CN102854317A - 一种ev71抗原酶联反应检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种病毒抗原含量检测试剂盒及其制备方法，更具体地说是涉及一种对EV71病毒抗原含量进行定性和定量的酶联反应免疫试剂盒及其制备方法。本发明采用的双抗体酶联反应检测试剂盒及其制备方法具有特异性好、灵敏度高、方便快捷且经济等特点。

Description

一种EV71抗原酶联反应检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种病毒抗原含量检测试剂盒及其制备方法，更具体地说是涉及一种对EV71病毒抗原含量进行定性和定量的酶联反应免疫试剂盒及其制备方法。

背景技术

(一)EV71病毒及其疫苗的研究进展

1、概述及致病机制

肠道病毒71型(英文名为：Human enterovirus 71)，简称EV71：EV71病毒属于小RNA病毒科，病毒颗粒为典型的正二十面体结构。由于EV71引起的手足口病(hand-foot and mouthdisease；HFMD)影响范围的广泛性、危害的严重性，该病在中国已纳入丙类传染病管理。鉴于此，世界各国学者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。

EV71病毒属于小RNA病毒科，病毒颗粒为典型的正二十面体结构。其基因组为单股正链RNA，长度约为7,408个核苷酸，编码开放读码框(open-reading frame，ORF)。EV71基因组编码的多聚蛋白(polyprotein)约含2，193个氨基酸，该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白(图1)。经过进一步的剪切，P1前体蛋白可以进一步成熟为VP1、VP2、VP3和VP4四个病毒结构蛋白，负责病毒颗粒的装配和稳定；P2前体蛋白则进一步成熟为非结构蛋白(non-structural protein，nsp)2A(特异性蛋白酶)、2B和2C；P3前体蛋白则用以形成非结构蛋白3A、3B(VPg，5’末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)和3D(RNA-dependent RNApolymerase，RdRp)。

肠病毒的流行与季节转换、环境变异有着极大的关联性，肠病毒只在夏季及初秋流行，每年六～九月为高峰期，气温过低的地区并不利于肠病毒生存。根据流行病学调查，肠病毒之传染途径主为粪--口传染(stool-oral)，感染肠病毒的患者会经由粪便排出病毒，这些含有高浓度肠病毒的粪便会污染环境甚至地下水源，在公共卫生条件不佳的地区，极易经由污染的水源而散播该病毒。EV71对于中枢神经系统有极高的感染性，故临床上出现之症状包括脑炎(encephalitis)、无菌性脑膜炎(aseptic meningitis)、急性无力肢体麻痹(acute flaccidparalysis)、手足口症(hand-foot-mouth disease)、泡疹性咽峡炎(herpangina)、急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjuctivitis)、肌肉僵直(myoclonicjerk)、头痛(headache)、发烧(fever)及呕吐(vomoting)等，而其中以手足口症及泡疹性咽峡炎最为常见。一般而言，感染肠病毒多为无症状(约50～80％)或出现轻微类似感冒的症状，病人会自然痊愈而产生抗体，但因感染肠病毒且转成重症之患者却有极高的机率死于心肺衰竭及广泛性的脑干伤害，实不容小觑。

3、流行病学

人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的，这些病毒可被培养在恒河猴肾脏细胞(rhesus monkey kidney cell；RhMK)及人胚二倍体细胞(human fetal diploid cell)中。若检体取自病人粪便及组织即以人胚肾二倍体细胞(diploid strain of human fetal kidney cell；HFDK)培养；若为咽喉拭子检体则选用人胚肺二倍体细胞(diploid strain of human fetal lung cell)培养。经由这些细胞培养后纯株化病毒分析，发现会出现典型由肠病毒所致的细胞病变(cytopathetic effect；CPE)现象，由电子显微镜下观察其形态(morphology)及物理化学(physicochemical)特性都与当时已知的其他肠病毒类似，但进行中和抗体试验(neutralization test)或免疫扩散试验(immunodiffusion test)后，却发现其彼此间并不会有交互作用的现象，因此推测当时所发现的病毒为一种新型的肠病毒，故将该病毒株命名为肠病毒71型。

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年新西兰首次报道该病，1958年分离出柯萨奇病毒(Coxsackieviruses)，1959年提出手足口病名称。手足口病的早期病原体主要为Cox A16型，但1969年美国在中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出EV71病毒并被首次确认。此后EV71感染与Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。

3、产品研发

加强对EV71型感染病患的防控工作，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。而相关疫苗的研究开发和病毒抗原的快速检测试剂盒是预防控制此传染病的关键。

在EV71病毒所编码的四个结构蛋白中，VP1、VP2和VP3主要用来形成包装病毒颗粒的衣壳(capsid)，而VP4则被包埋在病毒衣壳的内部，负责与核心(core)相互作用，用以稳定病毒的基因组，因此VP1、VP2和VP3形成了EV71病毒的主要抗原决定簇，其中又以VP1的抗原性最强，而成为目前抗体研究与设计开发的主要靶点。

同时，研究表明肠道病毒存在着众多的型内、型间的交叉反应性，并且存在着较高的重组性。其中EV71与Cox A16的相似性达到了80％，拥有很多共同表位，许多克隆抗体EV71的单抗具有了与Cox A16的交叉反应性。成为EV71抗原检测方法建立的一项制约。

常规的针对EV71病毒的诊断方法主要通过分离病毒，中和抗体检测和免疫组织化学法来进行。但这些方法费时、费力，无法满足疾病流行期间同时大量处理大量标本的需要。同时，鉴于EV71病毒的危害性，有必要开发一种简单快速易行的检测EV71病毒抗原表位含量的检测方法。该研究使用的特异性识别EV71病毒Vp1中保守区域基因的单克隆抗体具有高效的EV71病毒的中和效果，同时与Cox A16交叉反应性，有效避免了抗原检测中与EV7180％相似性的Cox A16的假阳性干扰。因此，所述方法的成功开发对于疫苗的研发中抗原表位这一有效组分的检测有着重要的意义，同时该方法也为EV71疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。

(二)手足口病的研究进展

1、概述及发病机制

手足口病(Hand-foot-and-mouth disease)是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)最为常见。

2、流行病学

手足口病是世界性传染病，世界各地均有发生。1957年新西兰首次报道该病，1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出手足口病名称。手足口病的早期病原体主要为Cox A16型，但1969年美国在中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出EV71病毒并被首次确认。此后EV71感染与Cox A16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。在国外，20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继爆发以中枢神经系统感染为主要特征的EV71流行，仅保加利亚就有超过750例病例，149人致瘫，44人死亡。20世纪90年代后期，EV71开始在东亚地区传播。1997年马拉西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4-8月共发生了2628例病例，仅4-6月就有29例病人死亡。死者平均年龄1.5岁，病程仅2天。

在我国分布也很广泛，从南方的台湾、福建、广东、深圳、上海，到北方的山东、北京、天津直到吉林大约近20个省市均有发病报道。早在26年前上海就发现此病，1983年和1986年两次在天津发生柯萨奇病毒A16型引起的手足口病暴发流行。1983年5月至10月间发生了7000余病例。1995年武汉病毒研究所从手足口病患者中分离出肠道病毒71型毒株。2008年3-5月在安徽省阜阳市出现的EV71感染暴发流行中，三个月内功出现了69538人的感染，而死亡人数达到了39人。从而引起的社会的恐慌。随后该疾病被纳入丙类传染病管理。截至2009年4月17日全国31人死于手足口病：其中安徽22例，广东3例，浙江1例，广西2例，湖南1例，海南2例。

3、发展趋势

由于无疫苗、药物等特异性的防控手段，该病存在隐性感染和轻症病例多，传染源难以发现和控制，儿童普遍易感，传播途径多，难以有效阻断等原因，预防控制EV71带来的手足口病难度较大。由于EV71引起的手足口病影响范围的广泛性、危害的严重性，该病在我国已纳入丙类传染病管理。鉴于此，国内外学者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。

由于肠道病毒分型多，且手口足病发病快且凶猛，目前对于此类疾病的诊断试剂盒多采用多种肠道病毒抗原的多克隆抗体或单克隆抗体，普遍生产成本较高，对生产工艺要求也较高，该研究采用的双抗体酶联反应检测试剂盒及其制备方法具有特异性好、灵敏度高、方便快捷且经济等特点。

经文献检索等，到目前为止，尚未发现有新的针对EV71病毒Vp1中保守区域基因的单克隆抗体及相应的酶联反应检测试剂盒及其制备方法方面的报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是提供了新的EV71病毒检测试剂盒及其制备方法，即一种新的EV71抗原酶联反应检测试剂盒及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明针对现有技术的不足，通过大量生物技术实验等实践研究以及文献检索和理论研究，目的之一意在提供一类EV71抗原酶联反应检测试剂盒，即提供一类用于检测EV71病毒的检测试剂盒，特别是可以进行定性与定量的EV71抗原酶联反应检测试剂盒。

本发明的目的之二是提供一种检测EV71抗原含量的试剂盒或试剂，其包含特异性识别EV71病毒Vp1中保守区域基因的单克隆抗体或其保守性突变体或活性片段。

本发明的目的之三是一种含有所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段的试剂盒或试剂的制备方法。

本发明的目的之四是提供一种定量和定性检测EV71抗原的方法，其中包括使用本发明所述的试剂盒或试剂。

本发明的目的之五是提供所述的试剂盒或试剂在定量或定性检测EV71抗原中的用途。

(一)技术构思

常规的针对EV71病毒的诊断方法主要通过分离病毒、中和抗体检测和免疫组织化学法来进行。但这些方法费时、费力，无法满足疾病流行期间同时大量处理大量标本的需要。

迄今为止，现有的研究表明肠道病毒存在着众多的型内、型间的交叉反应性，并且存在着较高的重组性。其中EV71与Cox A16的相似性达到了80％，拥有很多共同表位，许多克隆抗体EV71的单抗具有了与Cox A16的交叉反应性，成为EV71抗原检测方法建立的一项制约。

同时，鉴于EV71病毒的危害性，有必要开发一种简单快速易行的检测EV71病毒抗原表位含量的检测方法。

本发明从抗EV71单克隆抗体具有高效的EV71病毒Vp1中保守区域基因的角度出发，希望能够有效避免抗原检测中与EV71具有80％相似性的Cox A16的假阳性干扰。

因此，结合现有的单克隆抗体技术，进行改进和完善，特别是从EV71抗原酶联反应检测试剂盒及其制备方法等方面进行探索，具有非常重要的意义。

根据此想法和思路，发明人通过反复的实验研究与分析和理论探索，已成功得到预期的研究结果和应用产品EV71抗原酶联反应检测试剂盒。

(二)EV71抗原酶联反应检测试剂盒

EV71抗原酶联反应检测试剂盒内设有阳性参考品、样品稀释液、浓缩洗液、显色液A、显色液B和终止液、特异性识别EV71病毒Vp1中保守区域基因的单克隆抗体或其保守性突变体或活性片段；

所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的；

所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素、生物素、胶体金离子标记的；

所述的单克隆抗体为特异性识别EV71病毒Vp1中保守区域基因的单克隆抗体或其保守性突变体或活性片段；

所述的针对EV71的单克隆抗体是通过不同的表达系统进行EV71病毒结构蛋白Vp1中的保守区域基因克隆表达而得的抗原后获得；

所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的；

所述的生物标记是优选酶标记；

所述的化学标记是优选荧光标记；

所述的酶标记是包括辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、葡萄糖氧化酶标记或碱性磷酸酶标记等中的一种或多种；进一步优选是采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(简称：HRP)；

所述的荧光标记是包括荧光素标记、生物素或胶体金离子标记等中的一种或多种；进一步优选是采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(简称：HRP)；

该EV71抗原酶联反应检测试剂盒还可以包含针对EV71的单克隆抗体和/或包被有针对EV71的单克隆抗体的包被板。

(三)EV71抗原酶联反应检测试剂盒的制备方法

EV71抗原酶联反应检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗原参考品的制备；

(2)单克隆抗体的制备；

(3)抗EV71单抗包被板的制备；

(4)酶标抗体的制备；

(5)样品稀释液、浓缩洗液、终止液的配置；

(6)显色液的配置；

其中，所述的EV71抗原检测方法是双抗体夹心酶联免疫法；

(1)所述的抗原参考品制备方法如下：

将通过基因工程方法制备的EV71病毒Vp1纯化液配制为含有抗原的溶液，然后向该溶液添加牛血清白蛋白作为保护剂。对其进行分装，即制得EV71抗原参考品；

(2)所述的单克隆抗体制备方法如下：

①采用制备的EV71纯化液免疫小鼠.效价测定后，采用效价最高的小鼠取脾脏细胞与骨髓瘤细胞按比例进行融合，在培养液上培养融合杂交的瘤细胞；

②进行三次亚克隆，每次亚克隆时，检测各细胞孔的效价，对于OD值大于0.6的孔的细胞进行克隆化，获得高效价的针对不同位点的单克隆抗体的细胞株；

③通过对获得的细胞株进行大规模培养，并将培养后的细胞注射到小鼠腹腔，制备抗EV71单克隆抗体腹水，即得所述的单克隆抗体；

(3)所述的抗EV71单抗包被板的制备方法如下：

使用制备的纯化的抗EV71克单隆抗体作为包被抗体，以最佳包被抗体浓度加于酶标板反应孔内，并于低温下放置。弃去包被液，用洗液洗板多次，拍干；加入封闭液于孔中，封闭，弃去封闭液，拍干，干燥，真空封装，最后将封装后的包被板于低温下保存；

(4)所述的酶标抗体的制备方法如下；

将获得的纯化抗EV71单克隆抗体BE2采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(HRP)，标记后加等体积甘油分装，-20℃放置。

其中所述的酶标抗体使用前采用方阵滴定法确定最适工作浓度；

(5)所述的样品稀释液、浓缩洗液、终止液配置方法如下：

1)样品稀释液

取牛血渍白蛋白10g，加入0.01M PBS 1000ml，混合生物素防腐剂0.5ml即得样品稀释液。

2)浓缩洗液

取NaH₂PO₄.2H₂O 2.96g、Na₂HPO₄.12H₂O 29.0g、NaCl 234g和Tween-2020ml加纯化水至1000ml即得。

3)终止液

取浓硫酸112ml加入纯化水888ml即得。

(6)所述的显色液配置方法如下：

1)显色液A

取醋酸钠27.2g、柠檬酸3.2g、30％H₂O₂0.6ml加入双蒸水至1000ml即得。

2)显色液B

取TMB0.4g、EDTA-Na₂0.4g、柠檬酸1.9g、甘油100ml加入双蒸水至1000ml。

(四)EV71抗原酶联反应检测试剂盒的使用方法

EV71抗原酶联反应检测试剂盒的使用方法，即EV71抗原酶联反应检测试剂盒的检测操作程序或检测方法。

本发明所述的检测方法是通过ELISA方法来实现的；本发明的试剂盒或实际是通过ELISA进行对EV71抗原进行定量的。

EV71抗原酶联反应检测试剂盒的检测操作程序如下：

A.定性检测

(1)将浓缩洗涤液用蒸馏水做高倍数稀释；

(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，加检样品、阳性对照；

(3)恒温水浴箱避光孵育，用洗液洗涤，拍干；

(4)将标记抗体用加入各反应孔；

(5)恒温水浴箱避光孵育；

(6)用洗涤液洗涤，拍干；

(7)加入显色液A于孔中，再加入显色液B，震荡将其混匀；

(8)恒温水浴箱避光孵育；

(9)滴加终止液于孔中，震荡混匀；

(10)用酶标仪于450nm波长下读数；

(11)结果判定；

Cut off值＝2.1×N(N为阴性对照平均A值)

a阴性对照平均A值应小于0.3，否则实验不成立。

b标本A值小于Cut off值为阴性，大于等于Cut off值为阳性。

B.定量检测

(1)将浓缩洗涤液用蒸馏水做高倍数稀释；

(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，将抗原标准品稀释为不同年度，每稀释度各加一孔；

(3)加待检样品、标准品、样品；

(4)恒温水浴箱避光孵育，用洗液洗涤，拍干；

(5)将标记抗体用加入各反应孔；

(6)恒温水浴箱避光孵育；

(7)用洗涤液洗涤，拍干；

(8)加入显色液A、显色液B，震荡将其混匀；

(9)恒温水浴箱避光孵育；

(10)滴加终止液，震荡混匀；

(11)用酶标仪于450nm波长下读数；

(12)结果判定；

Cut off值＝2.1×N(N为阴性对照平均A值)

a阴性对照平均A值应小于0.3，否则实验不成立。

b采用直线回归法计算样品抗原滴度，R2值应大于0.97。

(五)主要用途与技术特长

本发明为医药等行业提供了一种新的EV71抗原酶联反应检测试剂盒及其制备方法，从而拓展了手足口病新诊断产品的应用。

本发明EV71抗原酶联反应检测试剂盒是安全的，能够用于医疗、诊断等工业和行业的大规模生产和应用。

与现有的手足口病新诊断产品相比，本发明EV71抗原酶联反应检测试剂盒在实际应用等方面，具有以下显著特点：

(1)本试剂盒检测的是EV71病毒结构蛋白Vp1，灵敏度更高，特异性更强。

(2)本试剂盒采用BE1单克隆抗体包被，且采用BE2单克隆抗体作为酶标记第二抗体，有效的保证了试剂盒的特异性。

(3)该试剂盒可用于EV71病毒各种基因型抗原的检测，具有广泛适用性，即广谱性。

(4)肠道病毒存在着众多的型内、型间的交叉反应性，并且存在着较高的重组性，其中EV71与Cox A16的相似性达到了80％。该方法与Cox A16无交叉反应，说明该HD6单克隆抗体与Cox A16无交叉反应，避免了许多克隆抗体EV71单抗具有与Cox A16的交叉反应性对EV71抗原检测方法建立的制约因素；更加有利于EV71疾病的筛查、手足口病的疾病调查；对于EV71疫苗与Cox A16疫苗的区别、分析、比较至关重要。

(5)本发明EV71抗原酶联反应检测试剂盒价廉、安全、不含重金属成分，提高了产品的应用面，安全有效，适用范围更加广泛，赋予了其更高的实用性，是一种有良好应用前景的EV71抗原酶联反应检测试剂盒；

(6)本发明EV71抗原酶联反应检测试剂盒稳定、经济，采用双抗体ELISA检测，降低了其生产成本；制备工艺简单，质量控制简便，便于企业大规模生产和医药商业应用；研制和改进该EV71抗原酶联反应检测试剂盒具有显著的社会效益、经济效益。

因此，本发明所述方法的成功开发对于疫苗的研发中抗原表位这一有效组分的检测有着重要的意义，同时该方法也为EV71疾病的防治、早期筛查、诊断工作提供了准确、简便、有效的监测手段，具有广泛的应用范围和社会需求。

总之，本发明积极适应了现代生物、预防保健、临床诊断等领域的工作需要和人性化服务的需要，本发明为研究开发该EV71抗原酶联反应检测试剂盒，对改进和提高现有的该EV71抗原酶联反应检测试剂盒具有重要价值。

具体实施方式

本发明研究了现有的手足口病诊断技术，提供了一种新的EV71抗原酶联反应检测试剂盒，便于现代生物、预防保健、临床诊断等领域的安全使用。

现就本发明EV71抗原酶联反应检测试剂盒的制备方法，具体阐述如下：

(1)抗原参考品的制备；

(2)单克隆抗体的制备；

(3)抗EV71单抗包被板的制备；

(4)酶标抗体的制备；

(5)样品稀释液、浓缩洗液、终止液的配置；

(6)显色液的配置；

其中，所述的EV71抗原检测方法是双抗体夹心酶联免疫法；

(1)所述的抗原参考品制备方法如下：

将通过基因工程方法制备的EV71病毒Vp1纯化液配制为含有抗原的溶液，然后向该溶液添加牛血清白蛋白作为保护剂。对其进行分装，即制得EV71抗原参考品；

(2)所述的单克隆抗体制备方法如下：

①采用制备的EV71纯化液免疫小鼠.效价测定后，采用效价最高的小鼠取脾脏细胞与骨髓瘤细胞按比例进行融合，在培养液上培养融合杂交的瘤细胞；

②进行三次亚克隆，每次亚克隆时，检测各细胞孔的效价，对于OD值大于0.6的孔的细胞进行克隆化，获得高效价的针对不同位点的单克隆抗体的细胞株；

③通过对获得的细胞株进行大规模培养，并将培养后的细胞注射到小鼠腹腔，制备抗EV71单克隆抗体腹水，即得所述的单克隆抗体；

(3)所述的抗EV71单抗包被板的制备方法如下：

使用制备的纯化的抗EV71克单隆抗体作为包被抗体，以最佳包被抗体浓度加于酶标板反应孔内，并于低温下放置。弃去包被液，用洗液洗板多次，拍干；加入封闭液于孔中，封闭，弃去封闭液，拍干，干燥，真空封装，最后将封装后的包被板于低温下保存；

(4)所述的酶标抗体的制备方法如下；

将获得的纯化抗EV71单克隆抗体BE2采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(HRP)，标记后加等体积甘油分装，-20℃放置。

其中所述的酶标抗体使用前采用方阵滴定法确定最适工作浓度；

(5)所述的样品稀释液、浓缩洗液、终止液配置方法如下：

4)样品稀释液

取牛血渍白蛋白10g，加入0.01M PBS 1000ml，混合生物素防腐剂0.5ml即得样品稀释液。

5)浓缩洗液

取NaH₂PO₄.2H₂O 2.96g、Na₂HPO₄.12H₂O 29.0g、NaCl 234g和Tween-2020ml加纯化水至1000ml即得。

6)终止液

取浓硫酸112ml加入纯化水888ml即得。

(6)所述的显色液配置方法如下：

1)显色液A

取醋酸钠27.2g、柠檬酸3.2g、30％H₂O₂0.6ml加入双蒸水至1000ml即得。

2)显色液B

取TMB0.4g、EDTA-Na20.4g、柠檬酸1.9g、甘油100ml加入双蒸水至1000ml。

现就本发明EV71抗原酶联反应检测试剂盒的使用方法，具体阐述如下：

试剂盒检测操作程序

A.定性检测

(1)将浓缩洗涤液用蒸馏水做10～40倍稀释；

(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，加用样品稀释液适当稀释的待检样品、已稀释的阳性对照，各两孔，50～200ul/孔，加样过程须在规定的时间内完成；

(3)37℃恒温水浴箱避光孵育20～50分钟，用洗液洗涤多次，拍干；

(4)将标记抗体用加入各反应孔，20～80μl/孔。

(5)37℃恒温水浴箱避光孵育20～50分钟；

(6)用洗涤液洗涤多次，拍干；

(7)加入显色液A20～80ul/孔，再加入显色液B 20～80ul/孔，轻柔震荡5～20秒将其混匀；

(8)37℃恒温水浴箱避光孵育5～10分钟。

(9)滴加终止液两滴/孔，轻柔震荡10～40秒混匀；

(10)5～20分钟内用酶标仪于450nm波长下读数；

(11)结果判定

Cut off值＝2.1×N(N为阴性对照平均A值，如小于0.05按0.05计)

a阴性对照平均A值应小于0.3，否则实验不成立；

b标本A值小于Cut off值为阴性，大于等于Cut off值为阳性。

B.定量检测

(1)将浓缩洗涤液用蒸馏水做10～40倍稀释；

(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，将抗原标准品稀释为200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml。每稀释度各加1孔，每孔50～200μl；

(3)加用样品稀释液适当稀释的待检样品，50～200ul/孔；标准品、样品加样过程须在5～30分钟内完成；

(4)37℃恒温水浴箱避光孵育10～60分钟，用洗液洗涤多次，拍干；

(5)将标记抗体用加入各反应孔，20～100μl/孔；

(6)37℃恒温水浴箱避光孵育20～40分钟；

(7)用洗涤液洗涤多次，拍干；

(8)加入显色液A20～150ul/孔，再加入显色液B 20～150ul/孔，轻柔震荡5～30秒将其混匀；

(9)37℃恒温水浴箱避光孵育5～10分钟；

(10)滴加终止液两滴/孔，轻柔震荡10～60秒混匀；

(11)5～30分钟内用酶标仪于450nm波长下读数；

(12)结果判定

Cut off值＝2.1×N(N为阴性对照平均A值，如小于0.05按0.05计)

a阴性对照平均A值应小于0.3，否则实验不成立；

b采用直线回归法计算样品抗原滴度，R2值应大于0.97。

现就本发明EV71抗原酶联反应检测试剂盒的试剂盒线性范围、线性、特异性、灵敏性、准确性、精密性、重复性的检测方法，具体阐述如下：

A.特异性

特异性评价：组装的EV71病毒ELISA检测试剂盒用于检测肠道病毒以及其它病毒，结果表明该试剂盒的特异性很高。

结果表明：该检测试剂盒的特异性高，与HSV、腺病毒、RSV、麻疹病毒、HAV等多种病毒没有交叉。

B、灵敏度、线性、线性范围

灵敏度检测的Vp1范围5ng～1000ng/ml。

病毒定量检测(原液TCID50＝107/100ul)

培养的EV71病毒原液检测的TCID50为107/100ul，可以检测100倍稀释的培养病毒上清。

本发明最终需要制备成EV71抗原酶联反应检测试剂盒进行应用，下面将列举实施例进行进一步说明。如有问题，可以与发明人直接联系。上述提供的一些实验数据以及下列实施例中按前述发明内容给出几种EV71抗原酶联反应检测试剂盒及其使用方法及一些试验研究内容，但应该理解本发明并不仅限于此处所列出的研究内容，还应该理解此处所使用的术语仅用于描述特定的实施例，而并不是对本发明的限定。

也就是说，在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实施例均是为了更好地阐述本发明，特别是这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，不能解释为了对本申请的限制或者用来限制本发明的保护范围。

为了更清楚地说明本发明，下面结合如下实施例对本发明作详细描述。

实施例1、EV71抗原参考品的制备

根据多年来发明人对全国不同疫区的肠道病毒EV71研究，对不同毒株的基因和蛋白序列进行分析，发明人选取EV71病毒结构蛋白Vp1中的保守区域基因进行克隆，采用不同的表达系统进行表达以制备抗原。表达过程中采用原核或真核的表达系统，以使制备的抗原具备更加天然的成分，以保证制备抗体的特异性。

将通过基因工程方法制备的EV71病毒Vp1纯化液配制为抗原含量为1000ng/ml的溶液，然后向该溶液添加1％牛血清白蛋白作为保护剂。对其进行分装，1.0ml/瓶，制备EV71抗原参考品。

实施例2、识别EV71抗原的单克隆抗体的制备

采用制备的EV71纯化液免疫BALB/c小鼠。用间接ELISA法进行效价测定，采用效价最高的BALB/c小鼠取脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按比例进行融合，在HAT培养液上培养融合杂交的瘤细胞。进行三次亚克隆，每次亚克隆时，检测各细胞孔的间接ELISA法效价，对于OD值大于0.6的孔的细胞进行克隆化，获得高效价的针对不同位点的单克隆抗体的细胞株。通过对获得的细胞株进行大规模培养，并将培养后的细胞注射BALB/c小鼠腹腔，制备抗EV71单克隆抗体腹水。通过ELISA(竞争法)与天然病毒裂解的反应证实所得抗体的位点特异性。所得两株抗体分别命名为BE1和BE2。

实施例3、抗EV71单抗包被板的制备(或EV71抗原包被板的制备)

使用制备的纯化的抗EV71克单隆抗体BE1作为包被抗体，以最佳包被抗体浓度(10mg/ml，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释)每孔100ul加于酶标板反应孔内，并于4℃下放置14～20小时。弃去包被液，用洗液洗板3次，拍干；加入封闭液(1％牛血清白蛋白，0.01M PBS)150ul/孔，于37℃下封闭1小时，弃去封闭液，拍干，37℃干燥1小时，真空封装，最后将封装后的包被板于2～8℃下保存。

实施例4、酶标抗体的制备

将获得的纯化抗EV71单克隆抗体BE2采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(HRP)，标记后加等体积甘油分装，-20℃放置，使用前采用方阵滴定法确定最适工作浓度。

实施例5、样品稀释液、浓缩洗液、终止液的配置

(1)样品稀释液

牛血渍白蛋白    10g

0.01M PBS       1000ml

生物素防腐剂    0.5ml

(2)浓缩洗液

(3)终止液

浓硫酸          112ml

纯化水          888ml

实施例6、显色液的配置

(1)显色液A

(2)显色液B

实施例7、试剂盒检测操作程序之一

A.定性检测

(1)将浓缩洗涤液用蒸馏水做30倍稀释；

(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，加待检样品(用样品稀释液适当稀释)、阳性对照(已稀释)，各两孔，60ul/孔，加样过程在30分钟内完成；

(3)37℃恒温水浴箱避光孵育40分钟，用洗液洗涤四遍，拍干；

(4)将标记抗体用加入各反应孔，70μl/孔；

(5)37℃恒温水浴箱避光孵育45分钟；

(6)用洗涤液洗涤四遍，拍干；

(7)加入显色液A 80ul/孔，再加入显色液B 80ul/孔，轻柔震荡15秒将其混匀；

(8)37℃恒温水浴箱避光孵育15～20分钟；

(9)滴加终止液两滴/孔，轻柔震荡40秒混匀；

(10)20分钟内用酶标仪于450nm波长下读数；

(11)结果判定

Cut off值＝2.1×N(N为阴性对照平均A值，如小于0.05按0.05计)

a阴性对照平均A值应小于0.3，否则实验不成立；

b标本A值小于Cut off值为阴性，大于等于Cut off值为阳性。

B.定量检测

(1)将浓缩洗涤液用蒸馏水做20倍稀释；

(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，将抗原标准品稀释为100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml，每稀释度各加1孔，每孔150μl；

(3)加用样品稀释液适当稀释的待检样品，100ul/孔。标准品、样品加样过程在45分钟内完成；

(4)37℃恒温水浴箱避光孵育45分钟，用洗液洗涤四遍，拍干；

(5)将标记抗体用加入各反应孔，80μl/孔；

(6)37℃恒温水浴箱避光孵育45分钟；

(7)用洗涤液洗涤四遍，拍干；

(8)加入显色液A 80ul/孔，再加入显色液B 80ul/孔，轻柔震荡20秒将其混匀；

(9)37℃恒温水浴箱避光孵育15～20分钟；

(10)滴加终止液两滴/孔，轻柔震荡40秒混匀；

(11)30分钟内用酶标仪于450nm波长下读数；

(12)结果判定

Cut off值＝2.1×N

(N为阴性对照平均A值，如小于0.05按0.05计)

a阴性对照平均A值应小于0.3，否则实验不成立；

b采用直线回归法计算样品抗原滴度，R2值应大于0.97。

实施例8、试剂盒检测操作程序之二

A.定性检测

(1)将浓缩洗涤液用蒸馏水做20倍稀释；

(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，加待检样品(用样品稀释液适当稀释)、阳性对照(已稀释)，各两孔，100ul/孔，加样过程须在15分钟内完成；

(3)37℃恒温水浴箱避光孵育30分钟，用洗液洗涤四遍，拍干；

(4)将标记抗体用加入各反应孔，50μl/孔；

(5)37℃恒温水浴箱避光孵育30分钟；

(6)用洗涤液洗涤四遍，拍干；

(7)加入显色液A 50ul/孔，再加入显色液B 50ul/孔，轻柔震荡5秒将其混匀；

(8)37℃恒温水浴箱避光孵育5～10分钟；

(9)滴加终止液两滴/孔，轻柔震荡20秒混匀；

(10)10分钟内用酶标仪于450nm波长下读数；

(11)结果判定

Cut off值＝2.1×N  (N为阴性对照平均A值，如小于0.05按0.05计)

a阴性对照平均A值应小于0.3，否则实验不成立；

b标本A值小于Cut off值为阴性，大于等于Cut off值为阳性。

B.定量检测

(1)将浓缩洗涤液用蒸馏水做20倍稀释；

(2)取出包被有抗EV71抗体的微孔板孔板，平衡至室温，将抗原标准品稀释为200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml，每稀释度各加1孔，每孔100μl；

(3)加用样品稀释液适当稀释的待检样品，100ul/孔。标准品、样品加样过程须在15分钟内完成；

(4)37℃恒温水浴箱避光孵育30分钟，用洗液洗涤四遍，拍干；

(5)将标记抗体用加入各反应孔，50μl/孔；

(6)37℃恒温水浴箱避光孵育30分钟；

(7)用洗涤液洗涤四遍，拍干；

(8)加入显色液A 50ul/孔，再加入显色液B 50ul/孔，轻柔震荡5秒将其混匀；

(9)37℃恒温水浴箱避光孵育5～10分钟；

(10)滴加终止液两滴/孔，轻柔震荡20秒混匀；

(11)10分钟内用酶标仪于450nm波长下读数；

(12)结果判定

Cut off值＝2.1×N

(N为阴性对照平均A值，如小于0.05按0.05计)

a阴性对照平均A值应小于0.3，否则实验不成立；

b采用直线回归法计算样品抗原滴度，R2值应大于0.97。

实施例9、试剂盒线性范围、线性、特异性、灵敏性、准确性、精密性、重复性的检测

(1)特异性

特异性评价：组装的EV71病毒ELISA检测试剂盒用于检测肠道病毒以及其它病毒，结果表明该试剂盒的特异性很高。

表1检测EV71病毒抗原含量方法特异性试验450nm吸光度结果

结果表明：该检测试剂盒的特异性高，与HSV、腺病毒、RSV、麻疹病毒、HAV等多种病毒没有交叉。

(2)灵敏度

试剂盒对EV71病毒Vp1的检测

表2EV71抗原检测方法灵敏度

结果表明：抗原含量在1000-5ng/ml时，OD值≥阴性对照*2.1，该方法的检测灵敏度为5ng/ml

(3)检测范围及线性：

表3EV71抗原检测方法线性试验吸光度值结果

结果表明：抗原含量在5-1000ng/ml时，连续9点线性≥0.97，检测的Vp1范围5ng～1000ng/ml。

(4)准确性

稀释EV71抗原使其理论抗原含量依次为200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml，检测上述稀释的抗原含量。

表4EV71抗原检测方法准确性试验

结果表明：200ng/ml准确性为：91％～108％；400ng/ml准确性为：96％～108％；600ng/ml准确性为：92％～111％；800ng/ml准确性为：92％～110％；1000ng/ml准确性为：92％～109％。准确性在90％～120％之间，准确值较高。

(5)精密性

根据抗原含量检查结果，判定变异系数。

表5EV71抗原检测方法精密性试验

结果表明：变异系数均小于10％，变异系数较小，精密性高。

(6)重复性

表11EV71抗原检测方法重复性试验

结果表明：双人重复试验显示：cv值＜10％，具有较好的重复性。

结论：

由于单克隆抗体的特异性较强，同时单克隆抗体为病毒的抗原决定簇表位，因此确定选用双单克隆抗体标酶的模式建立表位抗原含量定量的酶联免疫检测方法。

该EV71抗原检测方法具有较好的特异性，尤其是对于Cox A16无交叉反应性；双人对于EV71纯化前、后的样品进行抗原含量重复检测，两人的变异系数＜10％，重复性良好；3次的线牲相关系数均＞0.99，线性较好；对于EV71病毒纯化前后的样品、铝佐剂吸附EV71样品均能较好的检测；同时该试剂盒的检测结果与EV71疫苗的纯化工艺相吻合，反映了EV71抗原决定簇的纯化效果。

由于用于包被的抗EV71单克隆抗体对于EV71病毒具有较好的中和效果，同时用于酶标记的抗EV71单克隆抗体(BE2)为EV71病毒的中和性单克隆抗体，因此该方法检测的为EV71病毒抗原决定簇的抗原含量，可用于EV71各基因型病毒中和表位抗原含量的检测，能最有效的反应疫苗的抗原性，更有利于指导EV71病毒疫苗的生产，并用于疫苗抗原性与免疫原性的评价。

Claims (11)

1.一种检测EV71抗原的酶联反应试剂盒，试剂盒内设有阳性参考品、样品稀释液、浓缩洗液、显色液A、显色液B和终止液，还装有特异性识别EV71病毒Vp1中保守区域基因的单克隆抗体或其保守性突变体或活性片段。

2.根据权利要求1所述的试剂盒或试剂，其中所述的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的。

3.根据权利要求2所述的试剂盒或试剂，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、碱性磷酸酶标记或葡萄糖氧化酶标记或是荧光素、生物素、胶体金离子标记的。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒或试剂，其进一步包含针对EV71的单克隆抗体和/或包被有针对EV71的单克隆抗体的包被板。

5.一种检测EV71抗原的方法，包括：

A.制备抗原参考品；

B.制备单克隆抗体；

C.抗EV71单抗包被板的制备；

D.酶标抗体的制备；

E.样品稀释液、浓缩洗液、终止液的配置；

F.显色液的配置；

其中所述的单克隆抗体为特异性识别EV71病毒Vp1中保守区域基因的单克隆抗体或其保守性突变体或活性片段。

6.根据权利要求5的方法，其是通过双抗体夹心酶联免疫法进行的。

7.权利要求5的方法，其特征在于所述单克隆抗体采用过碘酸钠氧化法标记辣根过氧化物酶(HRP)。

8.权利要求5的方法，其特征在于所述的抗原参考品的制备方法为：将通过基因工程方法制备的EV71病毒Vp1纯化液配制为抗原含量为1000ng/ml的溶液，然后向该溶液添加1％牛血清白蛋白作为保护剂。对其进行分装，1.0ml/瓶，制备EV71抗原参考品

9.权利要求5的方法，其特征在于所述单克隆抗体的制备方法为：

A.采用制备的EV71纯化液免疫BALB/c小鼠.用间接ELISA法进行效价测定，采用效价最高的BALB/c小鼠取脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按比例进行融合，在HAT培养液上培养融合杂交的瘤细胞；

B.进行三次亚克隆，每次亚克隆时，检测各细胞孔的间接ELISA法效价，对于OD值大于0.6的孔的细胞进行克隆化，获得高效价的针对不同位点的单克隆抗体的细胞株；

C.通过对获得的细胞株进行大规模培养，并将培养后的细胞注射BALB/c小鼠腹腔，制备抗EV71单克隆抗体腹水。

10.权利要求5的方法，其特征在于所述抗EV71单抗包被板的制备方法为：使用制备的纯化的抗EV71克单隆抗体BE1作为包被抗体，以最佳包被抗体浓度(10mg/ml，用0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释)每孔100ul加于酶标板反应孔内，并于4℃下放置14-20小时。弃去包被液，用洗液洗板3次，拍干；加入封闭液(1％牛血清白蛋白，0.01M PBS)150ul/孔，于37℃下封闭1小时，弃去封闭液，拍干，37℃干燥1小时，真空封装，最后将封装后的包被板于2-8℃下保存。

11.权利要求5的方法，其特征在于在所述酶标抗体使用前采用方阵滴定法确定最适工作浓度。