CN106093383A - 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体elisa诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体elisa诊断试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，由抗原包被酶标板、样品稀释液、酶工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、20倍浓缩洗液、阳性对照、阴性对照组成，本发明所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒具有高特异性、高灵敏性和高稳定性、高均一性，从而具备优异的综合性能，而且使用过程只需将样品稀释液、待检测样品直接加入到酶标板的微孔内，一步完成，无需预稀释待检测样品，省时省力，并容易区分已加样品与未加样品的微孔，最大限度的减少人为差错。同时，本发明提供的试剂盒制备方法，操作简单，并能保证试剂盒的优异性能。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒及其制备 方法
技术领域
本发明涉及ELISA诊断技术领域，特别涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，同时还涉及该ELISA诊断试剂盒的制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害养猪业的主要疾病之一，主要表现为母猪繁殖障碍及不同日龄猪的呼吸道症状。猪蓝耳病病毒在猪群中持续感染，可破坏各个日龄猪的免疫系统功能，使猪群对其他病原体易感，严重影响其他疫苗的免疫效果，极大降低猪群的生产性能，被OIE(世界动物卫生组织)列为必须报告的动物传染病，是最为严重的猪传染病之一，会给猪养殖业带来巨大的损失，同时给食品安全造成危害。我国农业部制订了高致病性猪蓝耳病免疫技术和防控技术规范，并将该传染病列入强制免疫范畴，而免疫抗体检测是检验免疫是否合格的唯一标准，在猪蓝耳病的免疫检测中，目前存在多种类型的免疫检测方法，其中酶联免疫试剂盒(ELISA试剂盒)法是应用较广、操作便捷的检测方法，但目前市售的ELISA试剂盒普遍存在酶标板稳定性差，试剂盒检测精度低等问题，直接影响免疫检测结果。
发明内容
为解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，具有高稳定性酶标板，能够显著提高试剂盒的灵敏度和综合性能。
为实现上述目的，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，包括以下组分：
(1)抗原包被酶标板：抗原包被酶标板上的微孔内，每孔包被有0.18～0.32μg基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原；
(2)样品稀释液：每100ml样品稀释液包括氯化钠3.1～3.9g，牛血清白蛋白0.7～1.3g，酪蛋白钠0.18～0.30g，硫柳汞钠0.02～0.04g，溴甲酚绿0.001～0.002g，其余为去离子水；
(3)酶工作液：每100ml酶工作液包括山羊血清8～16ml，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-200.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45ul，其余为0.01M、pH为7.2-7.5的PBS缓冲溶液；
(4)显色剂A液：每100ml显色剂A液包括醋酸钠2.1～3.2g，柠檬酸0.28～0.36g，30％双氧水0.04～0.08ml，其余为去离子水；
(5)显色剂B液：每100ml显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.03～0.06g，柠檬酸0.16～0.23g，甘油8～14ml，四甲基联苯胺0.03～0.06g，其余为去离子水；
(6)终止液：每100ml终止液包括浓硫酸10～20ml，其余为去离子水；
(7)20倍浓缩洗液：每100ml20倍浓缩洗液包括磷酸氢二钠2.6～3.2g，磷酸二氢钠0.2～0.4g，氯化钠18.5～25.5g，吐温-20 1.8～2.4ml，其余为去离子水；
(8)阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；
(9)阴性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清。
本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，由基因工程PRRSV抗原包被的微孔酶标板和辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG及其他试剂配套组成，应用间接酶联免疫吸附原理检测猪血清或血浆中的PRRSV抗体。在本发明的ELISA诊断试剂盒的组成中，采用独特的样品稀释液配方，实现将样品稀释液直接加入到酶标板的微孔内，对待检测样品稀释的同时进行免疫反应，相较于将待检测样品加入到样品稀释液稀释后再将稀释液加入到酶标板上进行检测的操作，能够一步完成，省时省力；而且本发明的试剂盒在完成依次向酶标板的微孔内加入样品稀释液、待检测样品的操作后，微孔内的液体立即由淡绿色变为蓝色，容易区分已加样品与未加样品的微孔，最大限度的减少人为差错。此外，该样品稀释液能够使待检测样品与包被在酶标板中的抗原更准确的发生特异性免疫反应，最大程度的排除待检测样品中无关成分的干扰，减少猪蓝耳病病毒抗体之外其他抗体的非特异性结合，从而提高试剂盒的特异性及灵敏度。
在试剂盒的组成中，同时对酶工作液、显色剂A、显色剂B形成的显色系统进行结合性配方设计，使抗原抗体的免疫反应能够直观显现，并使显色反应迅速、颜色反差明显，提高稳定性和均一性，从而使本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒具有优异的综合性能。
作为对上述方式的限定，所述抗原包被酶标板的制备中，使用封闭液用于封闭基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，每100ml封闭液包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水。
制备抗原包被酶标板使用的封闭液能够影响酶标板的稳定性及免疫反应的灵敏度，本发明对封闭液配方进一步优化，通过牛血清白蛋白及蔗糖等组分的使用，使包被在酶标板微孔中的抗原结构不会发生显著变化，以保持最佳的抗原性，利于捕获抗体并发生抗原抗体的特异性结合，从而提高试剂盒的灵敏度；而且，封闭液在包被物的表面形成一层具有复合成分的保护膜，使酶标板稳定不容易变质，以在较长时间内可以保持良好的性能。
作为对上述方式的限定，所述样品稀释液、酶工作液、阳性对照和阴性对照均经滤膜过滤除菌得到。
同时本发明还提供了如上所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(一)、抗原包被酶标板的制备：
(1)、配制包被液：用0.05M、pH9.4～9.8的碳酸盐缓冲液将浓度为1.8～3.2mg/ml的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原溶液稀释1000倍，搅拌混匀，得到包被液；
(2)、包板、洗板：将包被液按100μL/孔的量加入到酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出酶标板，用PBST洗液洗板至少3次，再在吸水纸上拍干；
(3)、封闭、拍板：将封闭液按150μL/孔的量加入到经步骤(2)处理后的酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出，吸走液体，再用吸水纸拍干；所述封闭液每100ml包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水；
(4)、干燥、封装：将步骤(3)处理后的酶标板置于温度不高于28℃、相对湿度不高于20％的环境下，干燥18～24小时，最后将干燥好的酶标板装入铝箔袋封装；
(二)、样品稀释液、酶工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、20倍浓缩洗液的配制：按物质配比分别配制各组分溶液，所述样品稀释液、酶工作液均经0.22μm滤膜过滤除菌得到，所述显色剂B液在避光条件下搅拌混匀得到；
(三)、阳性对照、阴性对照的配制：
(1)、阳性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到；
(2)阴性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到。
作为对上述方式的限定，所述酶工作液的配制按如下步骤进行：
依次取山羊血清8～16mL，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-200.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，混合，加入0.01M、pH7.2-7.5的PBS溶液至100mL，充分搅拌混匀，然后加入辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45μL，再充分搅拌混匀，最后经0.22μm滤膜过滤除菌得到酶工作液。
本发明提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，通过进一步限定抗原包被酶标板的制备过程，以获得具有更优特异性和灵敏度，并提高稳定性的酶标板，进而提高试剂盒的综合性能。进一步限定酶工作液配制过程中各组分的加入顺序，得到具有最高活性的酶工作液，优化显色体系，提高试剂盒性能。
综上所述，采用本发明的技术方案，获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，由基因工程PRRSV抗原包被的微孔酶标板和辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG及其他试剂配套组成，本发明通过对样品稀释液、显色体系等组分的配方设计，使该试剂盒具有高特异性、高灵敏性和高稳定性、高均一性，从而具备优异的综合性能，而且使用过程只需将样品稀释液、待检测样品直接加入到酶标板的微孔内，一步完成，无需预稀释待检测样品，省时省力，并容易区分已加样品与未加样品的微孔，最大限度的减少人为差错。同时，本发明提供的试剂盒制备方法，操作简单，并能保证试剂盒的优异性能。
具体实施方式
实施例一
本实施例涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒及其制备。
实施例1
本实施例涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，经由以下方法制得：
(一)、抗原包被酶标板(也称抗原包被板)的制备：
(1)、配制包被液：用0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液将浓度为2.6mg/ml的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原溶液稀释1000倍，搅拌混匀15min，得到包被液；
(2)、包板、洗板：将包被液按100μL/孔的量加入到酶标板的微孔中，放入2～8℃冰箱18～24小时，然后从冰箱中取出酶标板，用PBST洗液(每100mlPBST洗液包括磷酸氢二钠0.145g，磷酸二氢钠0.015g，氯化钠1.175g，吐温-20 0.1ml，其余为去离子水。)洗板3次，再在吸水纸上拍干；
(3)、封闭、拍板：将封闭液(磷酸氢二钠0.52g，磷酸二氢钠0.09g，牛血清白蛋白1.0g，蔗糖2.0g，小牛血清10ml，加去离子水至100ml，搅拌混匀15分钟)按150μL/孔的量加入到经步骤(2)处理后的酶标板的微孔中，放入2～8℃冰箱18～24小时，然后从冰箱中取出酶标板，吸走液体，再在吸水纸上拍干；
(4)、干燥、封装：将步骤(3)处理后的酶标板放在温度不高于28℃、相对湿度不高于20％的环境下，干燥18～24小时，最后将干燥好的酶标板装入铝箔袋并封口；
(二)、样品稀释液、酶工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、20倍浓缩洗液的配制：
样品稀释液的配制：取氯化钠3.5g、牛血清白蛋白1.0g、酪蛋白钠0.25g、硫柳汞钠0.02g、溴甲酚绿0.001g混合，加去离子水至100ml，搅拌混匀15分钟，经0.22μm滤膜过滤除菌后，分装为11ml/瓶；
酶工作液的配制：依次取山羊血清10ml、氨基比林0.5g、硫柳汞钠0.02g、吐温-200.05ml、牛血清白蛋白0.5g混合，加0.01M、pH＝7.4的PBS缓冲溶液(每100mlPBS缓冲溶液包括磷酸氢二钠0.145g，磷酸二氢钠0.015g，氯化钠1.175g，其余为去离子水)至100ml,搅拌混匀15分钟，加入辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG33μl，再搅拌混匀15分钟，经0.22um滤膜过滤除菌后，分装为11ml/瓶；
显色剂A液的配制：取醋酸钠2.7g、柠檬酸0.32g、30％双氧水0.06ml混合，加去离子水至100ml，搅拌混匀15分钟后，分装为6ml/瓶；
显色剂B液的配制：取乙二胺四乙酸二钠0.04g、柠檬酸0.19g、甘油10ml、四甲基联苯胺0.04g混合，加去离子水至100ml，避光搅拌混匀15分钟后，分装为6ml/瓶；
终止液的配制：取去离子水90ml，加入浓硫酸10ml，搅拌混匀15分钟后，分装为6ml/瓶；
20倍浓缩洗液的配制：取磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钠0.3g、氯化钠23.5g、吐温-20 2.0ml混合，加去离子水至100ml，搅拌混匀15分钟后，分装为50ml/瓶；
(三)、阳性对照、阴性对照的配制：
(1)、阳性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装为0.8ml/瓶；
(2)阴性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装为0.8ml/瓶；
将配制好的上述各组分，按如下规格组装：
得到猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，于2-8℃环境下存放，有效期为15个月。
实施例2
本实施例涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，经由以下方法制得：
(一)、抗原包被酶标板(也称抗原包被板)的制备：
(1)、配制包被液：用0.05M，pH9.8的碳酸盐缓冲液将浓度为3.2mg/ml的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原溶液稀释1000倍，搅拌混匀15min，得到包被液；
(2)、包板、洗板：将包被液按100μL/孔的量加入到酶标板的微孔中，放入2～8℃冰箱18～24小时，然后从冰箱中取出酶标板，用PBST洗液(每100mlPBST洗液包括磷酸氢二钠0.145g，磷酸二氢钠0.015g，氯化钠1.175g，吐温-20 0.1ml，其余为去离子水)洗板3次，再在吸水纸上拍干；
(3)、封闭、拍板：将封闭液(磷酸氢二钠0.45g，磷酸二氢钠0.07g，牛血清白蛋白1.8g，蔗糖2.4g，小牛血清18ml，加去离子水至100ml，搅拌混匀15分钟)按150μL/孔的量加入到经步骤(2)处理后的酶标板的微孔中，放入2～8℃冰箱18～24小时，然后从冰箱中取出酶标板，吸走液体，再在吸水纸上拍干；
(4)、干燥、封装：将步骤(3)处理后的酶标板放在温度不高于28℃、相对湿度不高于20％的环境下，干燥18～24小时，最后将干燥好的酶标板装入铝箔袋并封口；
(二)、样品稀释液、酶工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、20倍浓缩洗液的配制：
样品稀释液的配制：取氯化钠3.9g、牛血清白蛋白1.3g、酪蛋白钠0.18g、硫柳汞钠0.04g、溴甲酚绿0.002g混合，加去离子水至100ml，搅拌混匀15分钟，经0.22μm滤膜过滤除菌后，分装为11ml/瓶；
酶工作液的配制：依次取山羊血清16ml、氨基比林0.3g、硫柳汞钠0.01g、吐温-200.03ml、牛血清白蛋白0.3g混合，加0.01M、pH＝7.2的PBS缓冲溶液(每100mlPBS缓冲溶液包括磷酸氢二钠0.142g，磷酸二氢钠0.010g，氯化钠1.175g，其余为去离子水)至100ml,搅拌混匀15分钟，加入辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG45μl，再搅拌混匀15分钟，经0.22um滤膜过滤除菌后，分装为11ml/瓶；
显色剂A液的配制：取醋酸钠2.1g、柠檬酸0.28g、30％双氧水0.08ml混合，加去离子水至100ml，搅拌混匀15分钟后，分装为6ml/瓶；
显色剂B液的配制：取乙二胺四乙酸二钠0.06g、柠檬酸0.23g、甘油14ml、四甲基联苯胺0.06g混合，加去离子水至100ml，避光搅拌混匀15分钟后，分装为6ml/瓶；
终止液的配制：取去离子水85ml，加入浓硫酸15ml，搅拌混匀15分钟后，分装为6ml/瓶；
20倍浓缩洗液的配制：取磷酸氢二钠3.2g、磷酸二氢钠0.4g、氯化钠18.5g、吐温-20 2.4ml混合、加去离子水至100ml，搅拌混匀15分钟后，分装为50ml/瓶；
(三)、阳性对照、阴性对照的配制：
(1)、阳性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤、除菌，分装为0.8ml/瓶；
(2)阴性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤、除菌，分装为0.8ml/瓶；
将配制好的上述各组分，按如下规格组装：
得到猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，于2-8℃环境下存放，有效期为15个月。
实施例二
本实施例涉及本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的性能。
实施例2.1
本实施例涉及实施例一获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的使用性能。
将实施例一获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒用于PRRSV抗体的检测使用。
采用新鲜的猪血清或血浆作为样品进行检测，待检测样品用量为10μl(勿使用染菌、脂血、溶血或黄疸样品；待检测样品室温保存不应超过8小时，若保存8小时以上，须放于2～8℃；如保存超过1周，须放于-20℃)。
检测操作流程如下：
a、将猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒在室温平衡30分钟，将20倍浓缩洗液用去离子水稀释20倍得到洗液，备用；
b、将抗原包被酶标板上的微孔设置为检测孔和对照孔，其中检测孔每孔依次加入样品稀释液100μl、待检测样品10μl，轻轻震荡混匀；设空白对照孔1孔，不加液体；设阳性对照孔2孔，每孔加入阳性对照100μl；设阴性对照孔2孔，每孔加入阴性对照100μl；然后置于37℃水浴箱或恒温培养箱的湿盒，温育30分钟；
c、调节洗板机的加液量，使抗原包被酶标板的每个微孔注满洗液而不溢出，浸泡时间为10秒钟，洗板5次，最后在吸水纸上拍干；
d、在抗原包被酶标板的微孔内，除空白对照孔外，每个微孔再加入酶工作液100μl，然后置于37℃水浴箱或恒温培养箱的湿盒，温育20分钟；
e、同步骤c的操作进行洗板并拍干；
f、抗原包被酶标板的微孔内，每孔加显色剂A液、显色剂B液各50μl，轻轻震荡混匀，置37℃水浴箱或恒温培养箱的湿盒，避光温育10分钟；
g、最后在抗原包被酶标板的微孔内，每孔加终止液50μl，轻轻震荡混匀，用酶标仪在450nm波长下测定OD值，以空白孔调零，得到结果。
结果判定如下：
待检测样品OD值≥临界值(Cut Off)判为阳性，样品OD值＜临界值(Cut Off)判为阴性；其中，Cut Off＝0.13+阴性对照平均OD值，阴性对照平均OD值应＜0.09，且阳性对照平均OD值应≥0.8，否则需重新实验。
选取经确证实验检测过的11份猪血清，其中样品1、2、4、10为阴性，其余均为阳性，使用实施例一获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒按上述检测流程对11份猪血清样品进行检测，得到样品的OD值如下表所示：
由上表可见，检测结果为样品1、2、4、10为阴性，样品3、5、6、7、8、9、11为阳性，检测结果正确；样品11重复做6孔，OD值相差很小；由此说明本发明试剂盒的特异性、灵敏性、均一性都较高。此外，检测操作过程，向抗原包被酶标板的微孔内依次加入样品稀释液、待检测样品后，微孔内的液体立即由淡绿色变为蓝色，容易区分已加样品与未加样品的微孔，可以显著减少人为操作差错。
实施例2.2
本实施例涉及实施例一获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的存贮稳定性能。
将在2-8℃下存放15个月的本发明试剂盒取出进行检测使用，检测与实施例2.1相同的11份猪血清样品，采用与实施例2.1相同的操作流程和结果判定标准，得到的检测结果如下表所示：
由上表可见，检测结果为样品1、2、4、10为阴性，3、5、6、7、8、9、11为阳性，检测结果正确；样品11重复做6孔，OD值几乎没有差异；由此说明在2-8℃下存放15个月的本发明试剂盒，其特异性、灵敏性、均一性未发生明显变化，可见本发明试剂盒的稳定性较高。
对比例
本实施例涉及一种综合使用性能较优的市售猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒——武汉科前公司生产的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒，与本发明试剂盒的性能对比。
武汉科前公司生产的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒组分包括：
该检测试剂盒需在2～8环境下避光存放，有效期为10个月。
采取动物全血，按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血。
洗涤液配制：使用前，20倍浓缩洗涤液应恢复至室温(25℃左右)，并摇动使沉淀的盐溶解(最好在37℃水中加热5～10分钟)，然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释(例如：每板用20ml浓缩液加上380ml水)，稀释好的洗涤液在2～8℃可以存放7天。
待检测样品和对照稀释：
待检测样品稀释：在血清稀释板中按1:40的体积稀释待检测血清样品(195μl样品稀释液中加5μl待检血清样品)；
对照稀释：在血清稀释板中按1:4分别稀释阳性对照和阴性对照(180μl样品稀释液中加60μl对照血清)。
检测操作流程如下：
a、取抗原包被板，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉液体，并在吸水纸上拍干，共计洗板2次；再分别将稀释好的待检测血清样品和对照各取100μl加入到抗原包被板孔中，待检测样品做1孔，阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100μl，轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃温育30分钟；
b、甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，共计洗涤5次；
c、每孔加羊抗猪酶标二抗100μl，置37℃温育30分钟；
d、洗涤5次,方法同b，每次在干净吸水纸上拍干；
e、每孔先加底物液A一滴(50μl)、再加底物液B一滴(50μl)，混匀，室温(18℃～25℃)避光显色10分钟；
f、每孔加终止液一滴(50μl)，10分钟内测定结果(测定前在震荡器上轻轻震动一下)。
结果判定如下：
在酶标仪上测各孔OD630nm值，试验成立的条件是阳性对照孔平均OD630nm值≥0.7，阴性对照孔平均OD630nm值必须＜0.3。
样品OD630nm值＞0.42，判为阳性；样品OD630nm值介于0.38到0.42之间，判为可疑；样品OD630nm值＜0.38，判为阴性。
选取与实施例2.1相同的11份猪血清样品，使用武汉科前公司生产的猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒按上述检测流程对11份猪血清样品进行检测，得到样品的OD值如下表所示：
样品/对照 OD值
1 0.096
2 0.416
3 2.105
4 0.213
5 2.512
6 1.205
7 2.439
8 1.835
9 2.527
10 0.231
11 0.192
11 0.235
11 0.261
11 0.242
11 0.245
11 0.259
阴性对照 0.146
阴性对照 0.154
阳性对照 2.612
阳性对照 2.625
由上表可见，检测结果为样品1、4、10、11为阴性，2为可疑，样品3、5、6、7、8、9为阳性，检测结果中样品2、11出现错误；样品11重复做6孔，OD值差异较大。
对比本发明试剂盒与现有市售试剂盒的使用结果可见，本发明试剂盒的特异性、灵敏性、均一性都较高；而且在相同存放条件下，本发明试剂盒的有效期为15个月，现有试剂盒的有效期仅为10个月，说明本发明试剂盒在稳定性上显著提高。
综上所述，本发明的诊断试剂盒具有抗原抗体反应的高特异性和高灵敏性，检测的高均一性，以及试剂盒的高稳定性，而且相较于市售的诊断试剂盒，在操作过程无需对待检测样品的预稀释，省时省力，并容易区分已加待检测样品与未加待检测样品的微孔，能显著减少人为操作失误，因此本发明的诊断试剂盒具有显著的综合性能优势。

Claims (5)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
(1)抗原包被酶标板：抗原包被酶标板上的微孔内，每孔包被有0.18～0.32μg基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原；
(2)样品稀释液：每100ml样品稀释液包括氯化钠3.1～3.9g，牛血清白蛋白0.7～1.3g，酪蛋白钠0.18～0.30g，硫柳汞钠0.02～0.04g，溴甲酚绿0.001～0.002g，其余为去离子水；
(3)酶工作液：每100ml酶工作液包括山羊血清8～16ml，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-20 0.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45ul，其余为0.01M、pH为7.2-7.5的PBS缓冲溶液；
(4)显色剂A液：每100ml显色剂A液包括醋酸钠2.1～3.2g，柠檬酸0.28～0.36g，30％双氧水0.04～0.08ml，其余为去离子水；
(5)显色剂B液：每100ml显色剂B液包括乙二胺四乙酸二钠0.03～0.06g，柠檬酸0.16～0.23g，甘油8～14ml，四甲基联苯胺0.03～0.06g，其余为去离子水；
(6)终止液：每100ml终止液包括浓硫酸10～20ml，其余为去离子水；
(7)20倍浓缩洗液：每100ml20倍浓缩洗液包括磷酸氢二钠2.6～3.2g，磷酸二氢钠0.2～0.4g，氯化钠18.5～25.5g，吐温-20 1.8～2.4ml，其余为去离子水；
(8)阳性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清；
(9)阴性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体阴性的猪血清。
2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，其特征在于，所述抗原包被酶标板的制备中，使用封闭液用于封闭基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，每100ml封闭液包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水。
3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液、酶工作液、阳性对照和阴性对照均经滤膜过滤除菌得到。
4.一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(一)、抗原包被酶标板的制备：
(1)、配制包被液：用0.05M、pH9.4～9.8的碳酸盐缓冲液将浓度为1.8～3.2mg/ml的基因工程猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原溶液稀释1000倍，搅拌混匀，得到包被液；
(2)、包板、洗板：将包被液按100μL/孔的量加入到酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出酶标板，用PBST洗液洗板至少3次，再在吸水纸上拍干；
(3)、封闭、拍板：将封闭液按150μL/孔的量加入到经步骤(2)处理后的酶标板的微孔中，于2～8℃下放置18～24小时，然后取出，吸走液体，再用吸水纸拍干；所述封闭液每100ml包括以下组分：磷酸氢二钠0.45～0.58g，磷酸二氢钠0.06～0.10g，牛血清白蛋白1.0～2.0g，蔗糖1.8～2.4g，小牛血清10～20ml，其余为去离子水；
(4)、干燥、封装：将步骤(3)处理后的酶标板置于温度不高于28℃、相对湿度不高于20％的环境下，干燥18～24小时，最后将干燥好的酶标板装入铝箔袋封装；
(二)、样品稀释液、酶工作液、显色剂A液、显色剂B液、终止液、20倍浓缩洗液的配制：按物质配比分别配制各组分溶液，所述样品稀释液、酶工作液均经0.22μm滤膜过滤除菌得到，所述显色剂B液在避光条件下搅拌混匀得到；
(三)、阳性对照、阴性对照的配制：
(1)、阳性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到；
(2)阴性对照：取经检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阴性，且猪瘟、猪伪狂犬抗体均阴性的猪血清5头份以上，充分混匀，经0.22μm滤膜过滤除菌得到。
5.根据权利要求4所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，所述酶工作液的配制按如下步骤进行：
依次取山羊血清8～16mL，氨基比林0.3～0.6g，硫柳汞钠0.01～0.02g，吐温-20 0.03～0.06ml，牛血清白蛋白0.2～0.7g，混合，加入0.01M、pH7.2-7.5的PBS溶液至100mL，充分搅拌混匀，然后加入辣根过氧化物酶标记鼠抗猪IgG25～45μL，再充分搅拌混匀，最后经0.22μm滤膜过滤除菌得到酶工作液。
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