CN107305212B - 一种有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学方法，其用免疫学方法检测胆碱酯酶底物变化情况，以推断样品中是否含有有机磷类和氨基甲酸酯类农药。本发明还公开了一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的试剂盒。本发明通过间接检测胆碱酯酶的活性来判定被检样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留情况，具有检测范围广、高灵敏、简便易行、费用低廉。

Description

一种有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学检测方法及试 剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及了一种有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学检测方法及试剂盒。
背景技术
有机磷类和氨基甲酸酯类农药由于其杀虫谱广，药效高，在我国的农业生产实践中得到了广泛的应用。由于其使用量大，应用面广，在食品安全和环境保护方面受到了普遍关注。尤其是一些剧毒、高毒的农药品种，如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫磷等农药，由于其造成的急性毒性和残留毒性问题，已被禁止在蔬菜和水果上使用。但由于农民缺乏科学用药知识，常常出现高毒、剧毒农药的乱用和滥用问题。即使是那些毒性相对较低的农药，也存在农民加大用药剂量或采收前施药（不遵循安全间隔期）等问题，给消费者和环境安全造成了极大危害。因此开展农药残留的快速检测具有重要的现实意义。目前有机磷类农药残留检测常用的方法是酶抑制法和色谱分析法。色谱法的测定准确度和灵敏度都较高，但存在仪器化程度高、前处理操作复杂、耗时较长的问题。酶抑制法采用胆碱酯酶检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药，具有广谱性，且简便、快捷，但是其灵敏性较低（远达不到国家标准限量要求），而且需要复杂和昂贵的辅助设备，进一步限定其应用。
近年来，免疫测定技术在生物技术领域得到迅猛发展，它以特异性好、简单、快速、灵敏度高等优点，得到广泛的应用。随着免疫学技术的发展，其在农药残留中的检测应用也越来越深入，其中酶联免疫吸附测定（ELISA物质）技术在农药残留分析中表现最为活跃，已有大量文献报道了杀菌剂、杀虫剂、除草剂和一些植物（昆虫）生长调节剂的ELISA物质检测技术方法的建立，其检测水平可达到ng、甚至pg级。免疫层析法是另外一种广泛应用的检测方法，已经广泛应用于临床、兽药检测领域。目前，在农残检测领域也有免疫层析检测产品出现。但是不管是ELISA物质还是免疫层析试纸法都只能一次检测一两种（多的五六种）农药残留，根本无法满足目前在用农药达几百种的现实需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学方法，其具有广谱性，简便、快捷、低成本，且具有高灵敏性。本发明还提供了检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的试剂盒。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学方法，其特征在于，用免疫学方法检测胆碱酯酶底物变化情况，以推断样品中是否含有有机磷类和氨基甲酸酯类农药。
如上所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学方法，其特征在于，所述免疫学方法是包括免疫层析法、酶联免疫吸附试验、时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析在内的任意一种免疫学分析方法。
如上所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学方法，其特征在于，所述胆碱酯酶可以是乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶中的一种或两者的混合物，其来源可以是动物、植物、基因工程重组蛋白。
如上所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学方法，其特征在于，所述用免疫学方法检测胆碱酯酶底物变化情况为用免疫学方法检测可被胆碱酯酶分解的A物质的变化情况，或者用免疫学方法检测被胆碱酯酶分解A物质而产生的B物质的变化情况，或者用免疫学方法检测A物质或B物质与D物质反应而生成的C物质的变化情况，或者用免疫学方法检测所述D物质的变化情况。
如上所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学方法，其特征在于，所述A物质为卤灵酯、吲哚乙酸酯、1-甲基-7-乙酰基喹啉、α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、硫代丁酰胆碱、有机磷类药物、DTNB、靛酚乙酸酯中任一种。
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，其特征在于，包括免疫层析试纸条、含有胆碱酯酶的容器、含有A物质的容器；所述免疫层析试纸条的层析膜上设有包被有A物质-载体蛋白偶联物或B物质-载体蛋白偶联物或C物质-载体蛋白偶联物或D物质-载体蛋白偶联物的检测区；所述A物质为在胆碱酯酶作用下可被分解的物质；所述B物质为所述A物质在胆碱酯酶作用下分解获得的物质；所述C物质为A物质或B物质与D物质的反应产物。
如上所述所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，其特征在于，还包括含有D物质的容器。
如上所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析试剂盒，其特征在于，还包括含有纳米颗粒-抗A物质抗体偶联物或纳米颗粒-抗B物质抗体偶联物或纳米颗粒-抗C物质抗体偶联物或纳米颗粒-抗D物质抗体偶联物的容器。
一种检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括含有包被有A物质-载体蛋白偶联物或B物质-载体蛋白偶联物或C物质-载体蛋白偶联物或D物质-载体蛋白偶联物的微孔板；所述A物质为在胆碱酯酶作用下可被分解的物质；所述B物质为所述A物质在胆碱酯酶作用下分解获得的物质；所述C物质为A物质或B物质与D物质的反应产物。
如上所述的检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的酶联免疫试剂盒，其特征在于，还含有胆碱酯酶、A物质。
本发明具有如下有益效果：本发明通过间接检测胆碱酯酶的活性来判定被检样品中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留情况，具有检测范围广（能够有效检测出绝大多数有机磷和氨基甲酸酯类农药）、高灵敏（检测下限远优于现有的酶抑制法，达到或超过农药残留限量标准要求）、简便易行（整个检测过程不需要用到昂贵的仪器设备和专业人员，几乎任何场合均可开展检测，且一个样品仅需一个检测反应）、费用低廉（试纸条和酶联免疫吸附试验是公认的低成本检测方法，而且本发明所公开的方法仅需一个检测反应就可知晓样本有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留情况，大大节省了检测成本）。
具体实施方式
本发明所提供的一种快速检测有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫学方法，该方法采用免疫学方法检测胆碱酯酶底物变化情况，从而推断有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留与否。其原理是：有机磷类和氨基甲酸酯类农药会抑制胆碱酯酶将A物质分解为B物质，用免疫学方法直接或间接测定A物质或B物质的存在即可知有机磷类和氨基甲酸酯类农药的残留情况。本方法具有检测范围广（能够有效检测出绝大多数有机磷类和氨基甲酸酯类农药）、高灵敏（检测下限远优于现有的酶抑制法，达到或超过农药残留限量标准要求）、简便易行（整个检测过程不需要用到昂贵的仪器设备和专业人员，几乎任何场合均可开展检测）、费用低廉（试纸条和酶联免疫吸附试验是公认的低成本检测方法，而且本发明所公开的方法仅需一个检测反应就可知晓样本有机磷类和氨基甲酸酯类农药的残留情况，大大节省了检测成本）。
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1 待检样品处理方法
1.肉类：1）取0.5g肉置于10ml烧杯中，加入5ml丙酮浸泡5min，每隔1min振摇1次，再加0.2g碳酸钙；2）取0.5ml上述液体于5ml烧杯中，吹干丙酮；加入0.3ml0.1M Tris-HCl（pH8.0）缓冲液溶解；3）加入0.1ml 0.3%次氯酸钙，放置10min；4）再加入0.3ml 10%亚硝酸钠，摇匀，备检。
2.乳：1）生鲜乳、巴氏灭菌乳不需处理，直接检测。2）发酵乳：用两倍质量的0.1MTris-HCl（pH8.0）调节pH至pH8.0，备检。3）乳粉：取1g乳粉，加入9ml去离子水，溶解，备检。
3.蜂蜜：用0.1M Tris-HCl（pH8.0）稀释10倍，备检。
4.尿液：用0.1M Tris-HCl（pH8.0）稀释2倍，备检。
5.果蔬：1）取1g菜叶，用5ml去离子水浸泡1min，取液体，备检。2）用5ml去离子水洗涤约10平方厘米水果表皮。
6.水：1）自来水、河水、湖水等较洁净的水：直接检测。2）污水：用中速定性滤纸过滤，收集滤液，备检。
7.血液：分离血清或血浆，备检。
实施例2 检测DTNB(D物质)的免疫层析方法
1.金标抗5,5-二硝基-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）单克隆抗体的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg抗DTNB单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%（W/V），继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往赛多利斯CN95硝酸纤维素膜上按照0.8μl/cm的量依次喷涂浓度为2mg/ml的DTNB-载体蛋白偶联物（DTNB检测区，可以是DTNB-牛血清白蛋白、DTNB-卵清蛋白或者DTNB与其他蛋白质分子的共价偶联物）、0.05mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl（pH8.0）、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡无纺布10min；置于37℃干燥，备用。
4.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有DTNB检测区、质控区。
5.检测样品：
检测方式一：1）往反应微孔1（容器1）中加入20ng 硫代丁酰胆碱（A物质）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、5U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1中的液体转至含有80ng DTNB（D物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀；3）将反应微孔2中的液体转至含有8μl金标抗DTNB单克隆抗体的反应微孔3（容器3）中，吹打混匀，置于40℃下3min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔3中，3min后观察结果。
检测方式二：1）往反应微孔1（容器1）中加入7U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有13ng 硫代丁酰胆碱（A物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀；置于40℃ 孵育3min；3）将反应微孔2中的液体转至含有25ng DTNB（D物质）的反应微孔3（容器3）中，吹打混匀；4）将反应微孔3（容器3）中的液体转至含有8μl金标抗DTNB抗体的反应微孔4（容器4）中，吹打混匀，置于40℃孵育3min；5）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔4中，3min后观察结果。
检测方式三： 1）往反应微孔1（容器1）中加入31ng 硫代丁酰胆碱（A物质）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、5U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1中的液体转至含有110ng DTNB（D物质）、8μl金标抗DTNB抗体的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀，置于40℃孵育3min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔3中，3min后观察结果。
检测方式四：1）往反应微孔1（容器1）中加入23ng 硫代丁酰胆碱（A物质）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、80ng DTNB（D物质）、8μl金标抗DTNB抗体、5.6U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀，置于40℃孵育30min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔1（容器1）中，3min后观察结果。
检测方式五： 1）往反应微孔1（容器1）中加入18ng 硫代丁酰胆碱（A物质）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、5U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1中的液体转至含有55ng DTNB（D物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀；3）将反应微孔2中的液体转入含有8μl金标抗DTNB抗体的反应微孔3（容器3）中，置于40℃孵育3min；5）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔3中，3min后观察结果。
针对不同待检样品采用不同检测方法的检测结果见表1~4，本实施例的检测方法任选检测方式一~五中的一种。
表1 检测果蔬中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
表2 检测蜂蜜中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
表3 检测水中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
表4 本法检测羊乳中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
实施例3 检测TNB(C物质)的免疫层析方法
1.金标抗5-巯基-2-硝基苯甲酸（TNB）的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入13μg抗TNB单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%（W/V），继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往赛多利斯CN95硝酸纤维素膜上按照1.0μl/cm的量依次喷涂浓度为2mg/ml的TNB-载体蛋白偶联物（TNB检测区，可以是TNB-牛血清白蛋白、TNB-卵清蛋白或者TNB与其他蛋白质分子的共价偶联物）、0.03mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl（pH8.0）、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡奥斯龙8964玻璃纤维 10min；置于37℃干燥，备用。
4.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有TNB检测区、质控区。
5.检测样品：
检测方式一：1）往反应微孔1中加入15ng 硫代丁酰胆碱（A物质）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、5U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1中的液体转至含有90ng DTNB（D物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀；3）将反应微孔2中的液体转至含有8μl金标抗TNB抗体的反应微孔3（容器3）中，吹打混匀，置于40℃孵育3min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔3（容器3）中，3min后观察结果。
检测方式二：1）往反应微孔1（容器1）中加入4U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有20ng 硫代丁酰胆碱（A物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀；置于40℃ 孵育4min；3）将反应微孔2中的液体转至含有60ng DTNB（D物质）的反应微孔3中，吹打混匀；4）将反应微孔3中的液体转至含有8μl金标抗DTNB抗体的反应微孔4（容器4）中，吹打混匀，置于40℃孵育3min；5）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔4（容器4）中，3min后观察结果。
检测方式三： 1）往反应微孔1（容器1）中加入26ng 硫代丁酰胆碱(A物质)、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、5U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有80ng DTNB（D物质）、8μl金标抗TNB抗体的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀，置于40℃孵育3min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔2（容器2）中，3min后观察结果。
检测方式四：1）往反应微孔1（容器1）中加入20ng 硫代丁酰胆碱（A物质）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、70ng DTNB（D物质）、8μl金标抗TNB抗体、5U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀，置于40℃孵育30min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔1（容器1）中，3min后观察结果。
针对不同待检样品采用不同检测方法的检测结果见表5，本实施例的检测方法任选检测方式一~四中的一种。
表5 检测果蔬中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
实施例4 检测TNB(C物质)的免疫层析方法
1.金标抗5-巯基 - 2-硝基苯甲酸（TNB）单克隆抗体的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入13μg抗TNB单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%（W/V），继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往赛多利斯CN95硝酸纤维素膜上按照1.0μl/cm的量依次喷涂浓度为2mg/ml的TNB-载体蛋白偶联物（TNB检测区，可以是TNB-牛血清白蛋白、TNB-卵清蛋白或者TNB与其他蛋白质分子的共价偶联物）、0.03mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl（pH8.0）、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡奥斯龙8964玻璃纤维 10min；置于37℃干燥，备用。
4.结合垫的制备：将金标抗TNB单克隆抗体按照2μl/cm喷涂至8964玻璃纤维上，于37℃干燥，备用。
5.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有TNB检测区、质控区。
6.检测样品：
检测方式一：1）往反应微孔1（容器1）中加入10ng 硫代丁酰胆碱（A物质），加入200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、3U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有50ng DTNB（D物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀；3）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔2（容器2）中，5min后观察结果。
检测方式二：1）往反应微孔1（容器1）中加入5U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有20ng 硫代丁酰胆碱(A物质)的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀；置于40℃ 孵育5min；3）将反应微孔2（容器2）中的液体转至含有70ng DTNB（D物质）的反应微孔3（容器3）中，吹打混匀；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔3（容器3）中，5min后观察结果。
检测方式三： 1）往反应微孔1（容器1）中加入20ng 硫代丁酰胆碱（A物质）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、5U丁酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有80ng DTNB（D物质）反应微孔2（容器2）中，吹打混匀；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔2（容器2）中，5min后观察结果。
针对不同待检样品采用不同检测方法的检测结果见表6~7，本实施例的检测方法任选检测方式一~三中的一种。
表6 检测果蔬中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
表7 本法检测牛乳中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
实施例5 检测3-吲哚乙酸酯(A物质)的免疫层析方法
1.金标抗3-吲哚乙酸酯的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入28μg抗3-吲哚乙酸酯单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%（W/V），继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往赛多利斯CN95硝酸纤维素膜上按照1.0μl/cm的量依次喷涂浓度为1.5mg/ml的3-吲哚乙酸酯-载体蛋白偶联物（3-吲哚乙酸酯检测区，可以是3-吲哚乙酸酯-牛血清白蛋白、3-吲哚乙酸酯-卵清蛋白或者3-吲哚乙酸酯与其他蛋白质分子的共价偶联物）、0.02mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl（pH8.0）、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡奥斯龙8964玻璃纤维 10min；置于37℃干燥，备用。
4.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有3-吲哚乙酸酯检测区、质控区。
5.检测样品：
检测方式一：1）往反应微孔1（容器1）中加入5U乙酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有75ng 3-吲哚乙酸酯（A物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀，置于40℃孵育3min；3）将反应微孔2中的液体转至含有10μl金标抗3-吲哚乙酸酯抗体的反应微孔3（容器3）中，吹打混匀，置于40℃孵育3min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔3（容器3）中，3min后观察结果。
检测方式二：1）往反应微孔1（容器1）中加入5U乙酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有50ng 3-吲哚乙酸酯（A物质）、15μl金标抗3-吲哚乙酸酯抗体的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀，置于40℃5min；5）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔2（容器2）中，4min后观察结果。
检测方式三： 1）往反应微孔1（容器1）中加入200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、110ng 3-吲哚乙酸酯（A物质）、8μl金标抗3-吲哚乙酸酯抗体、5U乙酰胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀，置于40℃孵育30min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔1（容器1）中，3min后观察结果。
针对不同待检样品采用不同检测方法的检测结果见表8~9，本实施例的检测方法任选检测方式一~三中的一种。
表8 检测果蔬中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
表9 本法检测牛乳中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
实施例6 以3-吲哚乙酸酯为底物，检测靛蓝(B物质)的免疫层析方法
1.荧光纳米颗粒标记抗靛蓝单克隆抗体的制备：取1ml粒径120nm的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，用50mM MES（pH6.0）洗涤两次；1ml 50mM MES（pH6.0）重选颗粒；加入EDC，使其终浓度为5mg/ml；室温避光反应30min；13000rpm 10min，弃掉上清；用50mM MES（pH6.0）洗涤1次；加入200μg抗靛蓝单克隆抗体；室温反应60min；加入BSA至终浓度1%(W/V)，继续室温反应60min；13000rpm 10min，弃掉上清；50mM MES（pH6.0）洗涤两次；离心，用10ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往密理博135硝酸纤维素膜上按照1.0μl/cm的量依次喷涂浓度为2mg/ml的靛蓝-载体蛋白偶联物（靛蓝检测区，可以是靛蓝-牛血清白蛋白、靛蓝-卵清蛋白或者靛蓝与其他蛋白质分子的共价偶联物）、0.02mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3. 样品垫的制备：用20mM Tris-HCl（pH8.0）、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡奥斯龙8964玻璃纤维 10min；置于37℃干燥，备用。
4.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有靛蓝检测区、质控区。
5. 检测样品：
检测方式一：1）往反应微孔1（容器1）中加入15U乙酰胆碱酯酶（来源于家蝇、鱼、鸟、马、基因工程重组蛋白）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有75ng 3-吲哚乙酸酯（A物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀，置于40℃孵育3min；3）将反应微孔2中的液体转至含有10μl荧光纳米颗粒标记抗靛蓝单克隆抗体（靛蓝：B物质）的反应微孔3（容器3）中，吹打混匀，置于40℃ 3min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔3（容器3）中，3min后于紫外光下观察结果。
检测方式二：1）往反应微孔1（容器1）中加入5U乙酰胆碱酯酶（来源于动物、基因工程重组蛋白皆可）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有50ng 3-吲哚乙酸酯（A物质）、15μl荧光纳米颗粒标记抗靛蓝单克隆抗体的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀，置于40℃15min；5）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔2（容器2）中，4min后于紫外光下观察结果。
检测方式三： 1）往反应微孔1（容器1）中加入200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、110ng 3-吲哚乙酸酯（A物质）、8μl荧光纳米颗粒标记抗靛蓝单克隆抗体、5U乙酰胆碱酯酶（来源于动物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀，置于40℃孵育30min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔1（容器1）中，3min后于紫外光下观察结果。
针对不同待检样品采用不同检测方法的检测结果见表10~11，本实施例的检测方法任选检测方式一~三中的一种。
表10 检测果蔬中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
表11 本法检测尿液中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
实施例7 检测靛酚乙酸酯(A物质)的免疫层析方法
1.金标抗靛酚乙酸酯单克隆抗体的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入40μg抗靛酚乙酸酯单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%（W/V），继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往密理博139硝酸纤维素膜上按照1.0μl/cm的量依次喷涂浓度为2mg/ml的靛酚乙酸酯-载体蛋白偶联物（靛酚乙酸酯检测区，可以是靛酚乙酸酯-牛血清白蛋白、靛酚乙酸酯-卵清蛋白或者靛酚乙酸酯与其他蛋白质分子的共价偶联物）、0.02mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl（pH8.0）、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡奥斯龙8964玻璃纤维 10min；置于37℃干燥，备用。
4.结合垫的制备：将金标记抗靛酚乙酸酯单克隆抗体按照2μl/cm喷涂至8964玻璃纤维上，于37℃干燥，备用。
5.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有靛酚乙酸酯检测区、质控区。
6.检测样品：
检测方式一：1）往反应微孔1（容器1）中加入24U乙酰胆碱酯酶（来源于家蝇、鱼、鸟、马、基因工程重组蛋白）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有35ng靛酚乙酸酯（A物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀，置于40℃孵育4min；3）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔中，10min后观察结果。
检测方式二：1）往反应微孔1（容器1）中加入200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、45ng 靛酚乙酸酯（A物质）、31U乙酰胆碱酯酶（来源于动物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀，置于40℃孵育30min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔1（容器1）中，7min后观察结果。
针对果蔬待检样品采用不同检测方法的检测结果见表12，本实施例的检测方法任选检测方式一~二中的一种。
表12 检测果蔬中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
实施例8 检测甲基对硫磷(A物质)的免疫层析方法
1.金标抗甲基对硫磷单克隆抗体的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入40μg抗甲基对硫磷单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%（W/V），继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、0.5%BSA）重悬颗粒，备用。
2.层析膜的制备：往赛多利斯CN90硝酸纤维素膜上按照1.0μl/cm的量依次喷涂浓度为3mg/ml的甲基对硫磷-载体蛋白偶联物（甲基对硫磷检测区，可以是甲基对硫磷-牛血清白蛋白、甲基对硫磷-卵清蛋白或者甲基对硫磷与其他蛋白质分子的共价偶联物）、0.02mg/ml羊抗鼠IgG（质控区），置于37℃干燥2h，备用。
3.样品垫的制备：用20mM Tris-HCl（pH8.0）、1%BSA、0.5%Tween 20浸泡奥斯龙8964玻璃纤维 10min；置于37℃干燥，备用。
4.结合垫的制备：将金标记抗甲基对硫磷单克隆抗体按照2μl/cm喷涂至8964玻璃纤维上，于37℃干燥，备用。
5.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有甲基对硫磷检测区、质控区。
6.检测样品：
检测方式一：1）往反应微孔1（容器1）中加入12U胆碱酯酶（来源于家蝇、鱼、鸟、马、植物、基因工程重组蛋白）、200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品），吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1（容器1）中的液体转至含有35ng甲基对硫磷（A物质）的反应微孔2（容器2）中，吹打混匀，置于40℃孵育10min；3）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔2中，3min后观察结果。
检测方式二：1）往反应微孔1（容器1）中加入200μl待检样品（乳汁、尿液、洗涤果蔬所得液体、其他液体样品）、10ng 甲基对硫磷（A物质）、15U胆碱酯酶（来源于动物、植物、基因工程重组蛋白皆可），吹打混匀，置于40℃孵育20min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔1（容器1）中，3min后观察结果。
针对不同待检样品采用不同检测方法的检测结果见表13~14，本实施例的检测方法任选检测方式一~二中的一种。
表13 检测果蔬中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
表14 本法检测肉类中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
实施例9 检测靛蓝（B物质）的ELISA检测方法
1.用碳酸盐缓冲液（pH9.6）将BSA-靛蓝偶联物稀释成100ng/ml，按照100μl/孔分装至酶标微孔中，4℃孵育18h；
2.用PBST（吐温-20含量0.05%）洗涤酶标微孔6次；
3.用1% BSA封闭酶标微孔：150μl/孔，37℃ 2h；
4.弃掉BSA，备用。
5.按照200μl/孔将待检样品（或者处理后所得液体）分装至干净的微孔中，并往微孔中加入10U/孔乙酰胆碱酯酶，混匀；
6.置于37℃孵育15min；
7.按照50μl/孔将液体转至包被有BSA-靛蓝偶联物的酶标微孔中；随后按照50μl/孔加入辣根过氧化物酶标记的抗靛蓝单克隆抗体，混匀，置于37℃孵育45min；
8.用PBST（吐温-20含量0.05%）洗涤酶标微孔6次；
9.按照100μl/孔加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物显色；
10.按照50μl/孔加入2M硫酸终止反应，于450nm检测结果，结果见表15。
表15 检测果蔬中部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限
*单位：mg/kg
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种检查有机磷类和氨基甲酸酯类农药的免疫层析方法，包括如下步骤：
（1）金标抗DTNB （5,5-二硝基-双（2-硝基苯甲酸）单克隆抗体的制备：取10ml粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg抗DTNB单克隆抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1%（W/V），继续室温反应15min；离心，用1ml 复溶液重悬颗粒，备用；其中，所述复溶液的配方为0.5%（W/V）BSA和 10mM pH8.0 Tris-HCl；
（2）层析膜的制备：往赛多利斯CN95硝酸纤维素膜上按照0.8μl/cm的量依次在DTNB检测区喷涂浓度为2mg/ml的DTNB-载体蛋白偶联物，在质控区喷涂浓度为0.05mg/ml的羊抗鼠IgG，置于37℃ 干燥2h，备用；
（3）样品垫的制备：用样品垫处理液浸泡无纺布 10min；置于37℃干燥，备用；其中，所述样品垫处理液的配方为1%（W/V）BSA、0.5%（V/V）Tween 20、和20mM pH8.0 Tris-HCl；
（4）试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有DTNB检测区、质控区；
（5）检测样品：1）往反应微孔1中加入20ng 硫代丁酰胆碱、200μl待检样品、5U丁酰胆碱酯酶，吹打混匀；置于40℃孵育10min；2）将反应微孔1中的液体转至含有 80ng DTNB的反应微孔2中，吹打混匀；3）将反应微孔2中的液体转至含有8μ l金标抗DTNB单克隆抗体的反应微孔3中，吹打混匀，置于40℃下3min；4）将试纸条的样品垫一端插入反应微孔3中，3min后观察结果。
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