CN102539776A - 一种肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法 - Google Patents

一种肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别是用于血清中肠道病毒71型(Enterovirus 71，简称EV71)特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法。通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)的方法，将制备的EV71病毒抗原固定到酶标板上，通过抗原抗体的特异性吸附来实现抗体的检测。由于包被的抗原包含EV71病毒的特异性抗原表位，因而能用来检测出血清中EV71病毒的特异性抗体，从而减少血清检测的假阳性。本发明适合对大批量动物或人体血清标本进行检测，适用于大规模的血清学和流行病学调查。

Description

一种肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是用于肠道病毒71型(Enterovirus71，简称EV71)特异性抗体的定性或定量检测，通过酶联免疫吸附测定肠道病毒71型抗体的检测方法。
背景技术
肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹。引起手足口疾病的主要致病原是肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16。大量的流行病学研究表明，肠道病毒71型病毒的感染多发生于5岁以下的婴幼儿，其感染可能引起多种与神经系统相关的严重疾病，包括致死脑炎、无菌性脑膜炎和急性麻痹等。因而，对EV71病毒的特异性诊断具有非常重大的临床意义。
EV71病毒属于小核糖核酸(RNA)病毒科肠道病毒属的成员，其病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nm。病毒粒子的衣壳由60个亚单位构成，后者由4种衣壳蛋白(VP1-VP4)拼装成五聚体样，抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。病毒衣壳与病毒毒力有关，而由297个氨基酸组成的VP1结构蛋白，其大部分结构暴露于病毒表面，含有EV71病毒的重要抗原表位，可以诱发机体产生特异性的EV71中和抗体。因此，可以利用这些特异性的抗原表位来捕获机体中的特异性抗体，从而实现特异性抗体的检测。
目前，针对EV71病毒的特异性检测方法包括病毒分离、核酸分子生物学检测和血清学检测。病毒分离常用的细胞系有Vero、RD、Hep-2细胞。目前发现Vero细胞分离病毒的阳性率最高。用于病毒分离的样本有咽拭子、肛拭或粪便、脑脊液、血清及囊泡液。有研究显示病毒分离阳性率最高的样本是咽拭子，可达90％-95％；其次是肛拭样本，约为40％-50％；囊泡液也有较高的阳性率，而脑脊液的病毒分离率很低。病毒分离的缺点是繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。
核酸分子生物学检测方法具有较高的敏感度和特异性，包括RT-PCR(反转录聚合酶链反应)和荧光定量RT-PCR检测方法。与其他肠道病毒一样，PCR检测主要针对EV71的VP1区保守的核苷酸序列设计引物和探针。采用半巢式RT-PCR直接从样本中检测EV71，检出率可达53％。荧光定量RT-PCR方法特异度达100％，可检测5个拷贝病毒量，可用于直接检测样本。与普通RT-PCR相比，由于其污染可能性小，手上操作时间少，为EV71的快速检测提供了有效手段。但是该方法操作较为复杂，对操作人员的要求较高，且标本中的杂质可能引起聚合酶的失活等问题，在实际的应用过程中存在一些问题，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。
血清学检测包括中和试验和ELISA检测方法。其中最常用方法目前仍是中和实验，但该方法的灵敏度和特异性较差。而且该方法在检测过程中需要进行细胞培养，从而导致试验周期变长，往往需要1个月左右的时间才能得到结果，在实际的应用过程中存在一定的局限性。与血清中和试验相比，运用ELISA方法对EV71进行特异性的检测，具有较好的灵敏度和特异性其方法简便、快速，具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是利用EV71特异性的抗原作为固定包被抗原，建立一种特异性检测肠道病毒71型抗体的方法，利用间接酶联免疫吸附法(ELISA)，提供一种特异性好、灵敏度高、使用方便、检测快速的肠道病毒71型抗体的检测方法，可以用于血清中肠道病毒71型抗体检测及效价测定，能适用于大规模的血清学和流行病学调查。
本发明肠道病毒71型(Enterovirus 71，简称EV71)特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)的方法，将制备的EV71病毒抗原固定到酶标板上，通过抗原抗体的特异性吸附来实现抗体的检测。由于包被的抗原包含EV71病毒的特异性抗原表位，因而能用来检测出血清中EV71病毒的特异性抗体，从而减少血清检测的假阳性。本发明适合对大批量动物或人体血清标本进行检测，适用于大规模的血清学和流行病学调查。
本发明肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，将纯化的肠道病毒71型(EV71)病毒颗粒，合成的病毒样颗粒(VLP)抗原，合成的含病毒特异性抗原表位的多肽固定到酶标板上，通过间接酶联免疫吸附的方法进行测定，其中合成的含病毒特异性抗原表位的多肽主要含有EV71病毒的162-177氨基酸位点、208-222氨基酸位点以及240-260氨基酸位点。
本发明采用间接酶联免疫吸附法，通过固定EV71抗原-待测血清-酶标抗体这样一个模型(见图1)来实现。即将EV71抗原固定在酶标板孔上，随后加入待测血清，用相应的酶标抗体指示显色。
本发明提供一种肠道病毒71型抗体的检测方法的技术方案，具体步骤如下：
A.酶标板的预制
A.1EV71抗原的固定：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将EV71病毒特异性抗原稀释至1～5微克/毫升，按50～100微升/孔的量，加入酶标板的孔中，放于4℃孵育过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗液洗板3～5次；
A.2酶标板的封闭：用封闭液按200微升/孔的量加入步骤A.1的酶标板孔中，37℃孵育1～2小时，PBS洗液洗板3～5次；
A.3加保护剂：用5％蔗糖按100～200微升/孔的量，加入步骤A.2酶标板的孔中，37℃孵育0.5～1小时，拍干，4度储存待用；
B.用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS将血清作不同的稀释度，按50～100微升/孔的量，加入步骤A.3酶标板的孔中，同时设立阴性孔，阳性孔和空白孔，37℃孵育1～2小时，PBS洗液洗板3～5次；
C.按50～100微升/孔的量，在步骤B的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入37℃孵育0.5～1小时，PBS洗液洗板3～5次；
D.按50～100微升/孔的量，在步骤C的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺(OPD)显色液，放入湿盒中，于37℃保温10～20分钟；
E.按50～100微升/孔的量，在步骤D的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度OD值，即得到检测结果。
上述A.1步骤所述的EV71病毒特异性抗原为本公司自制。
上述A.1步骤所述EV71病毒特异性抗原将纯化的肠道病毒71型病毒颗粒，合成的病毒样颗粒抗原，合成的含病毒特异性抗原表位的多肽作为固定抗原。
上述A.3步骤所述的添加5％蔗糖作为稳定保护剂。
上述C步骤所述的酶标抗体为市购。
所述洗板为用磷酸盐缓冲液洗液在洗板机上洗板或者手工洗板。
所述磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液洗液、碳酸盐缓冲液、邻苯二胺显色液、终止液、封闭液均为现有技术的常规用液。
该方法用于血清中肠道病毒71型特异性抗体的定性或定量检测，减少血清检测的假阳性。
附图说明
图1为本发明实验模型。
图2为小鼠血清中肠道病毒71型抗体测定结果。
图3为人体肠道病毒71型阴、阳性血清标本中特异性抗体测定结果比较。
图4为不同年龄段正常人群血清的EV71抗体阳性率结果。
本发明具有以下优点和效果：根据上述方案，采用EV71病毒特异性抗原作为固定相，来检测血清样本中的EV71特异性抗体水平，从而判断机体针对EV71的免疫状况，该方法有助于提高抗体检测的特异性和灵敏度，减少假阳性的产生。本发明操作简单，试验周期短，全程实验不超过2小时，适用于大批量样本筛查，便于进行大规模的血清学和流行病学调查。
具体实施方案
实施例1
固定纯化EV71病毒抗原检测小鼠血清中的EV71抗体效价
1)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的EV71病毒抗原稀释至2微克/毫升，按100微升/孔的量加入酶标板孔中，置于4℃孵育过夜，PBS洗液洗板3次；
2)用封闭液按200微升/孔的量加入酶标板孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板3次；
3)用5％蔗糖按100微升/孔的量，加入酶标板孔中，37℃孵育0.5～1小时，拍干，4度储存待用；
4)用0.9％生理盐水将待测血清稀释10倍，再用含有1％BSA的PBS将血清作一系列的稀释度：1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560，按100微升/孔的量，加入预制备的酶标板的孔中，37℃孵1小时，PBS洗液洗板4次，同时设立阴性对照孔2个，和空白孔1个；
5)按100微升/孔的量，在步骤4)所述的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入37℃孵育0.5小时，PBS洗液洗板3～5次；
6)按100微升/孔的量，在步骤5)所述的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺显色液，放入湿盒中，于37℃保温15分钟；
7)按50微升/孔的量，在步骤6)所述的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得到检测结果(结果见表1和图2)。
8)判定结果：
阴性对照空的平均值为：0.06
故域值(Cutoff)值＝0.06×2.1＝0.126
按照样品的A值≥域值(Cutoff)值，该样品判定为阳性样品；样品的A值＜Cutoff值，该样品判为阴性。则本样品1∶20～1∶1280稀释度均为阳性，1∶2560为阴性，因此，该血清中EV71抗体的效价为1∶1280。
所用溶液如下：
1、包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，PH9.6)：碳酸钠1.59克，碳酸氢钠2.93克，加蒸馏水至1000毫升。
2、磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)：磷酸二氢钾0.2克，磷酸氢二钠2.9克，氯化钠8.0克，氯化钾0.2克，Tween-200.5毫升，加蒸馏水至1000毫升。
3、PBS洗液：1000毫升磷酸盐缓冲液中，加入0.5毫升吐温20。
4、封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。
5、OPD显色液：称取20mg邻苯二胺，溶于50毫升0.1摩尔浓度/升pH 5.0的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液，再加入20微升双氧水，混匀后避光保存。
6、终止液(2N硫酸)：取浓硫酸10毫升，缓慢加入80毫升水中，冷却待用。
表1、小鼠血清中肠道病毒71型抗体测定结果(A492值)
  稀释倍数   阳性   阴性   阴性   空白
  20x   1.686   0.061   0.059   0.003
  40x   1.617
  80x   1.279
  160x   0.858
  320x   0.517
  640x   0.286
  1280x   0.174
  2560x   0.102
实施例2
固定纯化EV71病毒抗原检测小鼠血清中的EV71抗体阳性率
1)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的EV71病毒抗原稀释至3微克/毫升，按100微升/孔的量加入酶标板孔中，置于4℃孵育过夜，PBS洗液洗板3次；
2)用封闭液按200微升/孔的量加入酶标板孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板3次；
3)用5％蔗糖按100微升/孔的量，加入酶标板孔中，37℃孵育0.5～1小时，拍干，4度储存待用
4)将75份小鼠阳性血清分别稀释100倍，按100微升/孔的量，加入预制备的酶标板的孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板4次，同时设立阴性对照孔2个，和空白孔1个；
5)按100微升/孔的量，在步骤4)所述的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入37℃孵育0.5小时，PBS洗液洗板3～5次；
6)按100微升/孔的量，在步骤5)所述的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺显色液，放入湿盒中，于37℃保温15分钟；
7)按50微升/孔的量，在步骤6)所述的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得到检测结果(结果见表2)。
8)判定结果：
阴性对照空的平均值为：0.027，小于0.05，应按0.05计算，
故Cutoff值＝0.05×2.1＝0.105
按照样品的A值≥Cutoff值，该样品判定为阳性样品；样品的A值＜Cutoff值，该样品判为阴性。
表2、小鼠血清检测结果
  阳性结果   阴性结果   阳性率
  血样例数   70   5   93.3％
实施例3
固定病毒特异性抗原表位多肽检测小鼠血清中的EV71抗体阳性率
1)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的EV71病毒抗原稀释至3微克/毫升，按100微升/孔的量加入酶标板孔中，置于4℃孵育过夜，PBS洗液洗板3次；
2)用封闭液按200微升/孔的量加入酶标板孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板3次；
3)用5％蔗糖按100微升/孔的量，加入酶标板孔中，37℃孵育0.5～1小时，拍干，4度储存待用
4)将75份接种EV71病毒的小鼠血清分别稀释50倍，按100微升/孔的量，加入预制备的酶标板的孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板4次，同时设立阴性对照孔2个，和空白孔1个；
5)按100微升/孔的量，在步骤4)所述的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入37℃孵育0.5小时，PBS洗液洗板3～5次；
6)按100微升/孔的量，在步骤5)所述的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺显色液，放入湿盒中，于37℃保温15分钟；
7)按50微升/孔的量，在步骤6)所述的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得到检测结果(结果见表3)。
8)判定结果：
阴性对照空的平均值为：0.035，小于0.05，应按0.05计算
故Cutoff值＝0.05×2.1＝0.105
按照样品的A值≥Cutoff值，该样品判定为阳性样品；样品的A值＜Cutoff值，该样品判为阴性。
表3、小鼠血清检测结果
  阳性结果   阴性结果   阳性率
  血样例数   71   4   94.7％
实施例4
固定病毒特异性抗原表位多肽检测小鼠血清中的EV71抗体
1)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将病毒特异性抗原表位多肽稀释至1微克/毫升，按100微升/孔的量加入酶标板孔中，置于4℃孵育过夜，PBS洗液洗板3次；
2)用封闭液按200微升/孔的量加入酶标板孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板3次；
3)用5％蔗糖按100微升/孔的量，加入酶标板孔中，37℃孵育0.5～1小时，拍干，4度储存待用
4)用含有1％BSA的PBS将四份小鼠阳性血清和两份小鼠阳性血清作一系列的稀释度：1∶4、1∶8、1∶16、1∶32，按100微升/孔的量，加入预制备的酶标板的孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板4次，同时设立阴性对照孔2个，和空白孔1个；
5)按100微升/孔的量，在步骤4)所述的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入37℃孵育0.5小时，PBS洗液洗板3～5次；
6)按100微升/孔的量，在步骤5)所述的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺显色液，放入湿盒中，于37℃保温15分钟；
7)按50微升/孔的量，在步骤6)所述的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得到检测结果(结果见表4)。
表4、小鼠血清中肠道病毒71型抗体测定结果(OD492值)
  稀释倍数   阳性1   阳性2   阳性3   阳性4   阴性1   阴性2
  4   2.179   2.207   2.578   1.37   0.109   0.108
  8   1.717   1.816   2.445   0.875   0.084   0.071
  16   1.348   1.448   2.248   0.581   0.051   0.051
  32   0.981   1.126   2.144   0.351   0.04   0.042
实施例5
固定病毒特异性抗原表位多肽检测人体血清中肠道病毒71型抗体
1)用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将病毒特异性抗原表位多肽稀释至1微克/毫升，按100微升/孔的量加入酶标板孔中，置于4℃孵育过夜，PBS洗液洗板3次；
2)用封闭液按200微升/孔的量加入酶标板孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板3次；
3)用5％蔗糖按100微升/孔的量，加入酶标板孔中，37℃孵育0.5～1小时，拍干，4度储存待用
4)用含有1％BSA的PBS将分别对两份EV71人体阳性血清和两份人体阴性血清作一系列的稀释度：1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320，按100微升/孔的量，加入步骤预制备的酶标板的孔中，37℃孵育1小时，PBS洗液洗板4次，同时设立空白孔1个；
5)按100微升/孔的量，在步骤4)所述的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入37℃孵育0.5小时，PBS洗液洗板3～5次；
6)按100微升/孔的量，在步骤5)所述的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺显色液，放入湿盒中，于37℃保温15分钟；
7)按50微升/孔的量，在步骤6)所述的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度OD值，即得到检测结果(结果见表5和图3)。
表5、人体血清中肠道病毒71型抗体测定结果(OD492值)
  稀释倍数   阳性1   阳性2   阴性1   阴性2   空白
  10   1.113   1.135   0.304   0.316   -0.003
  20   1.019   1.081   0.222   0.244
  40   0.863   0.928   0.176   0.205
  80   0.688   0.746   0.137   0.168
  160   0.489   0.584   0.103   0.132
  320   0.358   0.429   0.081   0.1
实施例6
固定病毒特异性抗原表位多肽检测不同年龄人群血清EV71抗体水平
运用本发明对170份不同年龄组的正常人群血清中的EV71抗体阳性水平进行检测，将血清样平用稀释液稀释50倍，以阴性参照的2.1倍作为域值(Cutoff值)，大于Cutoff值得血样判为阳性，反之则为阴性。结果见表6和图4。从该结果可以看出，随着年龄的增长，人群中EV71抗体的阳性率逐渐增加，说明人群中EV71病毒的感染随着年龄的增长而增加，这一结果与流行病学规律相符。
表6、不同年龄段正常人群血清的EV71抗体检测结果
Figure BSA00000390124300101

Claims (7)

1.一种肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于将纯化的肠道病毒71型病毒颗粒，合成的病毒样颗粒抗原，合成的含病毒特异性抗原表位的多肽固定到酶标板上，通过间接酶联免疫吸附的方法进行测定。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于具体步骤如下：
A.酶标板的预制
A.1EV71病毒抗原的固定：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将纯化的EV71病毒抗原稀释至1～5微克/毫升，按50～100微升/孔的量，加入酶标板的孔中，放于4℃孵育过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗液洗板3～5次；
A.2酶标板的封闭：用封闭液按200微升/孔的量加入步骤A.1的酶标板孔中，37℃孵育1～2小时，PBS洗液洗板3～5次；
A.3加保护剂：用5％蔗糖按100～200微升/孔的量，加入步骤A.2酶标板的孔中，37℃孵育0.5～1小时，拍干，4度储存待用；
B.用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS将血清作不同的稀释度，按50～100微升/孔的量，加入步骤A.3酶标板的孔中，同时设立阴性对照，阳性对照和空白孔，37℃孵育1～2小时，PBS洗液洗板3～5次；
C.按50～100微升/孔的量，在步骤B的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入37℃孵育0.5～1小时，PBS洗液洗板3～5次；
D.按50～100微升/孔的量，在步骤C的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺显色液，放入湿盒中，于37℃保温10～20分钟；
E.按50～100微升/孔的量，在步骤D的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度OD值，即得到检测结果。
3.根据权利要求1所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于含有病毒特异性抗原表位的多肽抗原用作固定抗原。
4.根据权利要求2所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于A.3步骤所述的添加5％蔗糖作为稳定保护剂。
5.根据权利要求2所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于洗板用磷酸盐缓冲液洗液在洗板机上洗板或手工洗板。
6.根据权利要求2所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液洗液、碳酸盐缓冲液、终止液、邻苯二胺显色液、封闭液为常规用液。
7.根据权利要求1所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于用于血清中肠道病毒71型特异性抗体的定性或定量检测。
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