CN102721812A

CN102721812A - 检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接elisa试剂盒

Info

Publication number: CN102721812A
Application number: CN2012102049102A
Authority: CN
Inventors: 陆吉虎; 高峰; 唐应华; 杨维维; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-06-20
Filing date: 2012-06-20
Publication date: 2012-10-10
Anticipated expiration: 2032-06-20
Also published as: CN102721812B

Abstract

本发明提供检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接ELISA试剂盒，属于生物技术领域。所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括：已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体、并结合了嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株灭活纯化抗原的酶标板。所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括：已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体的酶标板。本发明为检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体提供了特异、敏感、快速、操作简便的试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒、监测免疫抗体。

Description

检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接ELISA试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及抗体工程技术，具体涉及检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体的间接ELISA试剂盒。

背景技术

鸡传染性支气管炎（Avian Infectious Bronchitis, IB）是由冠状病毒属的传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus, IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，以引起鸡呼吸道感染、肾炎、产蛋下降为主要特征，可引起幼鸡死亡率高达40%，成年鸡感染后产蛋量下降10%-50%，给世界养鸡业带来重大的经济损失。

鸡传染性支气管炎病毒具有多种血清型和多组织嗜性，自1931年最早报道呼吸型IB以来，随后报道了肾型、肠型、生殖道型、腺胃型等传染性支气管炎，至今已经报道的血清型达30余种，近年来新的血清型和变异株仍不断出现，给流行病学的研究和防疫带来了极大地困难，也给养鸡业造成了严重的经济损失。我国的免疫鸡群和非免疫鸡群均易发生嗜肾型IBV的感染，其中已经报道的有嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株、HF2株等。嗜肾型鸡传染性支气管炎的控制关键之一在于建立快速诊断的方法。分离病毒是诊断本病最经典可靠的方法，但是用时较长，而且常因同时感染的其他病毒影响而漏检；琼脂扩散试验(AGP)操作简单，但是灵敏度低，沉淀抗体持续时间较短，不适合疫苗免疫效果的评价；病毒中和试验(VNT)可以用于检测IB的抗原和抗体，敏感、特异，并可用于病毒的分型，但是实验操作复杂，费时而且昂贵；微量血凝抑制（HI）实验操作简单、快速，易于推广，具有早期诊断的价值，但是鸡传染性支气管炎病毒无自然血凝活性，必须经过特殊处理才可以凝集红细胞，这也限制了HI在IBV抗体检测中的应用；RT-PCR检测方法具有敏感、快速、特异等特点，但是对实验室条件要求高，操作复杂，难以推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒含有高特异性的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体，能够准确、安全、快速、灵敏地检测鸡传染性支气管炎病毒抗体。

本发明的另一目的是提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，该试剂盒含有高特异性的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体，能够准确、安全、快速、灵敏地检测鸡传染性支气管炎病毒。

本发明提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括：已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体、并结合了嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株灭活纯化抗原的酶标板。

采用如下方法制备所述酶标板：

（a）向酶标板的每孔中分别加入100μL浓度为0.59～9.44 μg/mL的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体溶液，4℃包被过夜；

（b）洗涤；

（c）用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤；

（d）向酶标板的每孔中分别加入100 μL浓度为104.2～208.4μg/mL的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株灭活纯化抗原溶液，37℃孵育1.5 h，洗涤。

步骤（a）中所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体溶液的浓度为2.36 μg/mL。

步骤（d）中所述加入到酶标板每孔中的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株灭活纯化抗原溶液的浓度为138.90 μg/mL。

该试剂盒还包括：

（1）10×洗涤液：pH7.4，体积100 mL；所述10×洗涤液是含有质量浓度分别为5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液；

（2）10×血清稀释液：pH7.4，体积100 mL；所述10×血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液；

（3）酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25 mL；

（4）底物显色液，包括：

A液：将1 mL浓度为10 mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液加入到100 mL 浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成；所述浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液的配制方法为：0.1 mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7 mL和0.1 mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3 mL混合即成；

B液：体积浓度为3%的H₂O₂水溶液，10 mL；

（5）终止液：2 mol/L的H₂SO₄溶液100 mL；

（6）标准阳性血清：即标准IBV抗体阳性血清，0.5 mL；

（7）标准阴性血清：即标准IBV抗体阴性血清，0.5 mL。

本发明还提供一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，该试剂盒包括：已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体的酶标板。

所述酶标板的制备方法如下：

（a）在酶标板的每孔中分别加入100 μL浓度为0.59～9.44μg/mL的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体溶液，4℃包被过夜；

（b）洗涤；

（c）用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤。

所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体溶液浓度为2.36 μg/mL。

该试剂盒还包括：

（1）10×洗涤液：pH7.4，体积100 mL；所述10×洗涤液是含有质量浓度分别为5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液，；

（2）10×血清稀释液：pH7.4，体积100 mL；所述10×血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液，；

（3）酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25 mL；

（4）底物显色液，包括：

B液：体积浓度为3%的H₂O₂水溶液10 mL；

（5）终止液：2 mol/L的H₂SO₄溶液，100 mL；

（6）标准阳性血清：即标准IBV抗体阳性血清，0.5 mL；

（7）标准抗原：嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原，1 mL；

（8）阴性标准品对照：13日龄SPF鸡胚尿囊液，1 mL。

本发明为检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒及其抗体提供了安全、特异、敏感、快速、操作简便、经济的试剂盒，能够在实际生产中快速诊断鸡群是否感染嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒、监测免疫抗体。抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体是由高效的杂交瘤细胞2G4分泌的，效价高达1:102000，该单克隆抗体能够特异性地结合嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒。本试剂盒的成本低，可以大量生产，易于工业化应用。

附图说明

图1是纯化腹水的SDS-PAGE分析图，其中泳道1为蛋白质标准分子量标准（DM101，北京全式金生物技术有限公司）；泳道2为未纯化的2G4腹水；泳道3为用亲和层析柱纯化的2G4腹水。

图2表示抗原抗体作用时间对检测结果的影响，其中“单抗-抗原”是指抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体与灭活纯化抗原之间的相互作用；“抗原-血清”是指灭活纯化抗原与标准血清之间的相互作用；“血清-酶标二抗”是指标准血清与酶标二抗之间的相互作用。

具体实施方式

实施例中使用的试剂：

（1）PBS缓冲液: 氯化钠（NaCl）8.0 g，氯化钾（KCl ）0.2 g，磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）2.9 g，磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.2 g，加去离子水溶解后定容至1,000 mL，用1 M 氢氧化钠（NaOH）调pH值为7.4，121℃灭菌15 min，4℃保存。

（2）PBST缓冲液：含质量浓度为0.5% Tween-20的PBS缓冲液。

（3）碳酸盐缓冲液：含有0.05 mol/L Na₂CO₃和0.05 mol/L NaHCO₃的水溶液，pH值为9.6。

（4）1% BSA-PBST：含质量浓度为1%牛血清白蛋白（BSA，购自Sigma公司）的PBST缓冲液。

（5）0.5% BSA-PBST：含质量浓度为0.5% 牛血清白蛋白（BSA，购自Sigma公司）的PBST缓冲液。

（6）TEN 缓冲液：pH7.4，浓度为50 mmol/L的Tris-HCL缓冲液中含有50 mmol/L NaCl、5 mmol/L Na₂EDTA 。

实施例一抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株（简称嗜肾型IBV DS10株）单克隆抗体制备、纯化及性质

1、嗜肾型IBV DS10株

本发明中使用的嗜肾型IBV DS10株的保藏信息如下：

生物材料（毒株）：Ck/Jiangsu/DS10/2008

分类命名：鸡传染性支气管炎病毒；

拉丁文学名：Infectious Bronchitis Virus（IBV）；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2010年6月25日；

保藏编号：CGMCC No. 3957。

注：本文中为了方便表述，将保藏编号为CGMCC No. 3957的毒株缩写为嗜肾型IBV DS10株。

2.嗜肾型IBV DS10株的繁殖、纯化

取嗜肾型IBV DS10毒种，接种于11日龄SPF鸡胚（购自北京梅里亚维通实验动物科技有限公司种蛋，本实验室孵化）尿囊腔内，接种量为0.1 mL /胚，置37℃培养。弃去24小时内死亡的胚。培养35小时后，收获死胚及未死胚，置4℃冷冻至全部胚死亡后，收集死胚尿囊液。

收获的尿囊液在4700×g、4℃条件下离心20 min，取上清液；再以14000×g、4℃条件离心15 min，留取上清液；再将上步中获得的上清液在54000×g、4℃条件下离心1.5 h，弃上清，在沉淀中加入适量TEN 缓冲液，并用无菌滴管吹打沉淀使其分散、溶解成悬浊液，即为嗜肾型IBV DS10株的纯化抗原（浓度为20.84 mg/mL），添加β-丙内酯（终浓度0.5‰）4℃灭活24 h后作为嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原（简称灭活纯化抗原），-70℃保存备用。

3.小鼠免疫

用嗜肾型IBV DS10株的灭活纯化抗原免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠（购自扬州大学实验动物中心），共免疫4次。首次免疫，用灭活纯化抗原加等体积弗氏完全佐剂（购自Sigma公司）的乳化液，免疫剂量为200 μL/只；第二、三次免疫，均用灭活纯化抗原加等体积的弗氏不完全佐剂（购自Sigma公司）的乳化液，免疫剂量为100 μL/只（第一、二、三次免疫之间间隔14天）；第三次免疫后7天，尾静脉采血分离血清，用微量血凝抑制（HI）实验（钱晓佳等. 鸡传染性支气管炎病毒(M41)HI抗原的制备与初步应用[J]. 安徽农业科学，2007，35(30)：9545-9546，954.）检测血清抗体水平，选取血清抗体效价最高的小鼠采用灭活纯化抗原从尾静脉注射加强免疫（即第4次免疫），免疫剂量为50 μL/只。获得嗜肾型IBV DS10灭活纯化抗原对BALB/c小鼠三免后的血清HI效价达到1:256，该血清分装后-20℃保存，作为阳性参考血清备用。

4、按照常规方法制备饲养细胞

5、细胞融合

细胞融合按照常规方法（刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用（第一版）[M]. 合肥：安徽科技技术出版社，1994: 18-30.）进行。取本实施例标题3中进行第4次免疫三天后的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞（ATCC，北京中原合聚经贸有限公司）按5:1的比例混匀于50 mL刻度离心管，用20-30 mL的DMEM基础培养基（购自Sigma公司）洗涤2次，然后在1000 rpm、10 min条件下离心，弃上清，用手掌轻击管底，使沉淀细胞松散均匀；将此融合管移入37℃水浴中预热并轻轻旋转，在60 s内将1 mL预热至37℃的50% PEG-4000（购自南京生兴生物科技公司）沿管壁滴加到融合管中的沉淀细胞上；在5 min内将25 mL预热至37℃的DMEM基础培养基沿管壁滴加到融合管中；然后将融合管在37℃静置10 min，在1000 rpm下离心5 min，弃上清，加入50 mL含HAT（Sigma公司，H0262）的DMEM培养基重悬细胞；按每孔0.1mL加入已经培养有饲养细胞（见实施例二步骤2）的96孔培养板中，置37℃、5%的CO₂培养箱中培养。5天后观察细胞生长状况，并用新鲜的含HAT的DMEM培养基换出培养板孔中1/2培养基；10天后，用含HT（Sigma公司，H0137）的DMEM培养基换出原含HAT的培养基；观察融合细胞生长情况，待其分布至孔底面积1/5以上时，吸出细胞培养上清液进行抗体检测。

6、杂交瘤细胞的筛选

通过检测各融合细胞培养上清液中的抗体来筛选杂交瘤细胞。当检测孔为阳性时，说明该孔的杂交瘤细胞分泌抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体。

采用如下方法检测融合细胞培养上清液中的抗体（间接ELISA检测）：取灭活纯化抗原用碳酸盐缓冲液以体积比1:200稀释，在96孔细胞板中每孔加入100 μL稀释后的灭活纯化抗原，4℃包被过夜；弃去液体，用PBST缓冲液洗涤三次，5 min/次，最后用吸水纸拍干；用1% BSA-PBST，100 μL /孔，37℃封闭1 h；再用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；将细胞培养上清液（本实施例标题5获得）、用0.5% BSA-PBST按照1:100倍稀释的阴性参考血清（将一只约8周龄未免疫的BALB/c小鼠摘眼球采血分离的血清）和阳性参考血清加入相应孔内（第一排第一列的孔加入PBS缓冲液作为空白对照），100 μL/孔，37℃作用1.5 h后，弃去液体用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入用0.5% BSA-PBST按1:3500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京金杉生物科技有限公司），100 μL/孔，37℃作用1 h后，弃去液体，用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入底物显色液（Biosharp公司，TMB-S-002，），100 μL/孔，37℃避光显色10 min后加入终止液（2 mol/L 的H₂SO₄）终止反应；酶标仪测定OD₄₅₀值。以空白对照调零，P为各孔的OD₄₅₀值，N为加入阴性参考血清的孔的OD₄₅₀值。当N≤0.1，加入阳性参考血清的孔的OD₄₅₀值与加入阴性参考血清的孔的OD₄₅₀值的比值（P/N）≥2.1，即阴、阳性对照成立的情况下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，1.5≤P/N＜2.1的检测孔判为可疑，P/N＜1.5的检测孔判为阴性。

7、杂交瘤细胞的亚克隆

将本实施例标题6中筛选所获得的分泌特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，及时采用有限稀释法（刘秀梵，单克隆抗体在农业上的应用（第一版） [M]. 合肥：安徽科学技术出版社，1994：35-36）进行亚克隆。挑选阳性孔，采用有限稀释法连续进行2-3次的亚克隆，直到亚克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性，且各孔检测的OD值比较接近，将多次亚克隆后的阳性孔细胞株扩大培养后冻存。获得能稳定分泌抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G4。

杂交瘤细胞株2G4保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，其保藏号为CGMCC No.6172，保藏日期为：2012年5月28日,分类命名为分泌抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体的杂交瘤细胞。

8. 抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体的制备

取7~8周龄健康BALB/c母鼠（购自扬州大学实验动物中心），腹腔注射液体石蜡（0.5 ml/只）一周后，将杂交瘤细胞株2G4以PBS缓冲液稀释后注入小鼠腹腔，每只小鼠注射0.2 mL ，约含1～2×10⁶个杂交瘤细胞。7-10天后当小鼠腹部明显膨大时采集腹水。将采集的腹水在4000 rpm条件下离心5分钟，弃去油脂与沉淀后，所得上清液即为初步纯化的腹水。将初步纯化的腹水小量分装，于-70℃保存备用。

利用HiTrap Protein G亲和层析柱（Pharmacia公司产品，货号：17-0404-01）纯化抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体。初步纯化的腹水中加入3倍体积的结合缓冲液（Protein G IgG binding buffer，pH5.0，Thermo Scientific公司产品，货号：21019）稀释，然后取该混合液用1 mL/min的上样流速注入到层析柱中；吸取10 mL 结合缓冲液以2 mL/min的流速加入层析柱中，洗脱杂蛋白；用5 mL洗脱缓冲液（IgG elution buffer，pH2.8，Thermo Scientific公司产品，货号：21004）以1 mL/min的上样流速洗柱，用离心管收集抗嗜肾型IBV DS10单克隆抗体的洗脱峰（离心管内预先加入pH9.0、浓度为1 M的Tris-Hcl缓冲液）。将抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的洗脱峰做SDS-PAGE电泳（见图1）。结果显示，未纯化的腹水杂蛋白较多，经亲和层析除杂后仅有重链和轻链两条蛋白带。所述抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的洗脱峰即为抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液，其蛋白含量为944 μg/mL，置-20℃保存备用。

9.抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体腹水效价的测定及亚类鉴定

将初步纯化的腹水用PBS缓冲液以2倍倍比稀释，将各浓度的腹水加入到封闭好的包被有灭活纯化抗原（用碳酸盐缓冲液以1:200稀释）的96孔酶标板孔中（第一排第一列的孔加入PBS缓冲液作为空白对照），100 μL/孔，37℃，孵育90 min；用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入1:3500稀释HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京金杉生物科技有限公司），100 μL/孔，37℃作用1 h，PBST洗涤3次，5 min/次，最后一次拍干；加入底物显色液（Biosharp公司，TMB-S-002），100 μL/孔，37℃避光显色10 min后加入终止液（2 mol/L H₂SO₄）终止反应；经酶标仪测定OD450nm值。以空白对照调零，P为各检测孔的值，N为加入阴性参考血清的孔的OD₄₅₀值。当N≤0.1，加入阳性参考血清的孔的OD₄₅₀值与N的比值（P/N）≥2.1，即阴、阳性对照成立的情况下，P/N≥2.1的检测孔判为阳性，以阳性孔的最大稀释度作为单克隆抗体的腹水效价。结果显示杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体腹水间接ELISA效价为1:102000。

采用鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒（Sigma公司，ISO2-1KT）对抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体进行亚类鉴定，实验步骤按照试剂盒操作说明进行，结果表明：杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体属于IgG1亚类。

10.抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体与嗜肾型IBV DS10株的反应原性与特异性鉴定

用Western-blotting（J.萨姆布鲁克，D.W.拉赛尔. 分子克隆实验指南[M]. 第三版. 北京:科学出版社，1998，884-895.）鉴定杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的反应原性与特异性。嗜肾型IBV DS10株尿囊液、阴性尿囊液（无菌采集自4℃致死的12日龄SPF鸡胚）经5％浓缩胶和10％分离胶中进行SDS-PAGE电泳分离后，以2 mA/cm²，90 min，转移至PVDF膜上，用10% BSA（购自Sigma公司）溶液4℃封闭2 h；用PBST缓冲液洗膜3次，5 min/次；以抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体为一抗，以1:2500稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG（购自北京金杉生物科技有限公司）为二抗；用增强型DAB显色试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）显色。结果显示，该单克隆抗体可以与嗜肾型IBV DS10株特异性结合，在14 KDa左右处有单一一条反应条带，而不与阴性尿囊液反应，证明该抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体是嗜肾型IBV DS10株的特异性抗体。

用碳酸盐缓冲液将含禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）H9亚型、鸡传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）、鸡减蛋综合征病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDSV）、鸡新城疫病毒（New Castle Disease Virus，NDV）、嗜肾型IBV DS10株的SPF鸡胚尿囊液、阴性尿囊液1:200稀释后按本施例标题6的方法包被96孔酶标板，以杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体为一抗，同时设PBS缓冲液阴性对照进行间接ELISA实验（参见本实施例标题6方法），结果显示杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体仅与嗜肾型IBV DS10株尿囊液毒成强阳性反应，与阴性对照和其它鸡病毒尿囊液均为阴性反应，表明杂交瘤细胞株2G4分泌的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体具有很好的特异性。

其中禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）H9亚型，购自南京天邦生物科技有限公司。鸡传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）、鸡减蛋综合征病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDSV）和鸡新城疫病毒（New Castle Disease Virus，NDV）购自中国兽医药品监察所。

实施例二标准IBV抗体阳性血清、阴性血清的制备

本发明制备了标准IBV抗体阳性血清、阴性血清，用于检测条件的优化和检测结果的判定。

（1）标准IBV抗体阳性血清：配制嗜肾型IBV DS10株灭活油乳剂疫苗（农业部兽药评审中心组等. 兽用生物制品质量标准汇编（2010）[M]. 北京：中国农业出版社，2011：69-73），免疫SPF鸡（购自北京梅里亚维通实验动物科技有限公司种蛋，本实验室孵化饲养），制备标准IBV抗体阳性血清。具体方法为：SPF鸡在隔离环境中饲养至14日龄，用嗜肾型IBV DS10株灭活油乳剂疫苗颈部皮下注射0.3 mL/只免疫；21天后用同样的方法进行二次免疫；14天后，采集鸡翅静脉血，分离血清，并用微量血凝抑制（HI）试验（钱晓佳等. 鸡传染性支气管炎病毒(M41)HI抗原的制备与初步应用[J]. 安徽农业科学，2007，35(30)：9545-9546，954.）检测其血凝抑制效价，次日选取血清抗体效价≥8log2的SPF鸡从心脏采血分离血清作为标准IBV抗体阳性血清，以0.5mL/瓶的量分装于无菌玻璃瓶中，密封， -20℃保存。

（2）标准IBV抗体阴性血清：取1周龄SPF鸡，心脏采血，分离血清作为标准IBV抗体阴性血清，以0.5 mL/瓶的量分装于无菌玻璃瓶中，密封， -20℃保存。

实施例三检测嗜肾型IBV抗体（或抗原）的间接ELISA方法的建立及其标准化

为了建立检测嗜肾型IBV抗体（或抗原）的间接ELISA试剂盒，对嗜肾型IBV抗体（或抗原）的间接ELISA检测方法进行了如下的条件优化：

（1）方阵实验确定抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体的最适包被浓度及血清最佳稀释度

采用方阵滴定法（丘德新等. 间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体[J]. 中国兽医学报，2002，22（3）：149-151）确定抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体，标准阳性、阴性血清的最佳工作浓度。取96孔酶标板，将抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液（实施例一标题8制备）用碳酸盐缓冲液从1:100 倍比稀释至1:12800后，自左向右每个稀释度加一列，100 μL/孔；同时设置两个空白对照孔，每孔加100 μL碳酸盐缓冲液，4℃包被过夜。取出拍干后，以PBST缓冲液洗涤3次（5 min/次），拍干液体。用1% BSA-PBST，100 μL /孔，37℃封闭1 h，洗涤同前。再加入用0.5% BSA-PBST按1:200稀释的嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原（实施例一标题2制备），100 μL/孔，37℃孵育1.5 h，洗涤同前。将标准IBV抗体阳性血清（缩写为标准阳性血清）和标准IBV抗体阴性血清（缩写为标准阴性血清）分别用0.5% BSA-PBST从1:100倍比稀释至1:12800后，每个稀释度加一行，100 μL/孔，37℃孵育1 h，洗涤同前。每孔中加入100 μL 1:35000稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG（Jackson公司产品，货号93038），37℃孵育1 h，再用PBST缓冲液洗涤3次，5 min/次。继而每孔中加入100 μL底物显色液（Biosharp公司产品：TMB-S-002），37℃避光显色10 min，最后加入50 μL浓度为2 M的H₂SO4终止反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀吸光值。以标准阳性血清OD₄₅₀值接近1.0，标准阳性血清OD₄₅₀/标准阴性血清OD₄₅₀（P/N）的比值最大，且阴性血清OD₄₅₀值在0.1左右所在孔的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体浓度和血清稀释液作为最佳单抗工作浓度和血清稀释度。从表1中的结果可知，用于包被的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液的浓度可以为0.59～9.44 μg/mL，标准阳性、阴性血清的稀释度为1:100～400。用于包被的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液的浓度优选为 2.36 μg/mL（实施例一标题8制备的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液1:400稀释），标准阳性、阴性血清的稀释度优选为1:200。

表1 单抗和血清的最佳稀释度选择结果（OD₄₅₀值）

注：P为标准IBV阳性血清2个平行孔的OD₄₅₀平均值

N为标准IBV阴性血清2个平行孔的OD₄₅₀平均值

（2）封闭液种类的筛选

采用最佳抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体包被稀释度，最佳血清稀释度，分别用1% BSA-PBST、10%小牛血清（FBS）-PBST（含质量浓度为10%小牛血清的PBST缓冲液）和2%明胶-PBST（含2%明胶的PBST缓冲液）三种不同的封闭液封闭，每个封闭做四次重复，其他反应条件同步骤（1）。结果表明，1% BSA-PBST、10%小牛血清（FBS）-PBST和2%明胶-PBST三种类型封闭液的P/N值分别为13.529、12.615和11.118，故选用1% BSA-PBST为封闭液效果最好。

（3）封闭时间确定

采用最佳抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体包被稀释度，最佳血清稀释度，封闭液为1% BSA-PBST，100 μL/孔，其他条件同步骤（1），研究不同封闭时间（30 min、60 min和90 min）对检测结果的影响。在酶标仪上读取OD₄₅₀的值。实验重复3次，结果显示30 min、60 min和90 min的P/N值分别为9.524、12.820和13.306，故选用60 min作为最适宜的封闭时间。

（4）抗原抗体最佳作用时间

采用最佳抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体包被稀释度，最佳血清稀释度，封闭液为1% BSA-PBST，封闭时间60 min，灭活纯化抗原、标准IBV抗体阳性血清和标准IBV抗体阴性血清分别用0.5%BSA-PBST 按1:200稀释作为工作浓度，其他条件同步骤（1），考察不同反应时间（60 min、90 min和120 min）对抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体与灭活纯化抗原间的作用、灭活纯化抗原与标准血清间的作用、标准血清与酶标二抗（HRP标记的羊抗鸡IgG）间的作用的影响。所述的标准血清是指标准IBV抗体阳性血清和标准IBV抗体阴性血清。在酶标仪上读取OD₄₅₀的值。重复4次，取阳性、阴性OD₄₅₀的平均值，计算P/N值（图2）。结果表明抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体与灭活纯化抗原、灭活纯化抗原与标准血清、标准血清与酶标二抗的最佳作用时间分别90 min、60 min、60 min。

（5）抗原最佳稀释倍数

采用最佳抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体包被稀释度，最佳血清稀释度，封闭液为1% BSA-PBST，封闭时间60 min，抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体与灭活纯化抗原、灭活纯化抗原与标准血清、标准血清与酶标二抗的最佳作用时间分别90 min、60 min、60 min，其他条件同步骤（1），考察灭活纯化抗原的不同稀释倍数对检测结果的影响。用0.5% BSA-PBST 按1:100、1:150、1:200、1：250及1:300稀释灭活纯化抗原（浓度分别为208.40 μg/mL、138.90 μg/mL、104.20 μg/mL、83.36 μg/mL、69.46 μg/mL），进行ELISA检测，重复4次计算平均值（见表2），结果表明以1:150作为抗原的最佳稀释倍数，即抗原浓度为138.90 μg/mL。

表2 抗原工作浓度对检测结果的影响（OD₄₅₀值）

抗原浓度（μg/mL）	阳性（P）平均值	阴性（N）平均值	阳性/阴性（P/N）
				208.40	1.158	0.084	13.786
138.90	1.208	0.085	14.212
				104.20	1.160	0.085	13.647
83.36	1.162	0.090	12.911
				69.46	1.157	0.085	13.612

（6）酶标羊抗鸡IgG最适稀释度

采用最佳抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体包被稀释度，最佳血清稀释度，封闭液为1% BSA-PBST，封闭时间60 min，抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体与灭活纯化抗原、灭活纯化抗原与标准血清、标准血清与酶标二抗的作用时间分别为90 min、60 min、60 min，灭活纯化抗原浓度为138.90 μg/mL，其他条件同步骤（1），考察HRP标记的羊抗鸡IgG最适稀释度。将HRP标记的羊抗鸡IgG用PBST按照1:30000、1:35000、1:40000和1:45000分别稀释后，对标准阴性、阳性血清进行ELISA检测，每个稀释度加4孔，比较其OD₄₅₀值的差异。结果显示HRP标记的羊抗鸡IgG最佳稀释度为1:35000（表3）。

表3 酶标IgG稀释倍数对检测结果的影响（OD₄₅₀值）

IgG稀释倍数	阳性（P）平均值	阴性（N）平均值	阳性/阴性（P/N）
				1:30000	1.237	0.106	11.670
1:35000	1.115	0.082	13.598
				1:40000	1.060	0.097	10.928
1:45000	1.008	0.072	14.000

（7）显色时间确定

按照上述已经确定的反应条件进行ELISA检测，加入底物显色液（Biosharp公司产品：TMB-S-002），在37℃分别避光显色10 min、15 min及20 min，终止反应后在酶标仪上读取OD₄₅₀的值，结果表明不同时间显色的P/N值分别为11.043、10.588和8.633，故以37℃作用10 min为最佳显色时间。

（8）ELISA操作程序

按以上各项所确定的优化条件进行操作，即得到本发明的最佳操作程序如下：

采用最佳抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体包被稀释度（1:400，蛋白浓度为2.36 μg/mL），最佳血清稀释度1:200，封闭液为1% BSA-PBST，封闭时间60 min，抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体与灭活纯化抗原、灭活纯化抗原与标准血清、标准血清与酶标二抗的最佳作用时间分别90 min、60 min、60 min，灭活纯化抗原浓度为138.90 μg/mL，HRP标记的羊抗鸡IgG最佳稀释度为1:35000，最佳显色时间10 min，其他反应条件同步骤（1）。

实施例四检测嗜肾型IBV抗体的间接ELISA试剂盒的组装、使用方法、结果判断及该试剂盒的特异性、稳定性、敏感性

（一）根据实施例三中检测条件的优化，建立了检测嗜肾型IBV抗体的间接ELISA试剂盒，其组成如下：

（1）酶标板：该酶标板已包被有抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体、并结合了嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原。

制备方法如下：

（a）将抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液（实施例一标题8制备）用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为0.59～9.44 μg/mL的溶液，然后加入酶标板的各孔中，加入的量为100 μL/每孔，4℃包被过夜；加入到酶标板各孔中的抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液的浓度优选2.36 μg/mL；

（b）洗涤：取出拍干后，以PBST缓冲液洗涤3次（5 min/次），拍干液体；

（c）用1% BSA-PBST，100 μL /孔，37℃封闭1 h，洗涤同步骤（b）；

（d）将嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原（实施例一制备）用0.5% BSA-PBST稀释成浓度为104.2～208.4μg/mL的溶液，加入酶标板的每孔中，加入的量为100 μL/每孔，37℃孵育1.5 h，洗涤同步骤（b）。加入到酶标板各孔中的嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原溶液的浓度优选为138.90 μg/mL；

（2）10×洗涤液：pH7.4，体积100 mL；所述10×洗涤液是含有质量浓度分别为5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液；

（3）10×血清稀释液：pH7.4，体积100 mL；所述10×血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液；

（4）酶标试剂：HRP标记的兔抗鸡IgG（Jackson公司产品，货号93038）用PBS缓冲液以1：35000稀释，25 mL；

（5）底物显色液，包括

A液：将1 mL浓度为10 mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（缩写为TMB，郑州四季化工公司）溶液加入到100 mL 浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成；所述浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液的配制方法为：0.1 mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7 mL和0.1 mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3 mL混合即成。

B液：体积浓度为3%的H₂O₂水溶液，10 mL；

A液和B液均需4℃密封、避光保存。使用时每10 mL A液加50 μL B液混匀即用。

（6）终止液：2 mol/L的H₂SO₄溶液100 mL；

（7）标准阳性血清：实施例二步骤（1）制备的标准IBV抗体阳性血清，0.5 mL；

（8）标准阴性血清：标准IBV抗体阴性血清0.5 mL，制备方法见实施例二步骤（2）。

每个试剂盒包含2块用锡箔真空包装的96孔酶标板，每块酶标板包含可拆卸的ELISA微孔板条。

（二）使用本发明试剂盒检测嗜肾型IBV抗体的操作步骤：

（1）准备：从冰箱取出试剂盒，室温放置30分钟。用蒸馏水将10×洗涤液、10×血清稀释液分别稀释成1×洗涤液、血清稀释液。

（2）加样：取出酶标板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样品孔和空白对照孔，记录各孔位置。待检血清及标准阳性血清、标准阴性血清分别用血清稀释液做1：200稀释后，分别加入待测样品孔、标准品孔，100 μL/孔。空白对照孔不加。

（3）温育：置37℃恒温箱作用60 min。

（4）洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加洗涤液400 μL，静置5 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次。

（5）加酶标试剂：每孔加入酶标试剂100 μL，空白对照孔不加。

（6）温育：37℃恒温箱作用60 min。

（7）洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加洗涤液400 μL，静置5 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次。

（8）显色：每孔中加入100 μL底物显色液，平板混匀器混匀30 s，37℃避光显色10 min。

（9）终止：每孔中加入50 μL终止液终止反应。

（10）测定：以空白孔调零，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光值（OD）。

（11）结果判定。

（三）本发明检测嗜肾型IBV抗体的结果判定标准

利用本发明建立的ELISA检测方法对120份经微量血凝抑制（HI）试验（钱晓佳等. 鸡传染性支气管炎病毒(M41)HI抗原的制备与初步应用[J]. 安徽农业科学，2007，35(30)：9545-9546，954.）测定为嗜肾型IBV抗体阴性的血清样品进行检测，以标准IBV抗体阳性血清为参照计算P/N值，对这些血清学数据进行统计学分析，得到OD₄₅₀平均值

（0.123）和标准差S（0.041），根据统计学原理，OD₄₅₀≥

+3S=0.246时，判为阳性； OD₄₅₀≤

+2S=0.205时判为阴性，介于两者之间者判为可疑。根据分析结果得出本发明建立的ELISA检测试剂盒检测的判定标准为：

（1）阳性标准品孔（加标准阳性血清）的OD₄₅₀≥0.246，且P/N≥2.1，实验结果才有效。否则应进行重复实验；

（2）如果待检样品OD₄₅₀≤0.205，判定该样品为嗜肾型IBV抗体阴性；

（3）如果待检样品OD₄₅₀≥0.246，且P/N≥2.1，判定该样品为嗜肾型IBV抗体阳性；

（4）如果待检样品0.246>OD₄₅₀<0.205，判定该样品为可疑。

（四）检测嗜肾型IBV抗体的间接ELISA试剂盒的特异性、稳定性、敏感性及临床样品检测

（1）特异性

用本发明检测嗜肾型IBV抗体的间接ELISA试剂盒分别对禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）、鸡传染性法氏囊病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）、鸡减蛋综合征病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDSV）、鸡新城疫病毒（New Castle Disease Virus，NDV）的单因子阳性血清（购自中国兽医药品监察所）、嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒（IBV）HF2株阳性血清（购自南京天邦生物科技有限公司灭活抗原，以实施例二步骤（1）方法制备）和标准IBV 抗体阳性血清进行检测，同时设立阴性对照，比较其 OD₄₅₀值，当阳性标准品孔（加标准阳性血清）的OD₄₅₀≥0.246，且P/N≥2.1时，实验结果可靠；在此前提下，如果血清样品OD₄₅₀≤0.205，判定为（－）；如果血清样品OD₄₅₀≥0.246，判定为（＋）；结果显示特异性良好（表4）。

表4 ELISA检测抗体的特异性实验结果

血清

IBV（DS10）

IBV（HF2）

AIV（H9）

IBDV

EDSV

NDV

阴性

P/N

8.271

8.143

1.182

1.224

1.043

1.261

1.000

判定结果

＋

－

（2）稳定性

用本发明研制的同一批次的酶标板同时检测7份嗜肾型IBV抗体阳性血清样品和1份嗜肾型IBV抗体阴性血清样品，每份样品重复6孔，根据测得的OD₄₅₀值计算每份血清样品批次内的变异系数（CV）。选用本发明研制的六个不同批次的酶标板，对8份鸡血清样品进行ELISA检测，根据测得的OD₄₅₀值计算每份血清样品批次间的变异系数（CV）。实验结果表明批次内重复性实验检测样品的变异系数（CV）都低于6.000%（分别为5.435%、5.007%、2.155%、5.972%、4.296%、5.088%、3.825%、5.263%），而批次间重复性实验检测样品的变异系数（CV）最大为6.930%（分别为6.104%、5.452%、2.748%、4.948%、2.628%、6.930%、3.607%、6.140%），即采用本发明嗜肾型IBV抗体的间接ELISA试剂盒来检测具有较好的稳定性。

（3）敏感性

将标准IBV阳性血清由1:100到1:6400进行倍比稀释，按本发明已经确定的方法进行ELISA检测。结果表明该ELISA抗体检测方法最低能检出的血清稀释倍数为1:2400，即最低能检出的血清抗体浓度为11.45 μg/mL。

（4）临床样品检测

用本发明建立的检测嗜肾型IBV抗体的间接ELISA试剂盒和微量血凝抑制（钱晓佳等. 鸡传染性支气管炎病毒(M41)HI抗原的制备与初步应用[J]. 安徽农业科学，2007，35(30)：9545-9546，954.）试验分别对南京某实验鸡场的85份血清样品进行检测并对比分析实验结果。结果表明ELISA法与血凝抑制试验的阳性检出率分别为96.471%（82/85）和91.765%（78/85），其中仅6例样品两种方法检测不一致，即两种方法的检测符合率为92.941%。

通过特异性、稳定性、敏感性试验，可以看出本发明试剂盒的特异性很强，结果稳定，能够检测较低浓度的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体。

实施例五检测嗜肾型IBV的间接ELISA试剂盒的组装、使用方法、结果判断及该试剂盒的特异性、稳定性、敏感性

（一）根据实施例三中检测条件的优化，建立了检测嗜肾型IBV的间接ELISA试剂盒，其组成如下：

（1）酶标板：该酶标板已包被有抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体。

制备方法如下：

（a）将抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液（实施例一标题8制备）用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为0.59～9.44μg/mL的溶液，加入到酶标板的各孔中，每孔的加入量为100 μL，4℃包被过夜；所述加入到酶标板各孔中抗嗜肾型IBV DS10株单克隆抗体溶液的浓度优选为2.36 μg/mL。

（b）洗涤：取出拍干后，以PBST缓冲液洗涤3次（5 min/次），拍干液体。

（c）用1% BSA-PBST，100 μL /孔，37℃封闭1 h，洗涤同步骤（b）。

（2）10×洗涤液：pH7.4，体积100 mL；所述10×洗涤液是含有质量浓度分别为5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液，；

（3）10×血清稀释液：pH7.4，体积100 mL；所述10×血清稀释液是含有质量浓度分别为5%牛血清白蛋白、5% Tween-20、8%氯化钠、0.2%氯化钾、2.9%磷酸氢二钠和0.2%磷酸二氢钾的水溶液，；

（4）酶标试剂：HRP标记的兔抗鸡IgG（Jackson公司产品，货号93038）1：35000稀释，25 mL；HRP是指辣根过氧化物酶。

（5）底物显色液，包括：

B液：体积浓度为3%的H₂O₂水溶液10 mL；

（6）终止液：2 mol/L的H₂SO₄溶液100 mL；

（7）标准阳性血清：即实施例二步骤（1）制备的标准IBV抗体阳性血清，0.5 mL；

（8）标准抗原：嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原1 mL，实施例一制备。

（9）阴性标准品对照：13日龄SPF鸡胚尿囊液1 mL。

（二）使用本发明试剂盒检测嗜肾型IBV的操作步骤：

（1）准备：从冰箱取出试剂盒，室温放置30分钟。用蒸馏水将10×洗涤液、10×血清稀释液稀释成1×洗涤液、血清稀释液。

（2）加样：取出酶标板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样品孔和空白对照孔，记录各孔位置。标准抗原、阴性标准品对照用血清稀释液做1：150稀释，待检样品、标准抗原和阴性标准品对照稀释液分别加入待测样品孔、标准品孔，100 μL/孔。空白对照孔不加。

（3）温育：置37℃恒温箱作用1.5 h。

（5）加标准阳性血清：标准阳性血清用血清稀释液做1：200稀释后，每孔加入100 μL/孔。空白对照孔不加。

（6）温育：置37℃恒温箱作用60 min。

（7）加酶标试剂：每孔加入酶标试剂100 μL，空白对照孔不加。

（8）温育：37℃恒温箱作用60 min。

（9）洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加洗涤液400 μL，静置5 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次。

（10）显色：每孔中加入100 μL底物显色液，平板混匀器混匀30 s，37℃避光显色10 min。

（11）终止：每孔中加入50 μL终止液终止反应。

（12）测定：以空白孔调零，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光值（OD）。

（13）结果判定。

（三）本发明检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的结果判定标准

利用本发明建立的ELISA检测方法对30份经RT-PCR方法（刘金朋等. 鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立[J]. 中国农学通报，2011,27（03）：342-346.）测定为IBV 阴性的南京某鸡场鸡喉气管棉拭子样品进行检测，以嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原为参照计算P/N值，对这些数据经统计学分析，得到OD₄₅₀平均值

（0.153）和标准差S（0.035），根据统计学原理，OD₄₅₀≥

+3S=0.258时，判为阳性； OD₄₅₀≤

+2S=0.223时判为阴性，介于两者之间者判为可疑。根据分析结果得出本发明建立的ELISA检测试剂盒检测的判定标准为：

（1）阳性标准样品（加标准抗原）的OD₄₅₀≥0.258，且P/N≥2.1，实验结果才有效。否则应进行重复实验；

（2）如果待检样品OD₄₅₀≤0.223，判定该样品为嗜肾型IBV抗体阴性；

（3）如果待检样品OD₄₅₀≥0.258，且P/N≥2.1，判定该样品为嗜肾型IBV抗体阳性；

（4）如果待检样品0.258>OD₄₅₀<0.223，判定该样品为可疑。

（四）检测嗜肾型IBV的间接ELISA试剂盒的特异性、稳定性、敏感性及临床样品检测

（1）特异性

用本发明建立的检测嗜肾型IBV的ELISA检测试剂盒分别对鸡易感病病毒、IBDV、EDSV、NDV（以上购自中国兽医药品监察所）、AIV（H9）亚型、嗜肾型IBV HF2株（购自南京天邦生物科技有限公司灭活抗原）和嗜肾型IBV DS10株的病毒液进行检测，同时设立阴性对照，比较其 OD₄₅₀值，以阳性标准品OD₄₅₀≥0.258，且P/N≥2.1时实验结果成立；在此前提下，OD₄₅₀≥0.258，判为阳性（＋）；OD₄₅₀≤0.223判为阴性（－）。结果显示特异性好（表5）。

表5 ELISA检测抗原的特异性实验结果

血清

IBV（DS10）

IBV（HF2）

AIV（H9）

IBDV

EDSV

NDV

阴性

P/N

9.471

9.234

1.154

1.121

1.017

1.364

1.000

判定结果

＋

－

（2）稳定性

用本发明研制的同一批次的酶标板同时检测9份鸡组织样品，每份样品重复6孔，根据测得的OD₄₅₀值计算每份样品批次内的变异系数（CV）。选用本发明研制的六个不同批次的酶标板，对9份鸡组织样品进行ELISA检测，根据测得的OD₄₅₀值计算每份样品批次间的变异系数（CV）。实验结果表明批次内重复性实验检测样品的变异系数（CV）都低于5%（分别为2.43%、1.84%、1.53%、3.60%、2.32%、1.81%、4.36%、1.42%、3.94%），批次间重复性实验检测样品的变异系数（CV）最大为5.74%（5.69%、2.82%、5.08%、2.69%、4.77%、5.18%、5.04%、1.41%、5.74%），即采用本发明试剂盒检测具有较好的稳定性。

（3）敏感性

将灭活纯化抗原（20.84 mg/mL）由1:100到1:12800进行倍比稀释，按本发明已经确定的方法进行ELISA检测，结果表明当稀释倍数达到1:3200时，OD₄₅₀仍大于0.246，且P/N＞2.1，即该ELISA抗原检测方法最低能检出的抗原浓度为6.513 μg/mL。

（4）临床样品检测

用本发明检测嗜肾型IBV的ELISA方法和RT-PCR方法（刘金朋等. 鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR快速检测方法的建立[J]. 中国农学通报，2011，27（03）：342-346.）分别对南京某实验鸡场的74份鸡喉气管棉拭子样品进行检测，结果表明ELISA法与RT-PCR的阳性检出率分别为60.811%（45/74）和59.459%（44/74），其中仅3例样品两种方法检测不一致，即两种方法的检测符合率为95.946%。

通过特异性、稳定性、敏感性试验，可以看出本发明试剂盒的特异性很强，结果稳定，能够检测较低浓度的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒。

Claims

1.一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体、并结合了嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株灭活纯化抗原的酶标板。

2.根据权利要求1所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：采用如下方法制备所述酶标板：

（b）洗涤；

（c）用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤；

3.根据权利要求2所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：步骤（a）中所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体溶液的浓度为2.36 μg/mL。

4.根据权利要求2所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：步骤（d）中所述加入到酶标板每孔中的嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株灭活纯化抗原溶液的浓度为138.90 μg/mL。

5.根据权利要求4所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括：

（3）酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25 mL；

（4）底物显色液，包括：

B液：体积浓度为3%的H₂O₂水溶液，10 mL；

（5）终止液：2 mol/L的H₂SO₄溶液100 mL；

（6）标准阳性血清：即标准IBV抗体阳性血清，0.5 mL；

（7）标准阴性血清：即标准IBV抗体阴性血清，0.5 mL。

6. 一种检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：已包被有抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒 DS10株单克隆抗体的酶标板。

7. 根据权利要求6所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标板的制备方法如下：

（b）洗涤；

（c）用牛血清白蛋白溶液封闭，洗涤。

8.根据权利要求7所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述加入到酶标板每孔中的抗嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒DS10株单克隆抗体溶液浓度为2.36 μg/mL。

9.根据权利要求8所述检测嗜肾型鸡传染性支气管炎病毒的间接ELISA试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括：

（3）酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，25 mL；

（4）底物显色液，包括：

B液：体积浓度为3%的H₂O₂水溶液10 mL；

（5）终止液：2 mol/L的H₂SO₄溶液，100 mL；

（6）标准阳性血清：即标准IBV抗体阳性血清，0.5 mL；

（7）标准抗原：嗜肾型IBV DS10株灭活纯化抗原，1 mL；

（8）阴性标准品对照：13日龄SPF鸡胚尿囊液，1 mL。