CN102399850A - 一种检测农药残留的速测卡及其制备方法和应用 - Google Patents

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谭芙蓉
王利刚
赵凯
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Abstract

本发明涉及一种检测农药残留的速测卡及其制备方法和应用。所述速测卡包括：盖膜、第一塑料板、加样孔、酶片、塑料膜、第二塑料板和底物片。其中，所述盖膜粘贴于第一塑料板的表面上；所述第一塑料板的表面上设有至少两个加样孔，加样孔的背面粘贴有固定了家蝇乙酰胆碱酯酶的酶片，所述酶片位置与加样孔相对；所述第二塑料板上设有与所述酶片位置相对应的粘贴有固定了乙酰靛酚的底物片；所述塑料膜置于第一、第二塑料板中间。本发明的速测卡其采用的酶是经过分子进化的家蝇乙酰胆碱酯酶，具有比活性高、灵敏性好、稳定性强等优点，因而可快速简便地应用于农产品、食品、土壤尤其是蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测中。

Description

一种检测农药残留的速测卡及其制备方法和应用
技术领域
本发明属食品安全领域，涉及一种检测农药残留的速测卡及其制备方法和应用，具体涉及一种检测农药残留的速测卡及其制备方法，以及该速测卡在有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测中的应用。
背景技术
近年来，食品安全问题已经严重威胁着人类的健康，而果蔬中由于过量使用或滥用农药而导致的农药残留及其急慢性中毒已经引起了社会的高度重视。绿色和平组织于2008年12月和2009年2月在北京、上海和广州的多家超市及农贸市场随机选取了当时当季的常见水果蔬菜，对这些样品上的农药残留这些样品上的农药残留进行了检测。结果显示，不仅大多数蔬菜水果都有农药残留，更为严重的是，45份样品中竟然检测出50种农药成分，数量之多让人担忧。同时混合农药残留的情况非常严重。由于媒体的渲染，这一信息在消费者中造成了一定的恐慌。2010年1月至2月初，海南豇豆“有毒”事件发生后，消费者谈豆色变。自2010年2月初武汉对海南豇豆发出禁令以来，合肥、南京、杭州等多个城市对检测含有禁用农药水胺硫磷的豇豆采取销毁处理。与此同时，农药残留问题也给农产品生产和正常贸易带来了许多负面影响。近年来，我国农产品因农药残留超标而被进口国拒绝、扣留、退货、索赔和中止合同的事件时有发生。如2002年上海出口到韩国的紫菘因农药残留超标问题而遭到退货，造成直接经济损失达500多万元。一些国家更是利用国际贸易技术壁垒，人为地对我国农产品出口设置障碍，使我国蔬菜出口屡屡受阻。
因此，如何快速、灵敏、准确地检测出农产品及其加工产品中的残留农药，是解决上述问题的关键。目前农药残留检测主要有两大类方法：色谱检测法和快速检测法。色谱检测法因为其监测数据的精确性和准确性可为农药残留执法提供有力的参考依据。但其操作程序复杂、需要高技术专业检测人员，检测仪器和费用都相当昂贵，不利于大众化。快速检测法操作简便、不需要昂贵仪器，适合于现场检测及大批样品的筛选检测，主要用来防止有机磷和氨基甲酸酯类农药残留严重超标的蔬菜和水果流入市场。快速检测法中应用最为广泛的是酶抑制法：酶抑制法检测农产品中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留是根据有机磷农药的毒理特性对酶分解底物的抑制作用而建立起来的；其中使用较多的是乙酰胆碱酯酶(简称AChE)。
中国专利申请02159668.9公开了一种包括乙酰胆碱酯酶、保护剂、底物与显色剂的试剂盒；中国专利申请200410053611.9公开了一种从人血清中提取乙酰胆碱酯酶酶片来检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的蔬菜农药残留速测纸卡及其制备方法；中国专利申请200510090386.0公开一种用乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶之一来检测有机磷或氨基甲酸酯类农药残留快速检测用液体酶试剂及其制备方法与使用方法。
应用上述几种试剂盒或测试卡在一定程度上解决了检测农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的问题，然而，它们均具有应用的乙酰胆碱酯酶灵敏度不高，极易失活，推广困难等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测农药残留的速测卡及其制备方法和应用。本发明的检测农药残留的速测卡，其采用的酶是经过分子进化的家蝇乙酰胆碱酯酶，它具有比活性高、灵敏性好、稳定性强等优点，因而可快速简便地应用于农产品、食品、土壤的检测中，尤其是蔬菜、水果中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测中，特别是农贸市场、超市、工厂及学校食堂的农药残留快速检测。
为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案来实现。
所述的检测农药残留的速测卡，包括：盖膜、第一塑料板、加样孔、酶片、塑料膜、第二塑料板和底物片。其中，所述盖膜粘贴于第一塑料板的表面上；所述第一塑料板的表面上设有至少两个加样孔，加样孔的背面粘贴有固定了家蝇乙酰胆碱酯酶的酶片，所述酶片位置与加样孔相对；所述第二塑料板上设有与所述酶片位置相对应的粘贴有固定了乙酰靛酚的底物片；所述塑料膜置于第一、第二塑料板中间。
所述第一、第二塑料板面积相等。并且该塑料板也可以用例如卡片、硬纸板类物质替换。
所述各加样孔的间距为1-1.5cm。
所述酶片的直径大于加样孔的直径。
所述底物片的直径大于酶片的直径。
所述速测卡的各器件均可使用明胶进行粘贴。
所述的检测农药残留的速测卡的制备方法，包括以下步骤：
1.酶片的制备
本发明所用的酶源为经过分子进化得到的家蝇乙酰胆碱酯酶。酶的固定化采用交联法，即用双功能团试剂(如戊二醛)、牛血清蛋白和磷酸缓冲液把酶固定到醋酸纤维膜上。将醋酸纤维膜裁成两种直径不同的圆片，在0～4℃下将乙酰胆碱酯酶、磷酸缓冲溶液、双功能试剂、牛血清蛋白混合，加入直径较小的醋酸纤维膜圆片，浸泡15～20min，然后取出，置于小型通风橱中阴干，即为酶片。
其中醋酸纤维膜圆片的直径大于加样孔直径，加入的乙酰胆碱酯酶与醋酸纤维膜的比例为3～5U/片，加入的双功能团试剂与醋酸纤维膜的比例为0.2～0.5ul/片，加入的牛血清蛋白与醋酸纤维膜的比例为1～3ul/片。
2.底物片的制备
在0～4℃下，将乙酰靛酚溶入乙醇或丙酮中，溶液浓度为400～800mg/L，然后，把直径稍大的醋酸纤维膜圆片放入该溶液中，浸泡15～20min，取出置于小型通风橱中阴干，即为底物片。
其中醋酸纤维膜圆片的直径大于酶片的直径，所述乙酰靛酚的固定量为5～10mg/片。
3.速测卡的制备
将塑料板制成两个面积相等的长方形；在第一塑料板上至少打两个加样孔，孔间间距为1～1.5cm；用明胶将上述制备好的酶片固定在该塑料板加样孔的背部，将上述制备好的底物片固定在第二塑料板上与酶片相应的位置；再在第一塑料板表面贴一层盖膜，两个塑料板之间贴一塑料膜，即制得本发明的速测卡。
本发明的速测卡在使用时，首先掀开第一塑料板表面上的盖膜，在各加样孔中分别加入待测样品的磷酸盐洗涤液和空白对照，使之与酶片进行反应；然后抽出其底部的塑料膜，观察酶片的颜色，若酶片为天蓝色，则为阴性，说明样品中无农药残留；若酶片不变色或略有浅蓝色，即为阳性；其中不变色为强阳性，说明样品中农药残留较高，而浅蓝色为弱阳性，说明样品溶液农药残留量较低。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明制备的酶片活性高、稳定性强，对有机磷和氨基甲酸酯类农药更敏感。在速测卡的结构设计上，采用检测样品与对照样品合二为一的构思，实现了反应过程的实时观察，反应色差明显，结果判定容易。因而可广泛应用于有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测中。
并且，本发明的速测卡适用范围广，可快速、简便地应用于蔬菜、水果等农产品中农药残留以及水体、土壤等环境中农药污染的检测，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会和生态效益。
附图说明
图1为本发明的检测农药残留的速测卡的结构示意图。
图2为本发明的检测农药残留的速测卡的另一结构示意图。
其中，10为盖膜，20为第一塑料板，30为加样孔，40为塑料膜，50为第二塑料板，60为底物片。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1
如图1所示，为本发明的检测农药残留的速测卡的结构示意图，包括：盖膜10、第一塑料板20、加样孔30、塑料膜40、第二塑料板50、底物片60。其中，盖膜10贴于第一塑料板20的表面上，该塑料板20上设有两个加样孔30(间距1-1.5cm)，加样孔30下贴有酶片(图中未标出)，塑料膜40置于第一塑料板20与第二塑料板50中间，该第二塑料板50上贴有两个底物片60，其位置与酶片相对应。
样品处理：随机选取市售的大白菜、芹菜、生菜、辣椒、黄瓜和茄子等几种常见的蔬菜，用磷酸盐缓冲液(0.1mmol/L，pH＝8.0)进行冲洗，保留该磷酸盐洗涤液。
样品检测：首先撕开第一塑料板20表面上的盖膜10，将空白对照加在其中一个加样孔30内，用吸管吸取上述保留的磷酸盐洗涤液，滴加在另一个加样孔30内，待反应几分钟后，抽出第一塑料板20与第二塑料板50中间的塑料膜40，使酶片与底物片60接触发生反应，再观察酶片的颜色，判断结果。
实施例2
图2为本发明的检测农药残留的速测卡的另一结构示意图。其组装与图1相同，不同之处在于，第一塑料板20上设有三个加样孔30，相对应的第二塑料板50上则贴有三个底物片60。使用方法同实施例1，因而可同时检测两个样品。
实施例3
将醋酸纤维膜分别裁成直径为0.8cm和1.0cm的两种小圆片，用于制作酶片和底物片。
在4℃下将家蝇乙酰胆碱酯酶、戊二醛、牛血清蛋白分别按3U/片、0.2μl/片、1μl/片的比例与4ml磷酸缓冲液混合，加入直径为0.8cm的醋酸纤维膜，浸泡15分钟后，取出并置于小型通风橱中阴干，即为酶片。
制作底物片时可将乙酰靛酚溶入丙酮中，浓度为400mg/L，加入直径为1.0cm的醋酸纤维膜，浸泡15分钟后，取出置于小型通风橱中阴干，即为底物片。
将塑料板制成两个长4cm，宽2cm的长方形。其中，在第一塑料板上打孔，孔的直径为0.5cm，将上述酶片固定在该塑料板孔的底面。将上述底物片固定在第二塑料板上与酶片相应的位置。在第一塑料板表面贴一层盖膜，第一、第二塑料板中间再贴一层塑料膜，即制成本发明的速测卡。
实施例4
将醋酸纤维膜分别裁成直径为1.0cm和1.2cm的两种小圆片，用于制作酶片和底物片。
在4℃下将家蝇乙酰胆碱酯酶、戊二醛、牛血清蛋白分别按4U/片、0.4μl/片、2μl/片的比例与4ml磷酸缓冲液混合，加入直径为1.0cm的醋酸纤维膜，浸泡15分钟后，取出并置于小型通风橱中阴干，即为酶片。
制作底物片时可将乙酰靛酚溶入丙酮中，浓度为600mg/L，加入直径为1.2cm的醋酸纤维膜，浸泡15分钟后，取出置于小型通风橱中阴干，即为底物片。
将塑料板制成两个长5cm，宽2.5cm的长方形。其中，在第一塑料板上打孔，孔的直径为0.7cm，将上述酶片固定在该塑料板孔的底面。将上述底物片固定在第二塑料板上与酶片相应的位置。在第一塑料板表面贴一层盖膜，第一、第二塑料板中间再贴一层塑料膜，即制成本发明的速测卡。
实施例5
将醋酸纤维膜分别裁成直径为1.2cm和1.4cm的两种小圆片，用于制作酶片和底物片。
在0℃下将家蝇乙酰胆碱酯酶、戊二醛、牛血清蛋白分别按5U/片、0.5μl/片、3μl/片的比例与4ml磷酸缓冲液混合，加入直径为1.2cm的醋酸纤维膜，浸泡20分钟后，取出并置于小型通风橱中阴干，即为酶片。
制作底物片时可将乙酰靛酚溶入丙酮中，浓度为800mg/L，加入直径为1.4cm的醋酸纤维膜，浸泡20分钟后，取出置于小型通风橱中阴干，即为底物片。
将塑料板制成两个长6cm，宽3cm的长方形。在第一塑料板上打孔，孔的直径为1cm，将上述酶片固定在该塑料板孔的底面。将上述底物片固定在第二塑料板上与酶片相应的位置。在第一塑料板表面贴一层盖膜，第一、第二塑料板中间再贴一层塑料膜，即制成本发明的速测卡。
实施例6
为了进一步检测本发明的速测卡的积极效果，随机选取市售的大白菜、芹菜、生菜、辣椒、黄瓜和茄子等几种常见的蔬菜，用磷酸盐缓冲液洗涤，然后用本发明的速测卡进行检测该洗涤液，并结合气相色谱检测结果进行比较，结果见表1。
表1本发明的速测卡和气相色谱的检测结果比较
Figure BDA0000026374390000061
从表1可以看出，用本发明速测卡检测成阳性的样品，相应地用气相色谱法检测出了其农药残留；用本发明速测卡检测成阴性的样品，相应地用气相色谱法未检测出其农药残留。
随着我国经济的发展，人们对农产品的安全要求越来越高，农药残留的快速检测技术不仅是政府监管部门和生产企业的需求，普通消费者都需要对每天购买的蔬菜、水果等进行检测以确保其安全性。用本发明的速测卡进行农药残留检测，操作简单，测定时间短，不需贵重的仪器，费用低，适合于现场的快速检测，是一种有广阔市场前景的产品。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (12)

1.一种检测农药残留的速测卡，包括：盖膜、第一塑料板、加样孔、酶片、塑料膜、第二塑料板和底物片；其特征在于，所述盖膜粘贴于第一塑料板的表面上；所述第一塑料板的表面上设有至少两个加样孔，加样孔的背面粘贴有固定了家蝇乙酰胆碱酯酶的酶片，所述酶片位置与加样孔相对；所述第二塑料板上设有与所述酶片位置相对应的粘贴有固定了乙酰靛酚的底物片；所述塑料膜置于第一、第二塑料板中间。
2.根据权利要求1所述的检测农药残留的速测卡，其特征在于，所述第一、第二塑料板面积相等。
3.根据权利要求1所述的检测农药残留的速测卡，其特征在于，所述各加样孔的间距为1-1.5cm。
4.根据权利要求1所述的检测农药残留的速测卡，其特征在于，所述酶片的直径大于加样孔的直径。
5.根据权利要求1所述的检测农药残留的速测卡，其特征在于，所述底物片的直径大于酶片的直径。
6.权利要求1所述的检测农药残留的速测卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)酶片的制备：在0～4℃下，将乙酰胆碱酯酶、磷酸缓冲溶液、双功能试剂戊二醛、牛血清蛋白混合，加入直径稍小的醋酸纤维膜圆片，浸泡15～20min，然后取出，置于小型通风橱中阴干，即为酶片；
2)底物片的制备：在0～4℃下，将乙酰靛酚溶入乙醇或丙酮中，溶液浓度为400～800mg/L，然后，将直径稍大的醋酸纤维膜圆片放入该溶液中，浸泡15～20min，取出置于小型通风橱中阴干，即为底物片；
3)速测卡的制备：将塑料板分别制成两个面积相等的长方形；在第一塑料板上打至少两个加样孔，各孔间距为1～1.5cm；用明胶将上述酶片固定在该塑料板加样孔的背面，将上述底物片固定在第二塑料板上与酶片相对应的位置；再在第一塑料板表面贴一层盖膜，第一、第二塑料板中间贴一层塑料膜，即制得所述的检测农药残留的速测卡。
7.根据权利要求6所述的检测农药残留的速测卡的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的乙酰胆碱酯酶是经过分子进化得到的基因工程酶。
8.根据权利要求6所述的检测农药残留的速测卡的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的乙酰胆碱酯酶与醋酸纤维膜的比例为3～5U/片。
9.根据权利要求6所述的检测农药残留的速测卡的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的双功能团试剂戊二醛与醋酸纤维膜的比例为0.2～0.5ul/片。
10.根据权利要求6所述的检测农药残留的速测卡的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的牛血清蛋白与醋酸纤维膜的比例为1～3ul/片。
11.根据权利要求6所述的检测农药残留的速测卡的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的乙酰靛酚的固定量为5～10mg/片。
12.权利要求1所述的检测农药残留的速测卡在有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测中的应用。
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