CN105717297A - 禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，包括一个盒体，盒内装有包被抗APEC?Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板、O78 APEC胞外蛋白等样品，该试剂盒制备简单，成本低廉，使用方便；本发明还提供了上述试剂盒在检测禽大肠杆菌病中的应用和该试剂盒的检测方法，包括顺次进行的试样处理、孵育抗原、一次洗涤、加样、二次洗涤、加酶标二抗、三次洗涤、加底物液、加终止液、吸光度测定等步骤，该检测方法步骤简单，过程易于控制，检测灵敏、快速、准确。本发明适用于制备禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒并利用该试剂盒对禽感染APEC以及相关疫苗免疫水平进行定性判断和评估。

Description

禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒、检测方法 及应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种试剂盒、检测方法及应用，具体地说是一种禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒、其应用及应用方法。
背景技术
禽大肠杆菌病是由不同血清型禽致病性大肠杆菌（avian pathogenicEscherichia.coli，APEC）引起的局部或全身性感染的不同类型疾病的总称。它包括大肠杆菌性败血症、气囊炎、心包炎、肝周炎、、脐炎、全眼球炎、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、关节炎、肿头综合症、、大肠杆菌肉芽肿、脑炎等。临床发病的病例多见于鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等禽类。通常情况下幼禽对该病易感，多因急性败血症死亡，日龄较大的鸡具有一定的抵抗力，而成年产蛋鸡的大肠杆菌性败血性腹膜炎则可引起较高的的死亡率，且APEC还可以穿透蛋壳引起鸡胚感染，造成死胚、孵化率下降和弱雏率增加，给养禽业造成严重的经济损失。1894年，Lingniers 首次报道鸡大肠杆菌病，随后有关该病的报道越来越多。目前，世界上许多养禽发达国家和地区均有关于该病不同类型的报道，我国自1982年以来相继报道鸡大肠杆菌病的发生，其普遍性和严重性以及对养禽业发展构成的威胁已越来越严重。
目前，禽大肠杆菌病的诊断主要根据流行病学调查、临床症状观察及病理剖检进行初步诊断，如欲确诊，则需对病原菌进行分离、鉴定。血清学诊断一般有平板凝集试验和间接血凝试验，这些方法操作复杂、准确率低。因此建立一种快速、准确、灵敏的检测禽大肠杆菌病的方法刻不容缓。
Tsh是APEC的一种黏附素，为双功能蛋白，具有粘附和蛋白溶解活性，由位于质粒上的Tsh基因编码，存在于多数APEC菌株，与雏鸡的高死亡率有关。感染实验表明，虽然Tsh可导致气囊损伤，但其在APEC感染早期发挥更重要的作用。Tsh是APEC株的一个自转运蛋白，先以140kD前体蛋白形式被合成，经加工后，形成106kD的效应结构域（Tshs）和33kD的β结构域（Tshβ）；Tshβ定位于外膜形成β折叠桶状结构协助Tshs蛋白向膜外转运，Tshs分泌于胞外具有黏蛋白活性和免疫原性，对APEC感染早期的定植具有重要作用，故有人建议将其作为检测鸡感染APEC株的分子指标。因此，利用Tshs蛋白作为目标抗原建立夹心间接ELISA方法，开发抗体检测试剂盒用于禽大肠杆菌病的检测具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供了一种禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，具有制备简单，成本低廉，使用方便的特点；
本发明还提供了上述试剂盒在检测禽大肠杆菌病中的应用和该试剂盒的检测方法，该检测方法步骤简单，过程易于控制，检测灵敏、准确。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，包括一个盒体，盒内装有包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板、O78 APEC胞外蛋白、酶标二抗、阳性对照、阴性对照、洗涤液、抗原稀释液、血清稀释液、二抗稀释液、底物液A、底物液B和终止液。
作为上述试剂盒的限定：
（一）
所述包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板的制备按照如下的步骤顺序进行：
（1）抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体制备
常规方法免疫BALB/c小鼠，待其血清滴度达到要求后，于细胞融合前第3天，加强免疫1次BALB/c小鼠，细胞融合、筛选、克隆化、腹水制备，抗体纯化后得抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体；
（2）包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板制备
用包被液将抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体按体积比为1:5000稀释，按100μl/孔加入ELISA反应板中，4℃冰箱过夜，经洗涤液洗涤后，再用封闭液按照100μl/孔加入ELISA反应板中，37℃封闭1h，洗涤液洗涤后得包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板；
（二）
所述O78 APEC胞外蛋白的制备按照如下的步骤顺序进行：
（1）液体LB培养基培养血清型为O78 的APEC，离心浓缩其培养上清，获得含Tshs蛋白的O78 APEC胞外蛋白液；
（2）利用BCA法测定上述含Tshs蛋白的O78 APEC胞外蛋白液总浓度，于-20℃冰箱冻存、备用；
（三）
①所述洗涤液的配制方法如下，
取2.4g磷酸二氢钾、29.0g磷酸氢二钠、80.0g氯化钠和2.0g氯化钾，用900ml双蒸水溶解后加入5ml Tween-20充分混匀，定容至1L，得10×洗涤液，该液于4℃保存备用，使用时用双蒸水稀释至1×，即先配成10倍的母液，使用时将母液稀释成1倍；
②所述抗原稀释液为1×的PBST；
③所述血清稀释液为封闭液；
④所述二抗稀释液为1×的PBST；
⑤所述底物液A的配制方法如下，
取13.6g醋酸钠、1.6g柠檬酸和0.3ml 质量分数为30%H2O2，向其中加入双蒸水450ml，待充分溶解后，定容至500ml，于4℃保存；
⑥所述底物液B的配制方法如下，
取0.2g乙二胺四乙酸二钠、0.95g柠檬酸、50ml甘油和0.15g TMB，向其中加双蒸水，待充分溶解后，定容至500ml，于4℃保存；
⑦所述终止液的配制方法如下，
取800ml双蒸水，向其中加入111ml浓硫酸溶液，待至室温时，用双蒸水定容至1000ml，混匀，于4℃冰箱保存。
作为本发明试剂盒的进一步限定：
①所述包被液的配制方法如下，
取0.75g碳酸钠和1.46g碳酸氢钠,向其中加双蒸水450ml，待其充分溶解后，用1mol/LNaOH调节溶液pH值至9.6，定容至500ml，于4℃保存；
②所述洗涤液的配制方法如下，
取2.4g磷酸二氢钾、29g磷酸氢二钠、80g氯化钠和2g氯化钾，用900ml双蒸水溶解后加入5ml Tween-20充分混匀，定容至1L，得10×洗涤液，该液于4℃保存备用，使用时用双蒸水稀释至1×，即先配成10倍的母液，使用时将母液稀释成1倍；
③所述封闭液为用1×的PBST配制成质量分数0.5%的BSA；
本发明也提供了上述试剂盒在检测禽大肠杆菌病中的应用。
本发明还提供了利用上述试剂盒检测禽血清中APEC-Tshs抗体的方法，它按照如下的步骤顺序依次进行：
1）试样处理
O78 APEC胞外蛋白用抗原稀释液按1:800稀释，稀释后记为x,阴性对照、阳性对照和新鲜收集的待检禽血清样品用血清稀释液按1:200稀释，稀释后分别记为y、z和m；
2）孵育抗原：向酶标板微孔按照100μl/孔加入x，37℃孵育30min；
3）一次洗涤：倒出完成步骤2）后的微孔中的液体，加入洗涤液250μl/孔，静置1-3min，洗涤三次并拍干；
4）加样
向完成步骤3）后的酶标板微孔中按照100μl/孔分别加入y、z和m，37℃孵育30min；
5）一次洗涤
倒出完成步骤4）后的酶标板微孔中的液体，按照250μl/孔加入洗涤液，静置1-3min，重复洗涤三次并拍干；
6）加酶标二抗
向完成步骤5）后的酶标板每孔加入羊抗鸡酶标二抗100μl，37℃孵育30min；
7）二次洗涤
倒出完成步骤6）后的酶标微板孔中的液体，按照250μl/孔加入洗涤液，静置1-3min，重复洗涤三次并拍干；
8）加底物液
分别取等体积的底物液A和底物液B混匀，按照100μl/孔加入完成步骤7）后的酶标板微孔中，37℃反应10-15min；
9）加终止液
向完成步骤8）后的酶标板微孔中按照50μl/孔加入反应终止液；
10）吸光度测定
用酶标仪在450nm处测定9）中酶标板每孔的吸光光度值。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供的试剂盒，制备简单，成本低廉，使用方便，试剂盒中的抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体采用夹心间接法进行包被，直接利用野生菌进行培养，避免了传统间接ELISA方法中的构建抗原蛋白重组菌株，诱导表达目的蛋白抗原（绝大多数都是已包涵体形式存在）及包涵体变性、复性过柱洗脱纯化等复杂繁琐的操作；本发明包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体能特异性吸附Tshs蛋白，特异性强，安全性好，不含无关杂蛋白，且具有良好的抗原性，该试剂盒特异性敏感性好。
本发明提供的试剂盒的检测方法，步骤简单，过程易于控制，能对禽个体或整个禽群感染APEC进行定性判断和评估，检测灵敏、准确。
本发明适用于制备禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒并利用该试剂盒对禽感染APEC进行定性判断和评估。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为浓缩后的O78 APEC胞外蛋白SDS-PAGE分析示意图；其中，M-ProteinMarker，1-浓缩后的O78 APEC胞外蛋白；
图2为BCA法绘制蛋白标准曲线示意图；
图3为利用制备好的高免血清Western-blot检测O78 APEC胞外蛋白和BL21（DE3）/（pEASY-E1/tsh）重组菌株诱导表达蛋白的分析图；其中M-蛋白预染marker，1-浓缩后的O78APEC胞外蛋白，2-BL21（DE3）/（pEASY-E1/tsh）重组菌株诱后导浓缩的胞外上清；
图4为抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE检测分析图；
图5为利用制备好的抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体Western-blot检测O78 APEC胞外蛋白和BL21（DE3）/（pEASY-E1/tsh）重组菌株诱导表达蛋白的分析图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、组分等，如无特殊说明，均可从商业渠道得到。
实施例1 含Tshs蛋白的O78 APEC胞外蛋白的制备
①在平板中挑取O78 APEC单菌落，接种于20ml 的LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养过夜。上述菌液按照1:50接种于400ml的LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养过夜。取菌液于10000r/min、4℃离心10min，取上清经0.22μm滤器过滤后，利用蛋白浓缩管将培养上清以5500r/min、4℃离心浓缩40倍。浓缩液分装于10支EP管中，1ml/支，于-20℃保存、备用，获得的浓缩液；
②利用BCA法测定上述浓缩液总浓度，于-20℃冰箱冻存、备用，该液体记为A。
实施例2 O78 APEC胞外蛋白SDS-PAGE检测和浓度测定
取3μl实施例1中A加入1μl的4×的蛋白上样缓冲液，沸水浴煮10min后，进行SDS-PAGE电泳分析。电泳结果图谱如图1所示，在紧靠100kDa Marker上方有一条很明显的蛋白条带，且含量很高，分析表明该蛋白疑似Tshs（106kD）蛋白。取1μl浓缩后的培养上清利用BCA蛋白定量试剂盒绘制蛋白标准曲线（如图2所示），样品的OD值为0.504，根据公式y=0.06448x+0.13152,R2=0.99536,计算得知样品的浓度为5.77mg/ml，-20℃冰箱冻存、备用。
实施例3 抗目的蛋白高免鼠源血清的制备
取实施例1中A的O78 APEC胞外蛋白经SDS-PAGE，割取对应100kDa Marker上面的疑似Tshs蛋白部分（106kD），加入适量生理盐水充分研磨后，加入等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，腹腔注射BALB/c小鼠，50μg/只，免疫3次，免疫间隔为2周。第3次免疫后7天，间接ELISA检测血清滴度达1:64000（结果如表1），该高免血清可用于目的蛋白WB检测。
表1 O78 APEC Tshs三次免疫后BALB/c小鼠血清滴度检测
实施例4 WB确定O78 APEC胞外蛋白中含量最高的为Tshs蛋白及分析其免疫原性
BL21（DE3）/（pEASY-E1/tsh）重组菌株于LB液体培养基中培养，待菌液OD600值达到0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至其终浓度为1.0mmol/L，诱导表达6h后，分别收集菌体和培养上清，各取30μl加入10μl蛋白上样缓冲液（4×），沸水浴煮10min后，进行SDS-PAGE电泳分析（结果见图3）。与此同时，以BL21（DE3）/（pEASY-E1/tsh）重组菌株诱导前和诱导后的菌体和培养上清作为对照，BL21（DE3）空菌为空白对照，WB分析确定O78APEC胞外蛋白中含量最高的记为Tshs蛋白，且其具有良好的免疫原性（结果见图4）。
实施例5 包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板的制备
（1）抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体的制备及抗体滴度、纯度和特异性检测
常规方法免疫BALB/c小鼠，待其血清滴度达到要求后，于细胞融合前第3天，加强免疫1次BALB/c小鼠。细胞融合、筛选、克隆化、腹水制备均按常规方法进行，抗体纯化采用Protein A-Agarose Beads亲和层析法，抗体洗脱采用一次洗脱的方式，最终获得5ml抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体，通过间接ELISA法和SDS-PAGE分析纯化后的抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体的滴度可达1:105，结果如表2所示，纯度较高（结果见图5）。Western Blot结果表明其可与Tshs特异性结合，具有良好的特异性。
表2 腹水抗体纯化后滴度测定
（2）ELISA反应板制备
用包被液将（1）中所制的抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体按体积比为1:5000稀释，按100μl/孔加入ELISA反应板中，4℃冰箱过夜，经洗涤液洗涤后，再用封闭液按照100μl/孔加入ELISA反应板中，37℃封闭1h，洗涤液洗涤后得包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板。
上述步骤中所用到的包被液、洗涤液和封闭液的配置方法如下：
①包被液的配制方法：
取0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠,向其中加双蒸水450ml，待其充分溶解后，用1mol/LNaOH调节溶液pH值至9.6，定容至500ml，于4℃保存；
②洗涤液的配制方法：
取2.4g磷酸二氢钾、29g磷酸氢二钠、80g氯化钠和2g氯化钾，用900ml双蒸水溶解后加入5ml Tween-20充分混匀，定容至1L，得10×洗涤液，该液于4℃保存备用，使用时用双蒸水稀释至1×；
③封闭液为用1×的PBST配制成质量分数0.5%的BSA。
实施例6 一种禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒
本实施例中试剂盒包括一个盒体，盒内装有包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板（实施例5制备所得）、O78 APEC胞外蛋白（实施例1制备所得）、酶标二抗、阳性对照、阴性对照、洗涤液、抗原稀释液、血清稀释液、二抗稀释液、底物液A、底物液B和终止液。
其中：
①洗涤液的配制方法如下，
取2.4g磷酸二氢钾、29g磷酸氢二钠、80g氯化钠和2g氯化钾，用900ml双蒸水溶解后加入5ml Tween-20充分混匀，定容至1L，得10×洗涤液，该液于4℃保存备用，使用时用双蒸水稀释至1×；
②抗原稀释液为1×的PBST；
③血清稀释液为用1×的PBST配制成质量分数0.5%的BSA；
④二抗稀释液为1×的PBST；
⑤底物液A的配制方法如下，
取13.6g醋酸钠、1.6g柠檬酸和0.3ml 质量分数为30%H2O2，向其中加入双蒸水450ml，待充分溶解后，定容至500ml，于4℃保存；
⑥底物液B的配制方法如下，
取0.2g乙二胺四乙酸二钠、0.95g柠檬酸、50ml甘油和0.15g TMB，向其中加双蒸水450ml，待充分溶解后，定容至500ml，于4℃保存；
⑦终止液的配制方法如下，
取800ml双蒸水，向其中加入111ml浓硫酸溶液，待至室温时，用双蒸水定容至1000ml，混匀，于4℃冰箱保存；
⑧阳性对照为感染禽致病性大肠杆菌的禽阳性血清；
⑨阴性对照为未感染禽致病性大肠杆菌正常禽阴性血清。
实施例7 禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒在检测禽大肠杆菌病中的原理
实施例6中所提供的试剂盒可以应用于检测禽大肠杆菌病，主要的检测原理是：先制备出抗Tshs的单克隆抗体，然后将该单克隆抗体包被到ELISA板上，经过洗涤、封闭后再加入预先制备的经稀释后的O78 APEC胞外蛋白（其中主要含有Tshs蛋白），由于抗Tshs单克隆抗体可以特异性吸附O78 APEC胞外蛋白中的Tshs蛋白，因此该板经洗涤去掉杂蛋白，得吸附有Tshs蛋白的ELISA板，该板可检测鸡血清中抗Tshs的抗体，然后再加入羊抗鸡酶标二抗，就形成了一种夹心间接ELISA检测方法，最后通过加入显色剂，测定其OD值以分析禽感染APEC株的情况。
使用实施例6中的试剂盒可用来检测禽是否感染大肠杆菌病。
实施例8 禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒检测禽血清中APEC-Tshs抗体的方法
（一）检测步骤
1）试样处理
O78 APEC胞外蛋白用抗原稀释液按1:800稀释，稀释后记为x,阴性对照、阳性对照和新鲜收集的待检禽血清样品用血清稀释液按1:200稀释，稀释后分别记为y、z和m；
2）孵育抗原：向酶标板微孔按照100μl/孔加入x，，37℃孵育30min；
3）一次洗涤：倒出完成上步2）后的微孔中的液体，加入洗涤液250μl/孔，静置1-3min，洗涤三次并拍干；
4）加样
向完成上步3）后的酶标板微孔中按照100μl/孔分别加入y、z和m，37℃孵育30min；
5）一次洗涤
倒出完成上步4）后的酶标板微孔中的液体，按照250μl/孔加入洗涤液，静置1-3min，重复洗涤三次并拍干；
6）加酶标二抗
向完成上步5）后的中酶标板每孔加入羊抗鸡酶标二抗100μl，37℃孵育30min；
7）二次洗涤
倒出完成上步6）后的酶标板微孔中的液体，按照250μl/孔加入洗涤液，静置1-3min，重复洗涤三次并拍干；
8）加底物液
分别取等体积的底物液A和底物液B混匀，按照100μl/孔加入完成上步7）后的酶标板孔中，37℃反应10-15min；
9）加终止液
向完成上步8）2）后的酶标板微孔中按照50μl/孔加入反应终止液；
10）吸光度测定
用酶标仪在450nm处测定完成上步9）后的酶标板每孔的吸光光度值。
（二）检测结果
计算吸光度OD450nm值的平均值（`x ），标准差S（D），阳性的cut-off值为Cp=`x+3SD，阴性的cut-off值Cn=`x+2SD。运用公式S/P=（S-N）/（P-N）来判定结果，若S/P≥Cp，待检血清为阳性；若S/P<Cn，待检血清为阴性；若Cn≤S/P<Cp，则判定为可疑，需重新测定。（上述公式中S代表待检样品的OD450nm值；P代表阳性对照的OD450nm值；N代表阴性对照的OD450nm值）
本发明提供的试剂盒的检测方法，步骤简单，过程易于控制，能对禽个体或整个禽群感染APEC进行定性判断和评估，检测灵敏、准确。
实施例9 APEC-Tshs抗体水平夹心间接ELISA检测方法的建立
P/N值一般在建立ELISA检测方法经常使用，表示阳性OD值与阴性OD值的比值，通常情况下，P/N越大，表明在某一因素作用下检测结果越好、灵敏度越高，一般选取P/N值最大时的处理条件为每一步检测方法的最佳条件。
1）最适抗Tshs蛋白单克隆抗体包被浓度的确定
将实施例5步骤（1）所提供的抗Tshs蛋白单克隆抗体用ELISA包被液分别按照1:5000、1:10000、1:20000、1:30000、1:40000、1:50000、1:60000、1:70000稀释后包被酶标板，每孔重复3次，100μl/孔，4℃冰箱过夜。洗涤、封闭。
再次洗涤后加入实施例1所提供的O78 APEC胞外蛋白，37℃孵育1h，洗涤后，加入阴、阳性鸡血清，再次洗涤，加入HRP-羊抗鸡 IgY二抗孵育，洗涤后加入酶作用底物，按照实施例8中所提供的ELISA程序检测各孔OD450nm值。具体结果见表3。
由表3可以看出，随着Tshs蛋白单克隆抗体包被浓度降低，P/N值先升后降，选取P/N值最大时的包被浓度，即以1:3×104作为抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体包被酶标板的最佳稀释度（为方便稀释，先将抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体母液做1:6预稀释，分装冻存，使用时做1:5000稀释）。
表3 不同包被浓度夹心ELISA检测结果（P/N值）
2）最适封闭液和封闭时间的确定
按照上述最适包被条件，每孔重复3次，用1% BSA、0.5% BSA、5%脱脂奶粉和3%脱脂奶粉，37℃条件下，4种封闭液分别封闭1h、2h和3h，然后按照实施例8中所提供的ELISA程序测定每孔P/N值，重复3次。从表4中可以看出，BSA封闭的P/N值比脱脂奶粉封闭的P/N值大，封闭效果更好，封闭效果好就表明，在后续加样步骤中，不会有其它蛋白吸附到ELISA孔中，检测结果更准确，灵敏度高。0.5% BSA封闭效果与1% BSA差异不明显，且在封闭1h后P/N值达到最大，因此确定以0.5% BSA为封闭液，37℃封闭1h。
表4 最适封闭液和封闭时间的试验结果（P/N值）
3）O78 APEC胞外蛋白抗原和鸡血清最适反应浓度的确定
利用方阵滴定法，将浓缩后的浓度为5.77mg/ml的O78 APEC胞外蛋白抗原用PBST按照1:100-1:3200倍比稀释后加入已包被蛋白单克隆抗体的酶标板，100μl/孔，37℃孵育1h。鸡大肠杆菌病阴、阳性血清用封闭液按照1:100-1:3200倍比稀释组成方阵，按照实施例8所提供的ELISA程序测定每孔P/N值，重复3次。
从表5中可以看出，有多对反应浓度的组合，其P/N值在6.5-8.0之间，相比较均高于表中其它区域的P/N值，以节省抗原为目的，选取P/N值较大时抗原抗体稀释倍数组合。因此，确定抗原最适反应浓度为0.72μg/孔（1:800倍稀释），血清最佳稀释倍数为1:200。
表5 倍比稀释方阵夹心ELISA检测结果（P/N值）
4）鸡血清作用时间的确定
按照上述1）-3）确定的最适条件进行血清作用时间的确定，每孔入最适稀释倍数的鸡大肠杆菌病阴、阳性血清，每孔3个重复，37℃分别孵育30min、45min、60min和90min，然后按照实施例8所提供的ELISA程序测定每孔P/N值，重复3次。
从表6中可以看出，随着鸡血清孵育时间的增加，P/N值变化不明显，因此确定鸡血清最适作用时间为30min。
表6 鸡血清不同孵育时间的试验结果（P/N值）
5）HRP-羊抗鸡IgY最适工作浓度及作用时间的确定
按照上述1）-4）确定的最适条件进行羊抗鸡二抗反应条件的确定，每孔3个重复，HRP-羊抗鸡IgY用PBST稀释成6个浓度：1:5000、1:10000、1:20000、1:30000、1:40000和1:50000，每个浓度分别孵育30min、45min、60min和90min，然后按照实施例8所提供的ELISA程序测定每孔P/N值，重复3次。
从表7中可以看出，在37℃、孵育30min，稀释度为1:104时，P/N值相对较大。因此，确定酶标二抗的最适工作条件为37℃孵育30min，稀释度为1:104。
表7 酶标二抗最适工作浓度和时间的试验结果（P/N值）
6）酶作用底物（TMB）最适反应温度和时间的确定
按照上述步骤1）～5）所确定的最适条件进行底物最适反应条件的确定，每孔重复3次，在常温（25℃）和37℃条件下分别显色5min、10min和15min，然后按照实施例8所提供的ELISA程序测定每孔P/N值，重复3次。
由表8可以看出，37℃反应10min时，测定的P/N值较大，因此确定将酶作用底物（TMB）的作用条件为37℃，避光反应10min。
表8 底物(TMB)最适反应温度和时间的试验结果（P/N值）
7）夹心间接ELISA阴性和阳性临界值的确定
取30份鸡大肠杆菌病阴性血清，每份样品3个重复，进行夹心间接ELISA测定（按照实施例8所提供的检测程序测定），结果如表9。
计算样本OD450nm值的平均值`x=0.1237，标准差SD=0.0357，根据统计学原理，阳性的cut-off值为0.231（Cp=`x+3SD），阴性的cut-off值为0.195（Cn=`x+2SD）。用公式S/P=（S-N）/（P-N）来判定结果，若S/P≥Cp，待检血清为阳性；若S/P<Cn，待检血清为阴性；若Cn≤S/P<Cp，则判定为可疑，需重新测定。（S代表待检样品的OD450nm值；P代表阳性对照的OD450nm值；N代表阴性对照的OD450nm值）
表9 30份阴性鸡血清夹心间接ELISA测定结果
8）重复性试验
批内重复性试验：以同一批制备的O78 APEC胞外蛋白抗原（5.77mg/ml）用包被液稀释至0.072mg/ml包被酶标板（即包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板），分别取4份鸡大肠杆菌病阳性血清和4份鸡大肠杆菌病阴性血清，每份血清进行6个重复，利用建立的夹心间接ELISA方法，测定血清的OD450nm值。
批间重复性试验：分别取3个批次制备的O78 APEC胞外蛋白抗原（5.77mg/ml、3.76mg/ml、3.07mg/ml）分别用包被液稀释至0.072mg/ml，各包被一块酶标板（包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板），分别取4份鸡大肠杆菌病阳性血清和4份鸡大肠杆菌病阴性血清，每份血清进行2个重复，利用建立的夹心间接ELISA方法，测定血清的OD450nm值。结果进行统计学分析，其中阴性血清作为对照，不进行统计学分析，结果见表10。
表10 夹心间接ELISA重复性试验结果
9）夹心间接ELISA方法的特异性实验
利用建立的夹心间接ELISA方法，在相同条件下对NDV、MG和PD三种阳性血清进行检测，每份血清重复3次，并同时设置鸡大肠杆菌病阴、阳性对照，按夹心间接ELISA程序检测（实施例8所提供的检测方法），NDV、MG和PD三种阳性血清OD450nm在0.1-0.2之间，鸡大肠杆菌病阳性血清OD450nm接近1.0，鸡大肠杆菌病阴性血清OD450nm小于0.2，这表明建立的夹心间接ELSIA方法特异性较好，与NDV、MG和PD阳性血清无交叉反应结果，具体结果如表11。
表11 夹心间接ELISA特异性试验结果
10）夹心间接ELISA方法的敏感性实验
利用建立的夹心间接ELISA方法，将一抗血清即鸡大肠杆菌病阴、阳性血清按1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200倍比稀释，按夹心间接ELISA程序测定（实施例8所提供的检测方法），在稀释比例达到1:1600时仍能检测出阳性（P/N值大于2.1），表明建立的夹心间接ELSIA方法敏感性很好，结果如表12：
表12 夹心间接ELISA敏感性试验结果
11）夹心间接ELISA方法的比较试验
用建立的夹心间接ELISA方法分别对84份鸡血清进行检测，并与试验鸡的临床解剖症状进行比较，结果如表13，表明建立的夹心间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性。
表13 夹心间接ELISA与解剖结果比较
实施例1以及实施例5-8，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，包括一个盒体，其特征在于：盒内装有包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板、O78 APEC胞外蛋白、酶标二抗、阳性对照、阴性对照、洗涤液、抗原稀释液、血清稀释液、二抗稀释液、底物液A、底物液B和终止液。
2.根据权利要求1所述的禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板的制备按照如下的步骤顺序进行：
（1）抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体制备
常规方法免疫BALB/c小鼠，待其血清滴度达到要求后，于细胞融合前3天，加强免疫1次BALB/c小鼠，细胞融合、筛选、克隆化、腹水制备，抗体纯化后得抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体；
（2）包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板制备
用包被液将抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体按体积比为1:5000稀释，按100μl/孔加入ELISA反应板中，4℃冰箱过夜，经洗涤液洗涤后，再用封闭液按照100μl/孔加入ELISA反应板中，37℃封闭1h，洗涤液洗涤后得包被抗APEC-Tshs蛋白单克隆抗体ELISA反应板。
3.根据权利要求1所述的禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，其特征在于所述O78 APEC胞外蛋白的制备按照如下的步骤顺序进行：
（1）液体LB培养基培养血清型为O78 的APEC，离心浓缩其培养上清，获得含Tshs蛋白的O78 APEC胞外蛋白液；
（2）利用BCA法测定上述含Tshs蛋白的O78 APEC胞外蛋白液总浓度，于-20℃冰箱冻存、备用。
4.根据权利要求1所述的禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：
①所述洗涤液的配制方法如下，
取2.4g磷酸二氢钾、29.0g磷酸氢二钠、80.0g氯化钠和2.0g氯化钾，用900ml双蒸水溶解后加入5ml Tween-20充分混匀，定容至1L，于4℃保存备用，使用时用双蒸水稀释至1×；
②所述抗原稀释液为1×的PBST；
③所述血清稀释液为用1×的PBST配制成质量分数0.5%的BSA；
④所述二抗稀释液为1×的PBST；
⑤所述底物液A的配制方法如下，
取13.6g醋酸钠、1.6g柠檬酸和0.3ml 质量分数为30%的H2O2，向其中加入双蒸水450ml，待充分溶解后，定容至500ml，于4℃保存；
⑥所述底物液B的配制方法如下，
取0.2g乙二胺四乙酸二钠、0.95g柠檬酸、50ml甘油和0.15g TMB，向其中加双蒸水，待充分溶解后，定容至500ml，于4℃保存；
⑦所述终止液的配制方法如下，
取800ml双蒸水，向其中加入111ml浓硫酸溶液，待至室温时，用双蒸水定容至1000ml，混匀，于4℃冰箱保存；
⑧阳性对照为感染禽致病性大肠杆菌的禽阳性血清；
⑨阴性对照为未感染禽致病性大肠杆菌正常禽阴性血清。
5.根据权利要求2所述的禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：
①所述包被液的配制方法如下，
取0.75g碳酸钠和1.46g碳酸氢钠,向其中加双蒸水450ml，待其充分溶解后，用1mol/LNaOH调节溶液pH值至9.6，定容至500ml，于4℃保存；
②所述洗涤液的配制方法如下，
取2.4g磷酸二氢钾、29.0g磷酸氢二钠、80.0g氯化钠和2.0g氯化钾，用900ml双蒸水溶解后加入5ml Tween-20充分混匀，定容至1L，于4℃保存备用，使用时用双蒸水稀释至1×；
③所述封闭液为用1×的PBST配制成质量分数0.5%的BSA。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒，在检测禽大肠杆菌病中的应用。
7.一种利用权利要求1～5中任意一项所述的禽大肠杆菌病Tshs抗体夹心间接ELISA检测试剂盒检测禽血清中APEC-Tshs抗体的方法，其特征在于它按照如下的步骤顺序依次进行：
1）试样处理
O78 APEC胞外蛋白用抗原稀释液按1:800稀释，稀释后记为x,阴性对照、阳性对照和新鲜收集的待检禽血清样品用血清稀释液按1:200稀释，稀释后分别记为y、z和m；
2）孵育抗原：向酶标板微孔按照100μl/孔加入x， 37℃孵育30min；
3）一次洗涤：倒出微孔中的液体，加入洗涤液250μl/孔，静置1～3min，洗涤三次并拍干；
4）加样
向酶标板微孔中按照100μl/孔分别加入y、z和m，37℃孵育30min；
5）一次洗涤
倒出酶标板微孔中的液体，按照250μl/孔，向酶标板微孔中加入洗涤液，静置1～3min，重复洗涤三次并拍干；
6）加酶标二抗
向酶标板每孔加入1:10000稀释的羊抗鸡酶标二抗100μl，37℃孵育30min；
7）二次洗涤
倒出酶标板微孔中的液体，按照250μl/孔，向酶标板孔中加入洗涤液，静置1～3min，重复洗涤三次并拍干；
8）加底物液
分别取等体积的底物液A和底物液B混匀，按照100μl/孔加入酶标板微孔中，37℃反应10-15min；
9）加终止液
按照50μl/孔，向酶标板微孔中加入反应终止液；
10）吸光度测定
用酶标仪在450nm处测定酶标板每孔的吸光光度值。
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