CN101655495A - Ev71型病毒抗原的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种EV71型病毒抗原检测方法，它将待检EV71型病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，再在酶标板的各孔依次加入稀释度为1∶500～3000的生物素标记EV71型抗体，稀释度为1∶2000～10000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，TMB显色液A和B，最后在酶标板的各孔中加入终止液后，置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果。本检测可从一般细胞培养病变法的3－5天缩短为数小时，在较短时间内确诊患者感染的病原体，且在基层医院和防控中心就可完成检测，能及时对症治疗和对疫情进行预防控制，是一种特异性好、灵敏度高、方便快捷的EV71病毒抗原检测方法。

Description

EV71型病毒抗原的检测方法

技术领域

本发明涉及手足口病主要致病病毒——肠道病毒71型病毒抗原的检测方法，属于生物学技术领域。

背景技术

手足口病(Hand-foot-mouth disease，HFMD)主要是由肠道病毒71型(以下简称EV71型)或柯萨奇病毒A16型(COX A16)感染导致的流行性疾病，感染临床表现多样性，从隐性感染、普通手足口病和咽峡炎等轻症，到神经源性肺水肿和呼吸衰竭、中枢神经系统感染等重症，且部分重症患者病情进展快，甚至死亡。手足口病在我国和世界都有广泛流行，患者主要为学龄前儿童，尤以3岁以下儿童发病率高。与其他肠道病毒引起的手足口病相比，由肠道病毒71型感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病死率也较高。

在国外，20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统感染为主要特征的EV71流行，仅保加利亚就有超过750例病例，149人致瘫，44人死亡。20世纪90年代后期，EV71开始在东亚地区传播。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4-8月共发生2628例病例，仅4-6月就有29例病人死亡。死者平均年龄1.5岁，病程仅2天。

2008年3-5月在安徽省阜阳市出现的EV-71感染暴发流行中，三个月内共出现了69538人的感染，而死亡人数达到了39人。从而引起社会的恐慌。随后该疾病被纳入丙类传染病管理。加强对EV71型感染病患的防控工作，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一。而相关疫苗的研究开发和病毒抗原的快速检测试剂盒是预防控制此传染病的关键。

对EV71型的诊断，目前主要依赖病毒核酸检测和病毒分离培养，而目前基层医院和疾病预防控制中心还没有条件开展，加上部分重症病例临床上并无典型的手足口病表现，所以，在疫情暴发初期重症病例难以明确诊断，常被诊断为肺炎而延误最佳治疗时间。只有结合病例的流行病学调查、临床表现，特别是实验室检测结果，才有可能进行明确诊断。

发明内容

针对EV71型病毒抗原检测存在的上述现状，以及EV71型病毒研究过程中和相关疫苗研制过程中需要对EV71型病毒抗原进行大量检测的需要，本发明利用生物素标记抗EV71型病毒抗体，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，提供一种特异性高、灵敏度高、使用方便、用途广泛的EV71型病毒抗原检测方法，以用于手足口病临床检验诊断、EV71型病毒的鉴别检验、EV71型病毒疫苗的质量检验及质量控制，也可应用于EV71型病毒的其他科研工作。

本发明通过下列技术方案完成：一种EV71型病毒抗原的检测方法，其特征在于经过下列步骤：

A、按50～150μl/孔的量，将待检EV71型病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温0.5-2小时后，洗板3～5次；

B、按50～150μl/孔的量，在A步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶500～3000的生物素标记EV71型抗体，放入湿盒中，于37℃保温0.5～2小时后洗板3～5次；

C、按50～150μl/孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶2000～10000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，放入湿盒中，于37℃保温0.5～2小时后洗板3～5次；

D、在C步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；

E、在D步骤的酶标板的各孔中按50～100μl/孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果。

所述A步骤的酶标板预先经过下列方法处理：

1)酶标板包被：将纯化的EV71-IgG用碳酸盐缓冲液稀释至5-20μg/ml，按50～150μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，2～8℃过夜，洗板3～5次；

2)酶标板封闭：按100～250μl/孔的量加入封闭液，2～8℃过夜，对酶标板进行封闭，洗板3～5次，晾干，冰箱保存备用。

所述1)的碳酸盐缓冲液、2)的封闭液为现有技术中的常规产品。

所述B步骤的生物素标记EV71型抗体经下列方法制备：

a)、按生物素∶EV71型病毒抗体＝1∶5～20克分子比的比例，将生物素用注射用水溶解后，与EV71型病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5～1.0小时，或2～8℃温度下放置1～3小时；

b)、用磷酸缓冲液于2～8℃温度下透析上述a)步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得生物素标记EV71型抗体，-20℃以下保存备用；

c)、将b)步骤的生物素标记EV71型抗体按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得生物素标记EV71型抗体的稀释度为1∶500～3000。

所述a)步骤的生物素、EV71型病毒抗体为市购产品；b)步骤的磷酸缓冲液、甘油，c)步骤的稀释液为常规产品。

所述EV71型病毒抗体经过下列步骤分离纯化∶

1)取市购蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；

2)将市购的抗EV71血清与常规平衡液按1∶1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；

3)用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用常规磷酸缓冲液PBS透析过夜，得EV71型病毒抗体；

4)用lowry法测定蛋白含量，贴签后置-20℃以下保存待用。

所述C步骤的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素为市购产品，将该产品按1∶100、1∶200、1∶400......1∶10000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的稀释度为1∶2000～10000。

所述D步骤的TMB显色液A和B为现有技术的常规用液。

所述待检EV71型病毒抗原经过下列方法获得：

粪便样品的获得

1)采集发病2～3天患者的粪便，每次采集量不少于1克；

2)在采集的1克粪便管内加入2-5ml的磷酸缓冲液PBS，搅拌均匀；

3)4℃，2000-5000转/分，离心15分钟；

4)取离心后上清50-150ul加入到EV71抗原检测试剂盒中进行检测，得待检EV71型病毒抗原；

咽式子样品的获得

1)采集发病2-3天患者的咽式子；

2)在采集的咽式子管内加入0.5-2ml的磷酸缓冲液PBS，搅拌均匀；

3)4℃，2000-5000转/分，离心15分钟；

4)取离心后上清50-150ul加入到EV71抗原检测试剂盒中进行检测，得待检EV71型病毒抗原；

组织培养样品的获得

将经过常规组织培养的EV71型病毒抗原样品，直接加入到EV71抗原检测试剂盒中检测，得待检EV71型病毒抗原。

根据E步骤得到的检测结果进行下列判定：

阳性对照平均A值-阴性对照平均A值≥0.4时，则试验成立，反之应重试。

Cutoff值＝阴性对照的平均A值×2.1(当阴性对照的平均A值大于0.05时，则按实际值计算；当阴性对照的平均A值小于0.05时，则按0.05计算)。

样品A值≥Cutoff值，该样品孔判定为EV71阳性，样品A值＜Cutoff值，该样品孔判定为EV71阴性。

本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，即利用生物素标记的EV71型抗体，以辣根过氧化物酶标记链霉亲和素作放大系统，对EV71型病毒抗原进行检测时，由于一个亲和素分子能与几个生物素分子结合，有效提高了检测灵敏度。且生物素直接标记抗EV71型病毒抗体可减少免疫检测中的步骤，缩短检测时间，从一般细胞培养病变法的3-5天缩短为数小时，并解决了用细胞培养病变法不能测灭活病毒的难题，为疫苗的研发提供了可靠的检测方案。另外，由于辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与普通亲和素不同，其分子量大约为60000，不含碳水化合物，非特异性结合较亲和素低，所以具有提高灵敏度及特异性的效果。本发明所建立的检测方法是一种特异性好、灵敏度高、方便快捷的EV71病毒抗原检测方法。

本发明提供的EV71型病毒抗原检测方法，通过对病人的大便样本或咽式了样本或组织培养样本进行特异性诊断，可以确诊感染的病原体，有利于及时对症进行治疗和对疫情进行预防控制。其应用方便、快捷，能在基层医院开展，便于疾病早期诊断和疫情的控制。本发明的方法在EV71型病毒抗原检测上具有独创性，主要用途是对导致手足口病的EV71病毒抗原进行诊断，填补了我国在手足口病EV71病毒抗原ELISA检测的空白，为相关疫苗的研究开发和临床病患的诊断及卫生管理当局解决、预防、干预此类公共卫生事件提供有力的技术保障。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

一步骤、EV71型病毒抗体的分离纯化

1)取市购蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；

2)将市购的抗EV71血清与常规平衡液按1∶1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；

3)用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用常规磷酸缓冲液(PBS)透析过夜，得EV71型病毒抗体；

4)用lowry法测定蛋白含量，贴签后置-20℃以下保存待用；

二步骤、生物素标记EV71型抗体的制备

1)按生物素∶EV71型病毒抗体＝1∶10克分子比的比例，将市购的生物素与一步骤的EV71型病毒抗体混合，于室温下放置0.5小时；

2)用磷酸缓冲液PBS于5℃温度下透析上述1)步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得生物素标记EV71抗体，-20℃以下保存备用；

3)将2)步骤的生物素标记EV71型抗体按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得生物素标记EV71型抗体的稀释度为1∶500～3000；

三步骤、待检EV71型病毒抗原经过下列方法获得：

1)采集发病3天患者的粪便，采集量为1克；

2)在采集的1克粪便管内加入2.5ml浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液PBS，搅拌均匀；

3)在4℃，3000转/分的条件下，离心分离15分钟；

4)取离心后的上清70ul加入到常规EV71抗原检测试剂盒中进行检测，得待检EV71型病毒抗原；

四步骤、将市购的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素按1∶100、1∶200、1∶400......1∶10000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的稀释度为1∶2000～10000；

五步骤、待检EV71型病毒抗原检测：

1)酶标检测板包被：将一步骤纯化的EV71型病毒抗体(EV71-IgG)用碳酸盐缓冲液稀释至10μg/ml，按100μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，2℃过夜，用PBS洗液在洗板机上洗板5次；

2)酶标检测板封闭：按100μl/孔的量加入封闭液，4℃过夜，对酶标板进行封闭，用磷酸盐缓冲液PBS在洗板机上洗板5次，晾干，冰箱保存备用；

3)先将三步骤4)所得的待检EV71型病毒抗原样品用PBS稀释液进行下列不同稀释度的系列稀释：1∶10、1∶20、1∶40......1∶1280，具体稀释如下：取0.1ml待检EV71型病毒抗原样品，在其中加入0.9mlPBS稀释液，混匀，即成1∶10样品；取0.1ml 1∶10的样品加入0.9mlPBS稀释液即成1∶20样品，如此依次对倍稀释至1∶1280，得待检EV71型病毒抗原使用液；用微量移液器将稀释好的待检EV71型病毒抗原使用液，从高稀释度(1∶1280)开始依次加入酶标板中，100μl/孔，同时在酶标板的另外的孔中加入抗原阳性对照、抗原阴性对照，每个对照各加2孔，并留1孔作为空白调零孔，放入湿盒中，37℃保温1小时，用PBS洗液在洗板机上洗板5次；

4)在上述3)的酶标板的各孔中，加入二步骤所得的稀释度为1∶2000的生物素标记EV71型抗体，100μl/孔，放入湿盒中，37℃保温1小时，用PBS洗液在洗板机上洗板5次；

5)在上述4)的酶标板的各孔中，加入四步骤所得的稀释度为1∶5000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，100μl/孔，放入湿盒中，37℃保温1小时，用PBS洗液在洗板机上洗板5次；

6)在上述酶标板的各孔中分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10分钟；

7)在上述酶标板的各孔中加入终止液，50μl/孔，置于酶标仪在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，结果见表1；

8)结果判定：

阳性对照平均A值(0.983)-阴性对照平均A值(0.050)＝0.933，大于0.4，本次试验成立。

Cutoff值＝0.05×2.1＝0.105，(阴性对照的平均A值等于0.05，按实际值计算)。

按照样品A值≥Cutoff值，该样品判定为EV71阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为EV71阴性样品。则该样品1∶10-1∶640稀释度均为阳性、1∶1280为阴性，故该EV71病毒抗原效价检测为1∶640。

所用溶液如下：

1.0.01mol/L的磷酸盐缓冲液PBS：磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠8g，加注射用水至1000ml。

2.洗液：在1000ml 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液PBS中，加入终浓度为0.05％的吐温20。

3.碳酸缓冲液：无水碳酸钠1.6g，碳酸氢钠2.93g，加注射用水至1000ml。

4.终止液：浓硫酸54ml，加注射用水至500ml。

5.TMB显色液A：TMB 50mg，二甲基亚砜50ml，加注射用水50ml。

6.TMB显色液B：醋酸钠6g，冰醋酸0.2ml，双氧水，2.5ml，加注射用水至500ml。

7.封闭液：1000ml 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液PBS中加入20g牛血清白蛋白，溶解混匀。

表1实施例1的检测A值

	1	2	3	4	5
						A	EV71  -Ag1∶101.069	阳性对照0.995
B	EV71  -Ag1∶200.853	阳性对照0.971
						C	EV71  -Ag1∶400.647	阴性对照0.051
D	EV71  -Ag1∶800.445	阴性对照0.049
						E	EV71  -Ag1∶1600.274
F	EV71  -Ag1∶3200.185
						G	EV71  -Ag1∶6400.123
H	EV71  -Ag1∶12800.089	空白孔0.000

本实施例1的优点；

(1)从检测时间方面分析，本发明检测方法与现行检测方法相比，检测时间由细胞培养分离法的3-5天缩短为3-5小时，且检测范围由细胞培养法的活病毒扩展到灭活病毒，大大增加了检测安全性，无论对操作人员和环境的要求都有更大的实用性。与核酸检测法相比，其在操作简便，对设备、场地、样本的要求明显低于核酸检测法，在基层单位也可推广使用。3种方法比较结果见表2。

(2)EV 71病毒抗原检测方法特异性分析

用本发明检测方法对各型肠道病毒和其他相关病毒进行交叉试验，特异性显示无交叉情况出现，见表3。

表2EV71病毒三种检测方法比较

(3)EV 71病毒抗原检测方法灵敏度分析

本发明使用的纯化EV71抗原，测定蛋白含量为1.0mg/ml，用本发明检测试剂盒检测抗原效价为6400EU/ml，即为156ng/EU，此样品在纯化前为保证生物安全已作病毒灭活，因此，无法用细胞病变法进行检测。而核酸定量也不如本发明方便、快捷和低成本。在活病毒方面，本发明可以检测到500CCID₅₀的病毒量，见表4。

本发明方法专门用于检测EV71病毒抗原，与现行检测法相比，本发明的一个检测亮点就是无论活病毒或灭活病毒都能检测，既能定性又能定量，与现有检测方法相比操作简单、方便，检测成本低，应用范围广。而且所用检测时间短，结果重现性好，在EV71疫苗研究和手足口病研究中有重要的使用价值，同时能应用于临床手足口病的诊断，能在此病的早期发现，早期治疗及传染源控制中发挥重要作用。

表3EV71病毒抗原检测法(ELISA)交叉试验结果

表4本发明与其他检测方法检测效果比较

实施例2

一步骤、EV71型病毒抗体的分离纯化

同实施例1；

二步骤、生物素标记EV71型抗体的制备

1)按生物素∶EV71型病毒抗体＝1∶20克分子比的比例，将市购的生物素与一步骤的EV71型病毒抗体混合，于5℃下放置2小时；

2)用磷酸缓冲液PBS于2℃温度下透析上述1)步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得生物素标记EV71抗体，-20℃以下保存备用；

3)将2)步骤的生物素标记EV71型抗体按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得生物素标记EV71型抗体的稀释度为1∶500～3000；

三步骤、待检EV71型病毒抗原经过下列方法获得：

1)采集发病2天患者的咽式子；

2)在采集的咽式子管内加入1ml的磷酸缓冲液PBS，搅拌均匀；

3)4℃，5000转/分，离心15分钟；

4)取离心后上清150ul加入到EV71抗原检测试剂盒中进行检测，得待检EV71型病毒抗原；

四步骤、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素的稀释同实施例1；

五步骤、待检EV71型病毒抗原检测：

1)酶标检测板包被：将一步骤纯化的EV71型病毒抗体(EV71-IgG)用碳酸盐缓冲液稀释至20μg/ml，按150μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，8℃过夜，用PBS洗液在洗板机上洗板3次；

2)酶标检测板封闭：按250μl/孔的量加入封闭液，8℃过夜，对酶标板进行封闭，用磷酸盐缓冲液PBS在洗板机上洗板3次，晾干，冰箱保存备用；

3)先将三步骤所得的待检EV71型病毒抗原样品用PBS稀释液进行下列不同稀释度的系列稀释：1∶10、1∶20、1∶40......1∶1280，具体稀释如下：取0.1ml待检EV71型病毒抗原样品，在其中加入0.9mlPBS稀释液，混匀，即成1∶10样品；取0.1ml 1∶10的样品加入0.9mlPBS稀释液即成1∶20样品，如此依次对倍稀释至1∶1280，得待检EV71型病毒抗原使用液；用微量移液器将稀释好的待检EV71型病毒抗原使用液，从高稀释度(1∶1280)开始依次加入酶标板中，100μl/孔，同时在酶标板的另外的孔中加入抗原阳性对照、抗原阴性对照，每个对照各加2孔，并留1孔作为空白调零孔，放入湿盒中，37℃保温1小时，用PBS洗液在洗板机上洗板5次；

4)在上述3)的酶标板的各孔中，加入二步骤所得的稀释度为1∶500的生物素标记EV71型抗体，50μl/孔，放入湿盒中，37℃保温2小时，用PBS洗液在洗板机上洗板3次；

5)在上述4)的酶标板的各孔中，加入四步骤所得的稀释度为1∶10000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，50μl/孔，放入湿盒中，37℃保温2小时，用PBS洗液在洗板机上洗板3次；

6)在上述酶标板的各孔中分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温15分钟；

7)在上述酶标板的各孔中加入终止液，100μl/孔，置于酶标仪在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值；

8)结果判定：

阳性对照平均A值(0.983)-阴性对照平均A值(0.050)＝0.933，大于0.4，本次试验成立。

Cutoff值＝0.05×2.1＝0.105，阴性对照的平均A值小于0.05，按0.05计算)。

按照样品A值≥Cutoff值，该样品判定为EV71阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为EV71阴性样品。则该样品1∶10-1∶640稀释度均为阳性、1∶1280为阴性，故该EV71病毒抗原效价检测为1∶640。

所用溶液同实施例1。

实施例3

一步骤、EV71型病毒抗体的分离纯化

同实施例1；

二步骤、生物素标记EV71型抗体的制备

1)按生物素∶EV71型病毒抗体＝1∶5克分子比的比例，将市购的生物素与一步骤的EV71型病毒抗体混合，于8℃下放置1小时；

2)用磷酸缓冲液PBS于8℃温度下透析上述1)步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得生物素标记EV71抗体，-20℃以下保存备用；

3)将2)步骤的生物素标记EV71型抗体按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得生物素标记EV71型抗体的稀释度为1∶500～3000；

三步骤、待检EV71型病毒抗原经过下列方法获得：

1)采集发病3天患者的咽式子；

2)在采集的咽式子管内加入1ml的磷酸缓冲液PBS，搅拌均匀；

3)4℃，2000转/分，离心15分钟；

4)取离心后上清50ul加入到EV71抗原检测试剂盒中进行检测，得待检EV71型病毒抗原；

四步骤、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素的稀释同实施例1；

五步骤、待检EV71型病毒抗原检测：

1)酶标检测板包被：将一步骤纯化的EV71型病毒抗体(EV71-IgG)用碳酸盐缓冲液稀释至5μg/ml，按50μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，2℃过夜，用PBS洗液在洗板机上洗板4次；

2)酶标检测板封闭：按150μl/孔的量加入封闭液，2℃过夜，对酶标板进行封闭，用磷酸盐缓冲液PBS在洗板机上洗板4次，晾干，冰箱保存备用；

3)先将三步骤所得的待检EV71型病毒抗原样品用PBS稀释液进行下列不同稀释度的系列稀释：1∶10、1∶20、1∶40......1∶1280，具体稀释如下：取0.1ml待检EV71型病毒抗原样品，在其中加入0.9mlPBS稀释液，混匀，即成1∶10样品；取0.1ml 1∶10的样品加入0.9mlPBS稀释液即成1∶20样品，如此依次对倍稀释至1∶1280，得待检EV71型病毒抗原使用液；用微量移液器将稀释好的待检EV71型病毒抗原使用液，从高稀释度(1∶1280)开始依次加入酶标板中，100μl/孔，同时在酶标板的另外的孔中加入抗原阳性对照、抗原阴性对照，每个对照各加2孔，并留1孔作为空白调零孔，放入湿盒中，37℃保温2小时，用PBS洗液在洗板机上洗板4次；

4)在上述3)的酶标板的各孔中，加入二步骤所得的稀释度为1∶1000的生物素标记EV71型抗体，70μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用PBS洗液在洗板机上洗板4次；

5)在上述4)的酶标板的各孔中，加入四步骤所得的稀释度为1∶2000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，70μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用PBS洗液在洗板机上洗板4次；

6)在上述酶标板的各孔中分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温12分钟；

7)在上述酶标板的各孔中加入终止液，70μl/孔，置于酶标仪在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值；

8)结果判定：

阳性对照平均A值(0.983)-阴性对照平均A值(0.050)＝0.933，大于0.4，本次试验成立。

Cutoff值＝0.05×2.1＝0.105，(阴性对照的平均A值等于0.05，按实际值计算)。

按照样品A值≥Cutoff值，该样品判定为EV71阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为EV71阴性样品。则该样品1∶10-1∶640稀释度均为阳性、1∶1280为阴性，故该EV71病毒抗原效价检测为1∶320。

所用溶液同实施例1。

实施例4

一步骤、EV71型病毒抗体的分离纯化

同实施例1；

二步骤、生物素标记EV71型抗体的制备

同实施例1；

三步骤、待检EV71型病毒抗原经过下列方法获得：

1)采集发病3天患者的咽式子；

2)在采集的咽式子管内加入1ml的磷酸缓冲液PBS，搅拌均匀；

3)4℃，2000转/分，离心15分钟；

4)取离心后上清50ul加入到EV71抗原检测试剂盒中进行检测，得待检EV71型病毒抗原；

四步骤、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素的稀释

同实施例1；

五步骤、待检EV71型病毒抗原检测：

1)酶标检测板包被：将一步骤纯化的EV71型病毒抗体(EV71-IgG)用碳酸盐缓冲液稀释至5μg/ml，按50μl/孔的量加入到聚苯乙烯板中，2℃过夜，用PBS洗液在洗板机上洗板4次；

2)酶标检测板封闭：按150μl/孔的量加入封闭液，2℃过夜，对酶标板进行封闭，用磷酸盐缓冲液PBS在洗板机上洗板4次，晾干，冰箱保存备用；

3)先将三步骤所得的待检EV71型病毒抗原样品用微量移液器加入酶标板中，100μl/孔，同时在酶标板的另外的孔中加入抗原阳性对照、抗原阴性对照，每个对照各加2孔，并留1孔作为空白调零孔，放入湿盒中，37℃保温2小时，用PBS洗液在洗板机上洗板4次；

4)在上述3)的酶标板的各孔中，加入二步骤所得的稀释度为1∶1000的生物素标记EV71型抗体，70μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用PBS洗液在洗板机上洗板4次；

5)在上述4)的酶标板的各孔中，加入四步骤所得的稀释度为1∶2000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，70μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用PBS洗液在洗板机上洗板4次；

6)在上述酶标板的各孔中分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温12分钟；

7)在上述酶标板的各孔中加入终止液，70μl/孔，置于酶标仪在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值；

表2实施例4的检测A信

	1	2	3	4	5
						A	EV71  -Ag0.569
B	阳性对昭1.295
						C	阳性对昭1.171
D	阴性对昭0.072
						E	阴性对昭0.058
F
						G
H	空白孔0.000

8)结果判定：

阳性对照平均A值(1.233)-阴性对照平均A值(0.060)＝1.173，大于0.4，本次试验成立。

Cutoff值＝0.06×2.1＝0.126，(阴性对照的平均A值等于0.06，按实际值计算)。

按照样品A值≥Cutoff值，该样品判定为EV71阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为EV71阴性样品。则该样品A＝0.569＞0.126，为阳性。

所用溶液同实施例1。

Claims (5)

1、一种EV71型病毒抗原的检测方法，其特征在于经过下列步骤：

A、按50～150μl/孔的量，将待检EV71型病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的孔中，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温0.5-2小时后，洗板3～5次；

B、按50～150μl/孔的量，在A步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶500～3000的生物素标记EV71型抗体，放入湿盒中，于37℃保温0.5～2小时后洗板3～5次；

C、按50～150μl/孔的量，在B步骤的酶标板的各孔中，加入稀释度为1∶2000～10000的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，放入湿盒中，于37℃保温0.5～2小时后洗板3～5次；

D、在C步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和B各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；

E、在D步骤的酶标板的各孔中按50～100μl/孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得检测结果。

2、如权利要求1所述的EV71型病毒抗原的检测方法，其特征在于所述B步骤的生物素标记EV71型抗体经下列方法制备：

a)、按生物素∶EV71型病毒抗体＝1∶5～20克分子比的比例，将生物素用注射用水溶解后，与EV71型病毒抗体混合，得混合体，于室温下放置0.5～1.0小时，或2～8℃温度下放置1～3小时；

b)、用磷酸缓冲液于2～8℃温度下透析上述a)步骤的混合体并过夜，加等体积甘油混匀，得生物素标记EV71型抗体，-20℃以下保存备用；

c)、将b)步骤的生物素标记EV71型抗体按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得生物素标记EV71型抗体的稀释度为1∶500～3000。

3、如权利要求2所述的EV71型病毒抗原的检测方法，其特征在于所述EV71型病毒抗体经过下列步骤分离纯化：

1)取市购蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；

2)将市购的抗EV71血清与常规平衡液按1∶1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；

3)用10倍柱体积的常规洗脱液将目的蛋白从亲和柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用常规磷酸缓冲液(PBS)透析过夜，得EV71型病毒抗体；

4)用lowry法测定蛋白含量，贴签后置-20℃以下保存待用。

4、如权利要求1所述的EV71型病毒抗原的检测方法，其特征在于所述C步骤的辣根过氧化物酶标记链霉亲和素为市购产品，将该产品按1∶100、1∶200、1∶400......1∶5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素的稀释度为1∶2000～10000。

5、如权利要求1所述的EV71型病毒抗原的检测方法，其特征在于所述待检EV71型病毒抗原经过下列方法获得：

粪便样品的获得

1)采集发病2～3天患者的粪便，每次采集量不少于1克；

2)在采集的1克粪便管内加入2-5ml的磷酸缓冲液(PBS)，搅拌均匀；

3)4℃，2000-5000转/分，离心15分钟；

4)取离心后上清50-150ul加入到EV71抗原检测试剂盒中进行检测，得待检EV71型病毒抗原；

咽式子样品的获得

1)采集发病2-3天患者的咽式子；

2)在采集的咽式子管内加入0.5-2ml的磷酸缓冲液(PBS)，搅拌均匀；

3)4℃，2000-5000转/分，离心15分钟；

4)取离心后上清50-150ul加入到EV71抗原检测试剂盒中进行检测，得待检EV71型病毒抗原；

组织培养样品的获得

将经常规组织培养的EV71型病毒抗原样品，直接加入到EV71抗原检测试剂盒中检测，得待检EV71型病毒抗原。