚丙烯纤维无纺布接枝磷酸/海藻酸钙杂化凝胶膜；

将包含溶菌酶的聚丙烯纤维接枝磷酸/海藻酸钙杂化凝胶膜置于锥形瓶中，在5℃的温度下，经过pH＝8.32的含1％CaCl₂的Tris-HCl溶液洗脱36h，得到基于聚丙烯纤维无纺布载体的溶菌酶印迹磷酸/海藻酸钙杂化凝胶膜。

实施例3.基于聚丙烯纤维单丝载体的牛血红蛋白印迹聚丙烯酸/海藻酸钙杂化凝胶膜

将聚丙烯纤维单丝放入体积百分数为50％的丙烯酸水溶液中，加入质量百分比浓度为3％的阻聚剂硫酸亚铁铵，通入氮气作保护，在室温下用500W的紫外灯照射0.5小时，取出后用水冲洗3～5次，除去未反应的单体和均聚物，得到接枝丙烯酸的聚内烯纤维单丝，随后用质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液中和，得到聚丙烯酸钠接枝的纤维单丝；

向质量百分比浓度0.2％的牛血红蛋白溶液中加入海藻酸钠和聚丙烯酸钠，搅拌使其充分溶解，得到质量百分比浓度为2.5％的海藻酸钠和0.5％的聚丙烯酸钠的混合溶液，静置消泡后待用，同时配制质量百分比浓度为10％的氯化钙水溶液；

将接枝聚丙烯酸钠的聚丙烯纤维单丝浸入牛血红蛋白、聚丙烯酸钠和海藻酸钠的混合水溶液中0.5小时，取出后滴淌5分钟，用刮刀刮去粘附的过多粘稠溶液，使纤维表面的附着液尽量均匀，立即将其放入氯化钙水溶液中，交联1小时，用去离子水冲洗3～5遍，得到包含牛血红蛋白的聚丙烯纤维单丝接枝聚丙烯酸/海藻酸钙杂化凝胶膜；

将包含牛血红蛋白的聚丙烯纤维接枝聚丙烯酸/海藻酸钙杂化凝胶膜置于锥形瓶中，在5℃的温度下，经过pH＝8.7的含1％CaCl₂的Tris-HCl溶液洗脱36h，得到基于聚丙烯纤维单丝载体的牛血红蛋白印迹聚丙烯酸/海藻酸钙杂化凝胶膜。

实施例4.基于聚砜中空纤维载体的卵白蛋白印迹聚丙烯酸/海藻酸钙杂化凝胶膜

将聚砜中空纤维放入体积百分数为10％的丙烯酸水溶液中，加入质量百分比浓度为3％的阻聚剂硫酸亚铁铵，通入氮气作保护，在室温下用500W的紫外灯照射0.5小时，取出后用水冲洗3～5次，除去未反应的单体和均聚物，得到接枝丙烯酸的聚砜中空纤维，随后用质量百分比浓度为5％的氢氧化钠水溶液中和，得到聚丙烯酸钠接枝的聚砜中空纤维；

向质量百分比浓度为5％的卵白蛋白溶液中加入海藻酸钠和聚丙烯酸钠，搅拌使其充分溶解，得到质量百分比浓度为2.5％的海藻酸钠和0.5％的聚丙烯酸钠的混合溶液，静置消泡后待用，同时配制质量百分比浓度为5％的氯化钙水溶液；

将接枝聚丙烯酸钠的聚砜中空纤维浸泡入卵白蛋白、聚丙烯酸钠和海藻酸钠的混合水溶液中0.5小时，取出后滴淌5分钟，用刮刀刮去粘附的过多粘稠溶液，使纤维表面的附着液尽量均匀，立即将其放入氯化钙水溶液中，交联1小时，用去离子水冲洗3～5遍，得到包含卵白蛋白的聚砜中空纤维接枝聚丙烯酸/海藻酸钙杂化凝胶膜；

将包含卵白蛋白的聚丙烯纤维接枝聚丙烯酸/海藻酸钙杂化凝胶膜置于锥形瓶中，在5℃的温度下，经过pH＝8.7的含1％CaCl₂的Tris-HCl溶液洗脱36h，得到基于聚砜中空纤维载体的卵白蛋白印迹聚丙烯酸/海藻酸钙杂化凝胶膜。

Claims (5)

1.一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

a)将纤维放入体积百分数为1％～50％的丙烯酸水溶液中，加入质量百分比浓度为0.5～3％的阻聚剂硫酸亚铁铵，通入氮气作保护，在室温下用500W的紫外灯照射0.2～1小时，取出后用水冲洗3～5次，除去未反应的单体和均聚物，得到接枝聚丙烯酸的纤维，随后用质量百分比浓度为1％～10％的氢氧化钠水溶液中和，得到聚丙烯酸钠接枝的纤维；

b)向质量百分比浓度0.1％～5％的蛋白质溶液中加入海藻酸钠和水溶性添加剂，搅拌使其充分溶解，得到质量百分比浓度为2％～5％的海藻酸钠和0.05％～5％的水溶性添加剂的混合溶液，静置消泡后待用，同时配制质量百分比浓度为1％～10％的氯化钙水溶液；

c)将步骤a)制备的接枝聚丙烯酸钠的纤维浸入蛋白质、水溶性添加剂和海藻酸钠的混合水溶液中0.5～2小时，取出后滴淌2～5分钟，用刮刀刮去粘附的过多粘稠溶液，使纤维表面的附着液尽量均匀，立即将其放入步骤b)配制的氯化钙水溶液中，交联0.5～2小时，用去离子水冲洗3～5遍，得到包含蛋白质的纤维接枝海藻酸钙杂化凝胶膜；

d)将步骤c)制备的包含蛋白质的纤维接枝海藻酸钙杂化凝胶膜放置在锥形瓶中，在5～25℃的温度下，经过pH＝7.0～9.5的含1％CaCl₂的Tris-HCl溶液洗脱12～36h，得到基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜。

2.如权利要求1所述的一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法，其特征是所述的纤维包括聚酰胺、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈和聚砜。

3.如权利要求1所述的一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法，其特征是所述的纤维的形态包括无纺布、丝束、纤维单丝和中空纤维。

4.如权利要求1所述的一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法，其特征是所述的水溶性添加剂包括羟丙基甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、水溶性淀粉、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、磷酸氢二铵、碳酸钠、硅酸钠。

5.如权利要求1所述的一种基于纤维载体的蛋白质印迹海藻酸钙杂化凝胶膜的制备方法，其特征是所述的蛋白质包括牛血清白蛋白、牛血红蛋白、卵白蛋白、溶菌酶、细胞色素C、过氧化氢酶、γ球蛋白、胰岛素。