CN105759033A - 一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法 - Google Patents

一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105759033A
CN105759033A CN201610187673.1A CN201610187673A CN105759033A CN 105759033 A CN105759033 A CN 105759033A CN 201610187673 A CN201610187673 A CN 201610187673A CN 105759033 A CN105759033 A CN 105759033A
Authority
CN
China
Prior art keywords
coxa16
antibody
sample
virus
checked
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610187673.1A
Other languages
English (en)
Inventor
谢忠平
李华
龙润乡
刘正玲
杨婷
罗芳宇
谢天宏
宋霞
杨蓉
岳磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Original Assignee
Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC filed Critical Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority to CN201610187673.1A priority Critical patent/CN105759033A/zh
Publication of CN105759033A publication Critical patent/CN105759033A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法，将待检COX A16或/和EV71病毒抗原、抗原阳性对照和抗原阴性对照分别加入酶标板的检测孔中，再在酶标板的其他孔加入辣根过氧化物酶标记的Cox A16抗体/EV71抗体，TMB显色液A和B，最后在酶标板的各孔中加入终止液后，用酶标仪上检测吸光度A值，所得检测结果对照情形判定。本发明特异性好、灵敏度高、方便快捷，适用于Cox A16及EV71病毒抗原两用。本发明可从一般细胞培养病变法的3～5天缩短为数小时，在较短时间内确诊患者感染的病原体，且在基层医院和疾控中心就可完成检测，能及时对症治疗和对疫情进行预防控制，是一种特异性好、灵敏度高、方便快捷的Cox A16/EV71病毒抗原检测方法。

Description

一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法
技术领域
本发明涉及一种CoxA16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法，属于生物学技术领域。
背景技术
手足口病（Hand-foot-mouthdisease，HFMD）是一长期而且普遍流行于婴幼儿及学龄前儿童群体中的病毒性传染病，通常在大多数患者个体所表现的临床症状并不十分严重，主要为轻微的感冒症状，并伴有手掌、足心及口腔粘膜的疱疹，其病程通常局限于7～10天内。但近年以来的报导表明，该类病毒的感染可以伴随许多重症表现，主要为神经系统及呼吸系统的严重病变，并可能由于呼吸系统的衰竭而引发患者的死亡。更为严重的是，这样的重症病变多发于婴幼儿。报告病例男女性别比为1.82，主要以婴幼儿为主，5岁及以下病例占93.09%，3岁及以下病例占74.66%，其中2岁组发病最高。因此，该类病毒的感染日益明显地呈现出了特殊的公共卫生意义。
引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中以肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）最为常见。由EV71感染及CoxA16感染引起的大流行交替出现，成为手足口病的主要病原体。与其他肠道病毒引起的手足口病相比，EV71感染除了引起典型的HFMD症状以外，还能够引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹、神经源性肺水肿等多种与神经系统相关的疾病，发生重症感染的比例较大，病死率也较高。2009年手足口病确诊普通型病例中EV71感染占40.63%，CoxA16感染占37.55%，两者没有明显差别；但在重症病例及死亡病例中，由EV71病毒感染引起的分别为80.60%及92.80%，占绝对优势；全国2008～2011共4年的统计数据及部分省市的统计数据也表明：EV71及CoxA16是手足口病的主要病原体，在重病及死亡病例中，EV71占绝对优势。
由于HFMD具有传播迅速，易在群体中引起大规模的暴发流行，以及针对低龄儿童的特点，因此，尽管出现重症病人的比例在1%以内，但其绝对数量仍然十分众多。手足口病自2008年卫生部已将其纳入丙类传染病管理至2014年底，发病率及病死率一直居丙类传染病之首，累计发病908万例、死亡2720人，分别占丙类传染病发病及死亡人数的51.54%及89.33%。
对手足口病主要的病原体CoxA16及EV71检测诊断，目前主要依赖病毒核酸检测和病毒分离培养，而目前基层医院和疾病预防控制中心还没有条件开展，加上部分重症病例临床上并无典型的手足口病表现，所以，在疫情暴发初期重症病例难以明确诊断，常被诊断为肺炎而延误最佳治疗时间。只有结合病例的流行病学调查、临床表现，特别是实验室检测结果，才有可能进行明确诊断。
加强对COXA16型及EV71感染病患的防控工作，已成为我国病毒性传染病管理工作的目标之一，而相关疫苗的研究开发和病毒抗原的快速检测是预防控制此传染病的关键。
发明内容
针对CoxA16及EV71病毒抗原检测存在的上述现状，以及CoxA16型病毒研究过程中和相关疫苗研制过程中需要对CoxA16型病毒抗原进行大量检测的需要，本发明提供一种CoxA16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法，利用辣根过氧化物酶分别标记抗CoxA16型病毒抗体及EV71抗体，建立双抗体夹心法，提供一种可同时检测CoxA16及EV71两种病毒抗原的特异性高、灵敏度高、使用方便、用途广泛的检测方法，以用于手足口病临床检验诊断、CoxA16及EV71病毒的鉴别检验，也可用于COXA16及EV71病毒疫苗的质量检验及质量控制。
本发明通过下列技术方案完成：一种CoxA16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法，其特征在于经过下列步骤：
A、将待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品加入酶标板的孔中，再在该酶标版上分别设置CoxA16和/或EV71抗原阳性对照孔和PBS阴性对照孔，控制50～100μL/孔的加入量，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～2小时后，弃孔中样品，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
B、按50～100μL/孔的量，在A步骤的酶标板各孔中，加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体（CoxA16-IgG-HRP）和/或EV71抗体（EV71-IgG-HRP），标记抗体决定了检测的目的病毒抗原及其特异性，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后，弃孔中样品，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
C、在B步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和TMB显色液B各50μL/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；
D、在C步骤的酶标板的各孔中按50～100μL/孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，以空白孔调零检测吸光度A值，即得检测结果，并进行下列判定：
阳性对照平均A值-阴性对照平均A值≥0.4时，则试验成立，反之应重试；
Cutoff值=阴性对照的平均A值×2.1；当阴性对照的平均A值≥0.05时，则按实际值计算；当阴性对照的平均A值＜0.05时，则按0.05计算；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品的A值≥Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品判定为阳性，待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品A值＜Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品判定为阴性；
进一步地，对照下列情形判定：
a、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体（CoxA16-IgG-HRP）的，该孔为阳性，判定为CoxA16感染或鉴别为CoxA16病毒；该孔为阴性，判定为非CoxA16感染或鉴别为非CoxA16病毒；
b、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的EV71抗体（EV71-IgG-HRP）的，该孔为阳性，判定为EV71感染或鉴别为EV71病毒；该孔为阴性，判定为非EV71感染或鉴别为非EV71病毒；
c、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体（CoxA16-IgG-HRP）的，以及待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的EV71抗体（EV71-IgG-HRP）的，两种孔均为阳性，判定为CoxA16及EV71混合感染或鉴别为CoxA16、EV71混合病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体（CoxA16-IgG-HRP）的，以及待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的EV71抗体（EV71-IgG-HRP）的，两种孔均为阴性，判定为非CoxA16、非EV71感染或鉴别为非CoxA16、非EV71病毒。
所述步骤A中的待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品是经过下列方法获得：
通过粪便样品获得：
采集手足口病发病2～3天患者的粪便，每次采集量不少于1克；在采集的粪便内按每克粪便加入2～5mL的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀；再在4℃下，以2000～5000转/分离心15分钟；然后取离心后上清液50～150ul，即得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品；
或者通过咽式子及肛试子样品获得：
采集手足口病发病2～3天患者的咽式子或肛试子；每份咽式子或肛试子加入2～3mL磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，接种于敏感细胞培养（如RD细胞、Vero细胞等），经过常规细胞培养分离能使细胞感染、产生细胞病变的可疑病毒阳性样品，即得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品。
所述B步骤的辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体是经下列方法制备：
①取市购蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟后，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；
②将抗CoxA16血清或抗EV71血清与平衡液按1:1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；
③用10倍柱体积的洗脱液将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱液，用磷酸盐缓冲液透析过夜，得到COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体；用lowry法测定COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体中的蛋白含量，贴签后置于-20℃以下保存待用；这是因为在进行检测试剂的检测制备时，先进行抗体包被，而包被的量是以蛋白量来标化的，所以需准确检测出其蛋白含量；
④按辣根过氧化物酶:CoxA16病毒抗体或EV71病毒抗体＝1:1～1:2克分子比，将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后，按每1mg辣根过氧化物酶加入0.5mLNaIO4，于4℃下放置30min，加入0.5mL乙二醇溶液，于4℃下放置30min，再与步骤③所得CoxA16病毒抗体或EV71病毒抗体混合，得混合体，经磷酸盐缓冲液透析过夜；再加硼氢化钠0.2mL，于4℃下放置30min，加等体积饱和硫酸铵，于4℃下放置30min，以3000rpm离心30min；然后用磷酸盐缓冲液溶解，并在磷酸盐缓冲液中透析过夜；加等体积甘油混匀后，得到标记的CoxA16抗体或EV71抗体，于-60℃以下保存备用；
⑤将步骤④标记的CoxA16抗体或EV71抗体用磷酸盐缓冲液稀释至稀释度为1:（2000～10000），即得到辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体。这是通过将辣根过氧化物酶标记的CoxA16或EV71抗体按1:100、1:200、1:400……1:5000的稀释度进行稀释，用常规棋盘法试验确定它们的最佳使用稀释度，得出辣根过氧化物酶标记的CoxA16或EV71抗体的最佳稀释度为1:500～3000。
所述步骤①、②、③的平衡液为磷酸盐缓冲液。
所述步骤③的洗脱液为pH=2.67、0.1mol/L的Gly-HCl缓冲液。
所述A步骤的酶标板经过下列方法处理得到：
（1）包被：依据步骤③所测COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体中的蛋白含量，将步骤③所得COXA16病毒抗体用碳酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，将步骤③所得EV71病毒抗体用碳酸盐缓冲液稀释至5～10μg/mL，然后将两种病毒抗体的稀释液按1:1的体积比混合后，以100～150μL/孔的量加入到聚苯乙烯板中，于2～8℃过夜，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
（2）封闭：按100～250μL/孔的量加入封闭液，于2～8℃过夜，对酶标板进行封闭，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次，自然晾干或真空包装后置于-20℃以下保存备用，即得到酶标板。
所述步骤（1）的碳酸盐缓冲液为无水碳酸钠1.6g和碳酸氢钠2.93g加入注射用水至1000mL制得。
所述步骤（2）的封闭液是以1000mL浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液加入20g牛血清白蛋白溶解混匀后制得。
所述步骤A的分别设置CoxA16和/或EV71抗原阳性对照孔和PBS阴性对照孔，具体是按下列方式设置：
对于需检测CoxA16病毒的，则在酶标版的空孔中分别加入CoxA16病毒抗原阳性对照样和PBS阴性对照样，各平行2孔；
对于需检测EV71病毒的，则在酶标版的空孔中分别加入EV71病毒抗原阳性对照样和PBS阴性对照样，各平行2孔；
对于需同时检测CoxA16病毒和EV71病毒的，则在酶标版的空孔中分别加入CoxA16抗原阳性对照样、EV71抗原阳性对照样和PBS阴性对照样，各平行2孔。
所述步骤C的TMB显色液A是以TMB50mg和二甲基亚砜50mL混合后，加注射用水50mL制得。
所述步骤C的TMB显色液B是以醋酸钠6g、冰醋酸0.2mL和双氧水2.5mL混合后，加注射用水至500mL制得。
所述步骤D的终止液是2mmol/L的硫酸溶液，以浓硫酸54mL加注射用水至500mL制得。
所述磷酸盐缓冲液为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，即以磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.2g和氯化钠8g加入注射用水至1000mL制得。
所述CoxA16抗原阳性对照样、EV71抗原阳性对照样、抗CoxA16血清和抗EV71血清均通过常规方法制得。
本发明具有下列优点和效果：本发明通过对手足口病人的大便样本、咽式了及肛试子样本进行特异性检测，可以确诊感染的病原体，有利于及时对症进行治疗和对疫情进行预防控制；也可以用于细胞培养分离样本的鉴别检测，明确所分离的病毒是CoxA16病毒还是EV71病毒，在手足口的临床诊断及流行病学的病原体鉴别诊断上发挥重要作用；此外，本发明提供的CoxA16及EV71病毒抗原联合检测方法，还可以用于CoxA16灭活疫苗、EV71灭活疫苗及CoxA16-EV71联合疫苗的抗原含量检测，为疫苗的质量控制提供技术方法。采用上述方案，即利用辣根过氧化物酶标记的CoxA16和/或EV71抗体，对CoxA16和/或EV71病毒抗原进行检测时，由于检测板上同时包被有CoxA16抗体及EV71抗体，且包被抗体的含量配比在保证相应灵敏度的同时，可以有效地避免CoxA16及EV71抗原之间的交叉反应，从而保证了检测的特异性，达到了一个试剂盒检测两个抗原的双重目的。它可以单独用于检测CoxA16样品检测，也可单独用于EV71样品检测，或者对CoxA16样品及EV71样品同时进行检测。本发明所建立的检测方法是一种特异性好、灵敏度高、方便快捷的CoxA16及EV71病毒抗原两用检测方法。
本发明的方法在CoxA16及EV71病毒抗原联合检测上具有独创性，同时具有灵敏、特异、方便、快捷的特点，填补了我国在手足口病COXA16及EV71病毒抗原ELISA检测的空白，为相关疫苗的研究开发和临床病患的诊断及卫生管理当局解决、预防、干预此类公共卫生事件提供有力的技术保障。
本发明的方法使检测板实现一板两用，既可用于CoxA16样品的检测，也可用于EV71样品的检测，使用方便、高效。适用于手足口病临床采集的大便样品、咽试子样品、肛试子样品及疱疹液等样品的检测，为临床诊断提供实验室依据；也可用于细胞培养分离到的病毒鉴别检测，为流行病学研究提供重要技术方法，其灵敏度与核酸检测方法相当，且特异高于核酸检测方法。
本发明可从一般细胞培养病变法的3～5天缩短为数小时，在较短时间内确诊患者感染的病原体，且在基层医院和疾控中心就可完成检测，能及时对症治疗和对疫情进行预防控制，是一种特异性好、灵敏度高、方便快捷的CoxA16/EV71病毒抗原检测方法。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
以下所用磷酸盐缓冲液为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，即以磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.2g和氯化钠8g加入注射用水至1000mL制得。
CoxA16病毒抗原的鉴别检测，经过下列步骤：
步骤一、制备辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体：
①取市购蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟后，用5倍柱体积的平衡液（磷酸盐缓冲液）对层析柱进行平衡；
②将抗CoxA16血清或抗EV71血清与平衡液（磷酸盐缓冲液）按1:1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液（磷酸盐缓冲液）洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；
③用10倍柱体积的洗脱液（pH=2.67、0.1mol/L的Gly-HCl缓冲液）将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱液，用磷酸盐缓冲液透析过夜，得到COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体；用lowry法测定COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体中的蛋白含量，贴签后置于-20℃以下保存待用；
④按辣根过氧化物酶：CoxA16病毒抗体或EV71病毒抗体＝1:1克分子比，将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后，按每1mg辣根过氧化物酶加入0.5mLNaIO4，于4℃下放置30min，加入0.5mL乙二醇溶液，于4℃下放置30min，再与步骤③所得CoxA16病毒抗体或EV71病毒抗体混合，得混合体，经磷酸盐缓冲液透析过夜；再加硼氢化钠0.2mL，于4℃下放置30min，加等体积饱和硫酸铵，于4℃下放置30min，以3000rpm离心30min；然后用磷酸盐缓冲液溶解，并在磷酸盐缓冲液中透析过夜；加等体积甘油后混匀，得到标记的CoxA16抗体或EV71抗体，于-60℃以下保存备用；
⑤将步骤④标记的CoxA16抗体或EV71抗体用磷酸盐缓冲液稀释至稀释度为1:2000，即得到辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体。
步骤二、处理酶标板：
（1）包被：依据步骤③所测COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体中的蛋白含量，将步骤③所得COXA16病毒抗体用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/mL，将步骤③所得EV71病毒抗体用碳酸盐缓冲液稀释至5μg/mL，然后将两种病毒抗体的稀释液按1:1的体积比混合后，以100μL/孔的量加入到聚苯乙烯板中，于2～8℃过夜，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
其中，碳酸盐缓冲液为无水碳酸钠1.6g和碳酸氢钠2.93g加入注射用水至1000mL制得；
（2）封闭：按100μL/孔的量加入封闭液（以1000mL浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液加入20g牛血清白蛋白溶解混匀后制得），于2～8℃过夜，对酶标板进行封闭，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次，自然晾干或真空包装后置于-20℃以下保存备用，即得到酶标板。
步骤三、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品的获得：
采集手足口病发病2～3天患者的粪便，每次采集量不少于1克；在采集的粪便内按每克粪便加入2～5mL的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀；再在4℃下，以2000～5000转/分离心15分钟；然后取离心后上清液50～150ul，即得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品。
步骤四、将步骤三所得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品（3个样品）以50μL/孔的加入量加入步骤二所得酶标板的孔中，再以50μL/孔的加入量在该酶标版的其他孔上分别加入CoxA16抗原阳性对照样和PBS阴性对照样，各平行2孔；
并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～2小时后，弃孔中样品，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
步骤五、按50μL/孔的量，在步骤四的酶标板各孔中，加入步骤一所得辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体（CoxA16-IgG-HRP），标记抗体决定了检测的目的病毒抗原及其特异性，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后，弃孔中样品，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
步骤六、在步骤四的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和TMB显色液B各50μL/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；
其中，TMB显色液A是以TMB50mg和二甲基亚砜50mL混合后，加注射用水50mL制得；TMB显色液B是以醋酸钠6g、冰醋酸0.2mL和双氧水2.5mL混合后，加注射用水至500mL制得；
步骤七、在步骤六的酶标板的各孔中按50μL/孔的量加入终止液（2mmol/L的硫酸溶液，即以浓硫酸54mL加注射用水至500mL制得）后置于酶标仪上，在450nm波长下，以空白孔调零检测吸光度A值，即得检测结果，如下表：
并进行下列判定：
阳性对照平均A值1.074-阴性对照平均A值0.05=1.024，大于0.4，试验成立；
Cutoff值=阴性对照的平均A值0.05×2.1=0.105；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1的A值=1.069≥Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1判定为阳性；判定为CoxA16感染或鉴别为CoxA16病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品2的A值=1.469≥Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品2判定为阳性；判定为CoxA16感染或鉴别为CoxA16病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品3的A值=0.056＜Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品3判定为阴性；判定为非CoxA16感染或鉴别为非CoxA16病毒。
实施例2
EV71病毒抗原的鉴别检测，经过下列步骤：
同实施例1，仅步骤四的CoxA16抗原阳性对照样替换为EV71抗原阳性对照样，步骤五的辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体（CoxA16-IgG-HRP）替换为辣根过氧化物酶标记的EV71抗体（EV71-IgG-HRP）。
检测结果，如下表：
并进行下列判定：
阳性对照平均A值0.983-阴性对照平均A值0.05=0.933，大于0.4，试验成立；
Cutoff值=阴性对照的平均A值0.05×2.1=0.105；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1的A值=0.553≥Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1判定为阳性；判定为EV71感染或鉴别为EV71病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品2的A值=0.078＜Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品3判定为阴性；判定为非EV71感染或鉴别为非EV71病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品3的A值=0.043＜Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品3判定为阴性；判定为非EV71感染或鉴别为非EV71病毒。
实施例1和2的优点：
（1）从检测时间方面分析，本发明检测方法与现行检测方法相比，检测时间由细胞培养分离法的3～5天缩短为3～5小时，且检测范围由细胞培养法的活病毒扩展到灭活病毒，大大增加了检测安全性，无论对操作人员和环境的要求都有更大的实用性。与核酸检测法相比，其在操作简便，对设备、场地、样本的要求明显低于核酸检测法，在基层单位也可推广使用。
（2）一个检测板可以对至少44份样品、同时进行了CoxA16及EV71两个病毒进行了检测或鉴别试验，方便、快捷、灵敏、特异。
实施例3
以下所用磷酸盐缓冲液为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，即以磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.2g和氯化钠8g加入注射用水至1000mL制得。
CoxA16及EV71病毒抗原的鉴别检测，经过下列步骤：
步骤一、同实施例1；仅步骤⑤：将步骤④标记的CoxA16抗体或EV71抗体用磷酸盐缓冲液稀释至稀释度为1:5000；
步骤二、同实施例1；
步骤三、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品的获得：
采集手足口病发病2～3天患者的咽式子或肛试子；每份咽式子或肛试子加入2～3mL磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，接种于敏感细胞培养（如RD细胞、Vero细胞等），经过常规细胞培养分离能使细胞感染、产生细胞病变的可疑病毒阳性样品，即得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品。
步骤四、将步骤三所得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品用磷酸盐缓冲液（PBS）作为稀释液进行下列不同稀释度的系列稀释：1:10、1:20、1:40......1:1280，具体稀释如下：取0.1mL待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品，在其中加入0.9mL稀释液，混匀，即成1:10样品；取0.1mL1:10的样品加入0.1mL稀释液即成1:20样品，如此依次对倍稀释至1:1280，得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原使用液；用微量移液器将稀释好的待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原使用液，从高稀释度（1:1280）开始依次加入酶标板中，100μL/孔；再以50～100μL/孔的加入量在该酶标版上分别设置CoxA16和/或EV71抗原阳性对照孔和PBS阴性对照孔，具体是在酶标版的空孔中分别加入CoxA16抗原阳性对照样、EV71抗原阳性对照样和PBS阴性对照样，各平行2孔；
并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～2小时后，弃孔中样品，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
步骤五、按100μL/孔的量，在步骤四的酶标板各孔中，加入步骤一所得辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体（CoxA16-IgG-HRP）和EV71抗体（EV71-IgG-HRP）（即病毒抗原使用液孔、抗原阳性对照孔和PBS阴性对照孔均对半分开后分别加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体和EV71抗体，空白调零孔任意加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体），放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后，弃孔中样品，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
步骤六、在步骤四的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和TMB显色液B各50μL/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；
其中，TMB显色液A是以TMB50mg和二甲基亚砜50mL混合后，加注射用水50mL制得；TMB显色液B是以醋酸钠6g、冰醋酸0.2mL和双氧水2.5mL混合后，加注射用水至500mL制得；
步骤七、在步骤六的酶标板的各孔中按100μL/孔的量加入终止液（2mmol/L的硫酸溶液，即以浓硫酸54mL加注射用水至500mL制得）后置于酶标仪上，在450nm波长下，以空白孔调零检测吸光度A值，即得检测结果，见下表：
并进行下列判定：
C0xA16阳性对照平均A值1.074-阴性对照平均A值0.05=1.024，大于0.4，试验成立；
EV71阳性对照平均A值0.983-阴性对照平均A值0.05=0.933，大于0.4，试验成立；
Cutoff值=阴性对照的平均A值×2.1=0.05×2.1=0.105；按照样品A值≥Cutoff值，该样品判定为阳性样品原则：
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品（加入CoxA16-IgG-HRP)，1:80稀释度A值=0.154>Cutoff值，该样品为CoxA16病毒，其抗原滴度为1:80（800EU/mL)。
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品（加入EV71-IgG-HRP)，1:320稀释度A值=0.109>Cutoff值，该样品为EV71病毒，其抗原滴度为1:320（3200EU/mL)。
实施例4
以下所用磷酸盐缓冲液为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，即以磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.2g和氯化钠8g加入注射用水至1000mL制得。
CoxA16及EV71病毒抗原的鉴别检测，经过下列步骤：
步骤一、制备辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体：
①取市购蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟后，用5倍柱体积的平衡液（磷酸盐缓冲液）对层析柱进行平衡；
②将抗CoxA16血清或抗EV71血清与平衡液（磷酸盐缓冲液）按1:1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液（磷酸盐缓冲液）洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；
③用10倍柱体积的洗脱液（pH=2.67、0.1mol/L的Gly-HCl缓冲液）将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱液，用磷酸盐缓冲液透析过夜，得到COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体；用lowry法测定COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体中的蛋白含量，贴签后置于-20℃以下保存待用；
④按辣根过氧化物酶:CoxA16病毒抗体或EV71病毒抗体＝1:2克分子比，将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后，按每1mg辣根过氧化物酶加入0.5mLNaIO4，于4℃下放置30min，加入0.5mL乙二醇溶液，于4℃下放置30min，再与步骤③所得CoxA16病毒抗体或EV71病毒抗体混合，得混合体，经磷酸盐缓冲液透析过夜；再加硼氢化钠0.2mL，于4℃下放置30min，加等体积饱和硫酸铵，于4℃下放置30min，以3000rpm离心30min；然后用磷酸盐缓冲液溶解，并在磷酸盐缓冲液中透析过夜；加等体积甘油后混匀，得到标记的CoxA16抗体或EV71抗体，于-60℃以下保存备用；
⑤将步骤④标记的CoxA16抗体或EV71抗体用磷酸盐缓冲液稀释至稀释度为1:10000，即得到辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体。
步骤二、处理酶标板：
（1）包被：依据步骤③所测COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体中的蛋白含量，将步骤③所得COXA16病毒抗体用碳酸盐缓冲液稀释至5μg/mL，将步骤③所得EV71病毒抗体用碳酸盐缓冲液稀释至10μg/mL，然后将两种病毒抗体的稀释液按1:1的体积比混合后，以150μL/孔的量加入到聚苯乙烯板中，于2～8℃过夜，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
其中，碳酸盐缓冲液为无水碳酸钠1.6g和碳酸氢钠2.93g加入注射用水至1000mL制得；
（2）封闭：按250μL/孔的量加入封闭液（以1000mL浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液加入20g牛血清白蛋白溶解混匀后制得），于2～8℃过夜，对酶标板进行封闭，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次，自然晾干或真空包装后置于-20℃以下保存备用，即得到酶标板。
步骤三、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品的获得：
采集手足口病发病2～3天患者的咽式子或肛试子；每份咽式子或肛试子加入2～3mL磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，接种于敏感细胞培养（如RD细胞、Vero细胞等），经过常规细胞培养分离能使细胞感染、产生细胞病变的可疑病毒阳性样品，即得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品。
步骤四、将步骤三所得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品以50～100μL/孔的加入量加入步骤二所得酶标板的孔中，再以50～100μL/孔的加入量在酶标版的空孔中分别加入CoxA16抗原阳性对照样、EV71抗原阳性对照样和PBS阴性对照样，各平行2孔；
并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～2小时后，弃孔中样品，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
步骤五、按100μL/孔的量，在步骤四的酶标板各孔中，加入步骤一所得辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体（CoxA16-IgG-HRP）或EV71抗体（EV71-IgG-HRP），标记抗体决定了检测的目的病毒抗原及其特异性（即病毒抗原使用液孔、抗原阳性对照孔和PBS阴性对照孔均对半分开后分别加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体和EV71抗体，空白调零孔任意加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体），放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后，弃孔中样品，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
步骤六、在步骤四的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和TMB显色液B各50μL/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；
其中，TMB显色液A是以TMB50mg和二甲基亚砜50mL混合后，加注射用水50mL制得；TMB显色液B是以醋酸钠6g、冰醋酸0.2mL和双氧水2.5mL混合后，加注射用水至500mL制得；
步骤七、在步骤六的酶标板的各孔中按100μL/孔的量加入终止液（2mmol/L的硫酸溶液，即以浓硫酸54mL加注射用水至500mL制得）后置于酶标仪上，在450nm波长下，以空白孔调零检测吸光度A值，即得检测结果，见下表：
并进行下列判定：
CoxA16阳性对照平均A值1.074-阴性对照平均A值0.05=1.024≥0.4时，试验成立；
EV71阳性对照平均A值0.983-阴性对照平均A值0.05=0.933≥0.4时，试验成立；
Cutoff值=阴性对照的平均A值0.05×2.1=0.105；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1（加入CoxA16-IgG-HRP）的A值2.069≥Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1（加入CoxA16-IgG-HRP）判定为阳性；判定为CoxA16感染或鉴别为CoxA16病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1（加入EV71-IgG-HRP）的A值0.072＜Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1（加入EV71-IgG-HRP）判定为阴性；判定为非EV71感染或鉴别为非EV71病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品2（加入CoxA16-IgG-HRP）的A值0.069＜Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1（加入CoxA16-IgG-HRP）判定为阴性；判定为非CoxA16感染或鉴别为非CoxA16病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品2（加入EV71-IgG-HRP）的A值1.568≥Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品1（加入EV71-IgG-HRP）判定为阳性；判定为EV71感染或鉴别为EV71病毒。
因此，待检样品1鉴别为CoxA16感染；待检样品2鉴别为EV71感染。

Claims (10)

1.一种CoxA16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法，其特征在于经过下列步骤：
A、将待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品加入酶标板的孔中，再在该酶标版上分别设置CoxA16和/或EV71抗原阳性对照孔和PBS阴性对照孔，控制50～100μL/孔的加入量，并留空白调零孔，放入湿盒中，于37℃保温1～2小时后用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
B、按50～100μL/孔的量，在A步骤的酶标板各孔中，加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体和/或EV71抗体，放入湿盒中，于37℃保温0.5～1小时后用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
C、在B步骤的酶标板的各孔中，分别加入TMB显色液A和TMB显色液B各50μL/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10～15分钟；
D、在C步骤的酶标板的各孔中按50～100μL/孔的量加入终止液后置于酶标仪上，在450nm波长下，以空白孔调零检测吸光度A值，即得检测结果，并进行下列判定：
阳性对照平均A值-阴性对照平均A值≥0.4时，则试验成立，反之应重试；
Cutoff值=阴性对照的平均A值×2.1；当阴性对照的平均A值≥0.05时，则按实际值计算；当阴性对照的平均A值＜0.05时，则按0.05计算；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品的A值≥Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品判定为阳性，待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品A值＜Cutoff值，该待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品判定为阴性；
进一步地，对照下列情形判定：
a、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体的，该孔为阳性，判定为CoxA16感染或鉴别为CoxA16病毒；该孔为阴性，判定为非CoxA16感染或鉴别为非CoxA16病毒；
b、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的EV71抗体的，该孔为阳性，判定为EV71感染或鉴别为EV71病毒；该孔为阴性，判定为非EV71感染或鉴别为非EV71病毒；
c、待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体的，以及待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的EV71抗体的，两种孔均为阳性，判定为CoxA16及EV71混合感染或鉴别为CoxA16、EV71混合病毒；
待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体的，以及待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品中加入辣根过氧化物酶标记的EV71抗体的，两种孔均为阴性，判定为非CoxA16、非EV71感染或鉴别为非CoxA16、非EV71病毒。
2.根据权利要求1所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述步骤A中的待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品是经过下列方法获得：
通过粪便样品获得：
采集手足口病发病2～3天患者的粪便，每次采集量不少于1克；在采集的粪便内按每克粪便加入2～5mL的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀；再在4℃下，以2000～5000转/分离心15分钟；然后取离心后上清液50～150ul，即得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品；
或者通过咽式子及肛试子样品获得：
采集手足口病发病2～3天患者的咽式子或肛试子；每份咽式子或肛试子加入2～3mL磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，接种于敏感细胞培养，经过常规细胞培养分离能使细胞感染、产生细胞病变的可疑病毒阳性样品，即得待检疑含CoxA16和/或EV71病毒抗原样品。
3.根据权利要求1所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述步骤A的分别设置CoxA16和/或EV71抗原阳性对照孔和PBS阴性对照孔，具体是按下列方式设置：
对于需检测CoxA16病毒的，则在酶标版的空孔中分别加入CoxA16病毒抗原阳性对照样和PBS阴性对照样；
对于需检测EV71病毒的，则在酶标版的空孔中分别加入EV71病毒抗原阳性对照样和PBS阴性对照样；
对于需同时检测CoxA16病毒和EV71病毒的，则在酶标版的空孔中分别加入CoxA16抗原阳性对照样、EV71抗原阳性对照样和PBS阴性对照样。
4.根据权利要求1所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述步骤C的TMB显色液A是以TMB50mg和二甲基亚砜50mL混合后，加注射用水50mL制得；TMB显色液B是以醋酸钠6g、冰醋酸0.2mL和双氧水2.5mL混合后，加注射用水至500mL制得。
5.根据权利要求1所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述步骤D的终止液是2mmol/L的硫酸溶液。
6.根据权利要求1所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述B步骤的辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体是经下列方法制备：
①取市购蛋白A/G亲和层析柱，室温放置平衡30分钟后，用5倍柱体积的平衡液对层析柱进行平衡；
②将抗CoxA16血清或抗EV71血清与平衡液按1:1的体积比混合后上样，用10倍柱体积的平衡液洗脱杂蛋白，留下目的蛋白；
③用10倍柱体积的洗脱液将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱液，用磷酸盐缓冲液透析过夜，得到COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体；用lowry法测定COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体中的蛋白含量，置于-20℃以下保存待用；
④按辣根过氧化物酶:CoxA16病毒抗体或EV71病毒抗体＝1:1～1:2克分子比，将辣根过氧化物酶用注射用水溶解后，按每1mg辣根过氧化物酶加入0.5mLNaIO4，于4℃下放置30min，加入0.5mL乙二醇溶液，于4℃下放置30min，再与步骤③所得CoxA16病毒抗体或EV71病毒抗体混合，得混合体，经磷酸盐缓冲液透析过夜；再加硼氢化钠0.2mL，于4℃下放置30min，加等体积饱和硫酸铵，于4℃下放置30min，以3000rpm离心30min；然后用磷酸盐缓冲液溶解，并在磷酸盐缓冲液中透析过夜；加等体积甘油混匀后，得到标记的CoxA16抗体或EV71抗体，于-60℃以下保存备用；
⑤将步骤④标记的CoxA16抗体或EV71抗体用磷酸盐缓冲液稀释至稀释度为1:（2000～10000），即得到辣根过氧化物酶标记的CoxA16型抗体或EV71抗体。
7.根据权利要求6所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述平衡液为磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求6所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述步骤③的洗脱液为pH=2.67、0.1mol/L的Gly-HCl缓冲液。
9.根据权利要求6所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述A步骤的酶标板经过下列方法处理得到：
（1）包被：依据步骤③所测COXA16病毒抗体或EV71病毒抗体中的蛋白含量，将步骤③所得COXA16病毒抗体用碳酸盐缓冲液稀释至1～5μg/mL，将步骤③所得EV71病毒抗体用碳酸盐缓冲液稀释至5～10μg/mL，然后将两种病毒抗体的稀释液按1:1的体积比混合后，以100～150μL/孔的量加入到聚苯乙烯板中，于2～8℃过夜，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次；
（2）封闭：按100～250μL/孔的量加入封闭液，于2～8℃过夜，对酶标板进行封闭，用磷酸盐缓冲液洗板3～5次，自然晾干或真空包装后置于-20℃以下保存备用，即得到酶标板。
10.根据权利要求9所述的鉴别检测方法，其特征在于：所述步骤（2）的封闭液是以1000mL浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液加入20g牛血清白蛋白溶解混匀后制得。
CN201610187673.1A 2016-03-29 2016-03-29 一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法 Pending CN105759033A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610187673.1A CN105759033A (zh) 2016-03-29 2016-03-29 一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610187673.1A CN105759033A (zh) 2016-03-29 2016-03-29 一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105759033A true CN105759033A (zh) 2016-07-13

Family

ID=56346624

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610187673.1A Pending CN105759033A (zh) 2016-03-29 2016-03-29 一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105759033A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106771118A (zh) * 2017-02-08 2017-05-31 河北中医学院 柴胡粗酶的提取及酶活性检测方法
CN108241058A (zh) * 2018-01-13 2018-07-03 中国医学科学院医学生物学研究所 一种脊髓灰质炎病毒ⅲ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用
CN108303533A (zh) * 2018-01-13 2018-07-20 中国医学科学院医学生物学研究所 一种脊髓灰质炎病毒ⅰ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用
CN108387726A (zh) * 2018-01-13 2018-08-10 中国医学科学院医学生物学研究所 脊髓灰质炎病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ型d抗原同步快速鉴别、定量检测方法及其检测试剂盒和应用
CN110161229A (zh) * 2019-06-19 2019-08-23 中国医学科学院医学生物学研究所 能有效识别ca16病毒免疫原性抗原颗粒的酶联免疫试剂及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101650366A (zh) * 2008-08-11 2010-02-17 万志静 一种检测肠病毒的快速检测试纸及其制造方法
CN101655495A (zh) * 2009-09-15 2010-02-24 中国医学科学院医学生物学研究所 Ev71型病毒抗原的检测方法
US20120045468A1 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 National Health Research Institutes Immunogenic Compositions and Uses Thereof
CN102643927A (zh) * 2011-02-21 2012-08-22 刘志学 手足口病检测试剂盒及其检测方法
CN102657858A (zh) * 2012-04-26 2012-09-12 浙江省疾病预防控制中心 一种肠道病毒疫苗的制备方法
CN102854317A (zh) * 2011-09-27 2013-01-02 上海博沃生物科技有限公司 一种ev71抗原酶联反应检测试剂盒及其制备方法
CN104569428A (zh) * 2014-12-30 2015-04-29 浙江普康生物技术股份有限公司 一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101650366A (zh) * 2008-08-11 2010-02-17 万志静 一种检测肠病毒的快速检测试纸及其制造方法
CN101655495A (zh) * 2009-09-15 2010-02-24 中国医学科学院医学生物学研究所 Ev71型病毒抗原的检测方法
US20120045468A1 (en) * 2010-08-17 2012-02-23 National Health Research Institutes Immunogenic Compositions and Uses Thereof
CN102643927A (zh) * 2011-02-21 2012-08-22 刘志学 手足口病检测试剂盒及其检测方法
CN102854317A (zh) * 2011-09-27 2013-01-02 上海博沃生物科技有限公司 一种ev71抗原酶联反应检测试剂盒及其制备方法
CN102657858A (zh) * 2012-04-26 2012-09-12 浙江省疾病预防控制中心 一种肠道病毒疫苗的制备方法
CN104569428A (zh) * 2014-12-30 2015-04-29 浙江普康生物技术股份有限公司 一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106771118A (zh) * 2017-02-08 2017-05-31 河北中医学院 柴胡粗酶的提取及酶活性检测方法
CN108241058A (zh) * 2018-01-13 2018-07-03 中国医学科学院医学生物学研究所 一种脊髓灰质炎病毒ⅲ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用
CN108303533A (zh) * 2018-01-13 2018-07-20 中国医学科学院医学生物学研究所 一种脊髓灰质炎病毒ⅰ型d抗原预包被检测方法及其检测试剂盒和应用
CN108387726A (zh) * 2018-01-13 2018-08-10 中国医学科学院医学生物学研究所 脊髓灰质炎病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ型d抗原同步快速鉴别、定量检测方法及其检测试剂盒和应用
CN110161229A (zh) * 2019-06-19 2019-08-23 中国医学科学院医学生物学研究所 能有效识别ca16病毒免疫原性抗原颗粒的酶联免疫试剂及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Clinical and epidemiological implications of swine hepatitis E virus infection
Chiba et al. Sapporo virus: history and recent findings
CN105759033A (zh) 一种Cox A16及EV71病毒抗原的鉴别检测方法
Tuaillon et al. Dried blood spot for hepatitis C virus serology and molecular testing
Cohen et al. Measles immunity testing: comparison of two measles IgG ELISAs with plaque reduction neutralisation assay
Rotbart et al. Laboratory diagnosis of enteroviral infections
CN204882568U (zh) 猪o型口蹄疫病毒抗体的elisa检测试剂盒
Falsey et al. Humoral immunity to human metapneumovirus infection in adults
CN113009154A (zh) 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用
Birch et al. A study of the prevalence of rotavirus infection in children with gastroenteritis admitted to an infectious diseases hospital
Wu et al. The impact of traveling to endemic areas on the spread of hepatitis E virus infection: epidemiological and molecular analyses
Van Doornum et al. Development and implementation of real‐time nucleic acid amplification for the detection of enterovirus infections in comparison to rapid culture of various clinical specimens
CN101660001B (zh) 一种轮状病毒核酸检测试剂盒
CN101655495B (zh) Ev71型病毒抗原的检测方法
Nakata et al. Prevalence of antibody to human calicivirus in Japan and Southeast Asia determined by radioimmunoassay
CN104280551A (zh) 鸭坦布苏病毒病e-elisa检测试剂盒及其制备方法
CN102206713B (zh) 三重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及用途
Goldwater Immunoglobulin M capture immunoassay in investigation of coxsackievirus B5 and B6 outbreaks in South Australia
Nollens et al. New recognition of Enterovirus infections in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus)
CN117229367A (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗原表位多肽及elisa抗体检测试剂盒
CN106771121A (zh) 一种口蹄疫病毒胶体金试纸条、病原快速检测试剂盒及其制备方法
CN102809653A (zh) 一种检测新布尼亚病毒抗原的elisa试剂盒的制备和应用
Rotzén Östlund et al. Respiratory virus infections in Stockholm during seven seasons: a retrospective study of laboratory diagnosis
CN109799342A (zh) 一种o型口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒
CN111458498A (zh) 一种手足口ev71抗原检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160713

RJ01 Rejection of invention patent application after publication