CN108535249A - 农药残留快速检测点卡 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农药残留快速检测点卡，包括带有多个检测孔的卡体，检测孔内自下而上依次叠放有底物膜、显色剂膜和酶膜；底物膜中含有碘化硫代乙酰胆碱药物活性成分，酶膜中含有乙酰胆碱酯酶。本发明的农残检测点卡利用渗透作用，促使反应液与酶、显色剂、底物依次发生反应，从而通过颜色变化，直观的显示被测样品的农残情况，更加方便快捷，可广泛应用于蔬菜、水果、粮食、水及土壤中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的定性快速测试。同时本发明的检测点卡易于制备且节省检测费用,使用简单可靠又方便快捷，需要样本量少，简便快速，也可适用于大量样本的筛查，结果准确，灵敏度高，准确率大，在实际中具有较大的应用潜力。

Description

农药残留快速检测点卡

技术领域

本发明涉及对蔬菜、水果、粮食、饮用水及土壤中农业残留的检测，尤其是涉及一种农药残留快速检测点卡。

背景技术

随着社会进步和人们生活水平的提高，食品安全问题越来越引起人们的重视，但由于环境污染的不断加剧，果蔬的病虫害也越来越重，绝大部分果蔬需要连续多次施药才能成熟上市。农药作为防治病虫害的重要工具,已逐渐成为农业生产的一个重要环节。有机磷类与氨基甲酸酯类杀农药以其广谱、高效、易降解、半衰期短等优点广泛应用在现代农业中生产,给人类带了巨大的经济效益,但农药的广泛使用以及水果蔬菜中农药的残留也时刻威胁着食品安全、生态环境和人类的健康。所以，许多国际组织和国家政府严格的限制了果蔬中农药残留含量，以保证食品安全。

检测果蔬中农残含量的方法较多，近几年发展的也很快。目前市场上对有机磷和氨基甲酸酯类农药在果蔬中残留量的快速检测方法运用较为广泛的是速测卡法，但是此方法需要用药片沾取待测样品的提取液预反应10分钟，对温度、湿度的控制要求严格；同时在药片与药片相互反应时，依赖人工操作使折叠酶片与底物片反应，既要求严格又操作繁琐，对操作人员的专业知识有一定要求,并且仅限于在专业实验室内进行，满足不了现场对果蔬中农药残留量的快速检测。同时,由于对监管体制的不信任,越来越多的消费者期望能自己对产品进行快速定性检测,尤其是对每日生活所必需的水果蔬菜。因此,迫切需要发展快速、灵敏、低成本的食品安全现场快测技术。

申请号201610246230.5（CN105928929A）公开了一种对进行农残快速检测的点卡，其技术原理采用酶的抑制率法，在检测卡的检测孔内自下而上依次叠放有底物膜和酶膜，底物膜上浸有吲哚乙酸酯，酶膜上浸有乙酰胆碱酯酶，将待测液滴加到检测孔内后，利用渗透作用，促使反应液与酶、底物依次发生反应，从而通过测试卡的颜色变化，直观的显示被测样品的农药残留情况,可广泛应用于蔬菜、水果、粮食、水及土壤中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的定性快速测试。虽然较传统方法简单，但是反应结果需要在15~20分钟后才能出现，仍存在需要改进的空间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高灵敏、低成本、易操作且更为快速读取检测结果的农药残留快速检测点卡。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的农药残留快速检测点卡，包括带有多个检测孔的卡体，所述检测孔内自下而上依次叠放有底物膜、显色剂膜和酶膜；所述底物膜中含有碘化硫代乙酰胆碱药物活性成分，所述酶膜中含有乙酰胆碱酯酶。

其中所述底物膜的制备方法为：

将水溶性成膜材料在搅拌状态下加入到水中，缓慢升温使其完全溶解，得到聚合物凝胶；然后将增塑剂和崩解剂加入进去搅拌均匀，最后加入碘化硫代乙酰胆碱搅拌均匀；将含药溶液滴加到检测孔中经加热干燥后得到底物膜；成品底物膜的组分为：水溶性成膜材料40~75%，增塑剂 5~30%，崩解剂5~30%，碘化硫代乙酰胆碱5~40%，水0~5%。

所述水溶性成膜材料采用预胶化淀粉，所述增塑剂采用聚乙二醇，所述崩解剂采用聚乙烯吡咯烷酮。

所述酶膜是由滤纸膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜在乙酰胆碱酯酶液中经充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.3~0.8mm，直径4~8mm。

所述酶显色剂膜由滤纸膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜在DTNB液中经充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.3~0.8mm，直径4~8mm。

使用时，将待测样本加入到检测孔中，5~15分钟后肉眼观察检测孔中颜色变化，与对照孔进行比对，直接判读结果即可。

本发明的技术原理仍是酶的抑制率法。正常条件下，乙酰胆碱可以被乙酰胆碱酯酶水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质。在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶正常功能有抑制作用，从而抑制底物乙酰胆碱的水解，进而抑制与显色剂反应，产生黄色物质减少。乙酰胆碱酯酶被农药抑制需要有一定的时间反应，因为，底物释放不能太快，否则酶活性抑制不明显，农残检测不灵敏。本发明优化其制备方法，确保底物在2min之后崩解释放，保证酶液被农药抑制充分。

本发明农残检测点卡运用以上原理，通过向检测孔内滴加待检测样品液，使酶膜上的乙酰胆碱酯酶快速溶解到待检测样品液中。若待检测样品不含农药残留，混合液会缓慢的渗入酶膜、显色剂膜，酶与显色剂充分释放。1~2min后底物膜崩解，进而被乙酰胆碱酯酶水解，发生颜色反应。若待检样品含有残留农药时，酶膜上的乙酰胆碱酯酶溶于样品后，在1~2min内活性受到农药一定程度的抑制，进而底物膜崩解后，水解不充分或不水解，颜色变浅或无色。

通过本发明进一步改进的农残检测点卡利用渗透作用，促使反应液与酶、显色剂、底物依次发生反应，从而通过颜色变化，直观的显示被测样品的农残情况，更加方便快捷，可广泛的应用于蔬菜、水果、粮食、水及土壤中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的定性快速测试。同时本发明的检测点卡易于制备且节省检测费用,使用简单可靠又方便快捷，无需特殊的仪器设备，不用要求检测人员专业水平，可以随时随地用于现场中果蔬农残含量的检测；由于样本量需要少，简便快速，也可适用于大量样本的筛查，结果准确，灵敏度高，准确率大，在实际中具有较大的应用潜力。

附图说明

图1是本发明的结构示意图。

图2是图1中卡座的结构示意图。

图3是图1中卡盖的结构示意图。

图4-5是底物膜制备材料优化显色反应效果对比。

图6是两种材料膜片的显色反应效果对比。

图7是温度对显色反应的影响。

图8是时间对显色反应的影响。

图9、图10为检测实例1的反应结果图。

图11、图12为检测实例2的反应结果图。

图13、图14检测实例3的反应结果图。

具体实施方式

如图1~3所示，本发明所述的农药残留快速检测点卡，包括长条形扁平薄壳状的卡体（一般情况下，卡体的长为60~70mm，宽为15~28mm，厚为5~6mm，壁厚为1mm，由工程塑料制成，实际制造时，可根据测试样品的多少改变卡体的大小），卡体由卡座1和通过定位柱10扣合在卡座1上的卡盖组成，卡座1上间隔排列有多个（图中显示四个）检测孔2，检测孔内自下而上依次叠放有底物膜3、酶膜4和显色剂膜5；卡盖由左卡盖6和右卡盖7组成，在左卡盖6上开设有与卡座1最左侧的检测孔相对应的对照品加样孔8，在右卡盖7上开设有与其他三个检测孔2位置分别相对应的三个加样孔9；底物膜3是由水溶性成膜材料、增塑剂和碘化硫代乙酰胆碱等制备而成的快速崩解膜剂；酶膜4由滤纸膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜（优选为滤纸膜）在乙酰胆碱酯酶液中经充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.3~0.8mm，直径4~8mm；显色剂膜5由滤纸膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜（优选为滤纸膜）在DTNB液中经充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.3~0.8mm，直径4~8mm。

本发明所用底物膜的制备方法为：

将水溶性成膜材料在搅拌状态下加入到水中，缓慢升温使其完全溶解，得到聚合物凝胶；然后将增塑剂和崩解剂加入进去搅拌均匀，最后加入碘化硫代乙酰胆碱搅拌均匀；将含药溶液滴加到检测孔中经加热干燥后得到底物膜；成品底物膜的组分为：水溶性成膜材料40~75%，增塑剂 5~30%，崩解剂5~30%，碘化硫代乙酰胆碱5~40%，水0~5%。

使用本发明制备的检测点卡检测果蔬中农残含量的方法如下：

第一步，抽取待测样本，按一定比例稀释成多个样本液后待用；

第二步，从左卡盖6上开设的对照品加样孔8向下方的检测孔中滴加对照纯净水，该检测孔作为检测对照孔，从右卡盖7上开设的其他加样孔向下方的检测孔中依次滴加稀释后的不同样本液；

第三步，室温或30℃条件下，5~10分钟后肉眼观察其他检测孔中颜色变化并与检测对照孔进行比对，直接判读结果即可。

其反应结果有以下四种情况：

a、当检测孔和对照孔同时显示黄色,表示检测结果为阳性,说明该检测样品农残含量在安全范围内。

b、当检测孔不显示颜色,对照孔显示黄色，检测结果为阴性,说明该检测样品农残含量超标。

c、当检测孔显示浅黄色,对照孔显示黄色，若颜色强度与对照比＜50%，表明检测结果为阳性,该检测样品农残含量不超标；若颜色强度与对照比＞50%，表明检测结果为阴性,该检测样品农残含量超标。

d、当检测孔和对照孔均不显色,则表明检测点卡已失效。

下面通过具体实例对本发明做更加详细的介绍

一、本发明检测点卡中底物膜、酶膜和显色剂膜的优化

1、底物膜材料的优化：

由于乙酰胆碱酯酶被农药抑制需要有一定的时间反应，因此，底物释放不能太快，否则酶活性抑制不明显，农残检测不灵敏。对此申请人首先对底物膜所用的材料进行了优化，确保底物在2min之后崩解释放，保证酶液能被农药抑制充分。图4中显示的是四种水溶性成膜材料的效果对比：A为阿拉伯胶、B为聚乙烯吡咯烷酮、C为预胶化淀粉、D为海藻酸钠四种材料，结果显示：水溶性成膜材料采用胶化淀粉效果最好。图5中显示的是四种增塑剂材料的效果对比：A为甘油、B为丙二醇、C为柠檬酸三脂、D为聚乙二醇，结果显示：增塑剂采用聚乙二醇效果最好。

2、酶膜和显色剂膜的优化

由于各种材料的膜性能不同，而酶膜和显色剂膜材料的选择在本发明中有着非常重要的作用，对此申请人选择了三种不同材料的膜片进行试验：滤纸膜（AP）、玻璃纤维素膜（GF）和聚酯纤维素膜（PF）。首先，将AP 、GF和PF膜均切成直径为6mm的圆形片，分别在酶液和显色剂液中进行充分浸泡，待膜片干燥后，分别放置在检测卡孔中，滴加40μL水进行反应， 5~10分钟后，从显色反应的结果可以肉眼看出（如图6所示），A：酶片、显色剂片均为AP, B：酶片、显色剂片均为GF, C：酶片、显色剂片均为PF, D：酶片为AP，显色剂片为PF，E：酶片为GF，显色剂片为AP，F：酶片为GF，显色剂片为PF。结果显示酶膜、显色剂膜均采用AP膜效果较好。

3、反应温度的不同对整个反应的影响也有一定的作用，因此申请人在三个不同的温度条件下进行了反应实验，以探讨反应的最佳温度。将底物膜片、酶膜片分别放置检测卡孔中，滴加40μL水后，将检测卡分别放置在4℃、10℃、20℃、和30℃下10min后进行颜色比对分析。结果如图7所示，在20℃~30℃的条件下，反应结果较佳。

由于酶与底物的反应是逐步完成的，因此在反应时间的处理上申请人仍然进行了最佳时间的优化试验。申请人分别检测了反应时间为2min、5min、10min、20min的颜色变化。结果如图8所示，10min后颜色强度的增加不明显，故本申请的最佳反应时间仅为5~10min，比申请号201610246230.5（CN105928929A）的反应时间（15~20分钟）缩短了一半。

二、下面选择三种施用常用农药辛硫磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果的检测样品采用本发明的检测点卡进行检测试验

检测实例1：

第一步，采用常规方法，配制4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液和0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL三个含有辛硫磷农药的样品液；

第二步，制备底物膜片：

（1）将预胶化淀粉55克在搅拌状态下加入到100毫升水中搅拌溶解,得到凝胶；

（2）在凝胶中加入增塑剂15克、崩解剂10克并搅拌均匀；

（3）加入碘化硫代乙酰胆碱20克搅拌均匀,得到含药溶液；

（4）将含药溶液均匀滴加到检测点卡的检测孔中，滴加量为40微升；

（5）加热干燥,得到含底物的速溶膜片。

第三步，制备酶膜片和显色剂膜片：将滤纸膜制成直径8mm、厚度0.1mm的圆形膜片，分别浸泡在4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液和DTNB液中。经过充分浸泡后将其分别冷冻抽干10~30分钟，得到显色剂膜和酶膜，然后用镊子依次夹取显色剂膜和酶膜放置在检测点卡的底物膜片上，盖上卡盖备用；

第四步，在左卡盖6上开设的对照品加样孔8中向下方的检测孔中滴加对照纯净水作为检测对照孔，从右卡盖7上开设的三个加样孔向下方的检测孔中依次滴加稀释后的三个辛硫磷样本液；纯净水和样本液的滴加量根据检测孔的大小决定，一般为20-100ul即可；

第五步，5~10分钟后肉眼观察：对照孔内酶膜上的乙酰胆碱酯酶可快速溶于纯净水，并进一步渗透到下面的显色剂膜上，2min后底物膜崩解，与乙酰胆碱酯酶发生颜色反应，对照孔显示黄色；滴加0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL三个浓度的辛硫磷样品液的检测孔的颜色从黄色依次递浅，如图9、图10所示，检测孔显示黄，颜色强度与对照比＜50%，表示检测结果为阳性，说明该检测样品中虽含有0.01μg/mL的辛硫磷，但含量在安全范围内；检测孔显示浅黄色，颜色强度与对照比＞50%，表面检测结果为阴性，说明该检测样品中含有0.05μg/mL的辛硫磷，含量超标；检测孔不显示颜色，颜色强度与对照比＞50%，表示检测结果为阴性，说明该检测样品中含有0.1μg/mL的辛硫磷，含量完全超标。结果显示，本发明制备的检测点卡对农药辛硫磷的检出限（0.01μg/mL）明显低于申请号201610246230.5（CN105928929A）的检出限（0.05μg/mL）。

检测实例2

第一步，采用常规方法，配制4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液和0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL三个含有乙酰甲胺磷农药的样品液；

第二步，制备底物膜片：同检测实例1；

第三步，制备酶膜片和显色剂膜片：同检测实例1；

第四步，加样方法同实施例1；

第五步，5~10分钟后肉眼观察：测对照孔内酶膜上的乙酰胆碱酯酶可快速溶于纯净水，并进一步渗透到下面的显色剂膜上，2min后底物膜崩解，与乙酰胆碱酯酶发生颜色反应，对照孔显示黄色，滴加0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL三个浓度的辛硫磷样品液的检测孔的颜色从黄色依次递浅，如图11、图12所示，检测孔显示黄，颜色强度与对照比＜50%，表示检测结果为阳性，说明该检测样品中虽含有0.1μg/mL的乙酰甲胺磷，但含量在安全范围内；检测孔显示浅黄色，颜色强度与对照比＞50%，表面检测结果为阴性，说明该检测样品中含有0.2μg/mL的乙酰甲胺磷，含量超标；检测孔不显示颜色，颜色强度与对照比＞50%，表示检测结果为阴性，说明该检测样品中含有0.5μg/mL的乙酰甲胺磷，含量完全超标；结果显示，本发明制备的检测点卡对农药辛硫磷的检出限（0.2μg/mL）明显低于申请号201610246230.5（CN105928929A）的检出限（0.5μg/mL）。

检测实例3

第一步，采用常规方法，配制4700U/ml的乙酰胆碱酯酶液和0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL三个含有氧化乐果农药的样品液；

制备底物膜片：同检测实例1；

第三步，制备酶膜片和显色剂膜片：同检测实例1；

第四步，加样方法同实施例1；

第五步，5~10分钟后肉眼观察：检测对照孔内酶膜上的乙酰胆碱酯酶可快速溶于纯净水，并进一步渗透到下面的显色剂膜上，2min后底物膜崩解，与乙酰胆碱酯酶发生颜色反应，对照孔显示黄色，滴加0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL三个浓度的氧化乐果样品液的检测孔的颜色从黄色依次递浅，如图13、图14所示，检测孔显示黄，颜色强度与对照比＜50%，表示检测结果为阳性，说明该检测样品中虽含有0.1μg/mL的氧化乐果，但含量在安全范围内；检测孔显示浅黄色，颜色强度与对照比＜50%，表面检测结果为阳性，说明该检测样品中虽含有0.5μg/mL的氧化乐果，含量不完全超标；检测孔不显示颜色，颜色强度与对照比＞50%，表示检测结果为阴性，说明该检测样品中含有1μg/mL的氧化乐果，含量完全超标；结果显示，本发明制备的检测点卡对农药氧化乐果的检出限可达0.5μg/mL。

Claims (5)

1.一种农药残留快速检测点卡，包括带有多个检测孔的卡体，其特征在于：所述检测孔内自下而上依次叠放有底物膜、显色剂膜和酶膜；所述底物膜中含有碘化硫代乙酰胆碱药物活性成分，所述酶膜中含有乙酰胆碱酯酶。

2.根据权利要求1所述的农药残留快速检测点卡，其特征在于：所述底物膜的制备方法为：

将水溶性成膜材料在搅拌状态下加入到水中，缓慢升温使其完全溶解，得到聚合物凝胶；然后将增塑剂和崩解剂加入进去搅拌均匀，最后加入碘化硫代乙酰胆碱搅拌均匀；将含药溶液滴加到检测孔中经加热干燥后得到底物膜；成品底物膜的组分为：水溶性成膜材料40~75%，增塑剂 5~30%，崩解剂5~30%，碘化硫代乙酰胆碱5~40%，水0~5%。

3.根据权利要求2所述的农药残留快速检测点卡，其特征在于：所述水溶性成膜材料为预胶化淀粉，所述增塑剂为聚乙二醇，所述崩解剂聚乙烯吡咯烷酮。

4.根据权利要求1所述的农药残留快速检测点卡，其特征在于：所述酶膜是由滤纸膜、尼龙膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜在乙酰胆碱酯酶液中经充分浸泡常温干燥制成，其厚度为0.3~0.8mm，直径4~8mm。

5.根据权利要求1所述的农药残留快速检测点卡，其特征在于：所述酶显色剂膜由滤纸膜、聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜在DTNB液中经充分浸泡并经冷冻抽干后制成，其厚度为0.3~0.8mm，直径4~8mm。