CN101377494A - 一种检测结核抗体的化学发光免疫分析试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测结核抗体的试剂盒及其制备方法。本试剂盒由链亲和素包被固相载体，阴、阳性对照，生物素化结核抗原，碱性磷酸酶标记结核抗原，浓缩洗涤液及化学发光底物液组成。本试剂盒采用双抗原夹心反应原理及生物素－亲和素系统包被固相载体，这种方法不仅包被均匀牢固，抗原纯度大大提高，而且可以增加抗原吸附量，节约成本，具有敏感性高、特异性强等特点，能够准确地检测出多种结核病血清中的结核抗体，为临床诊断和结核病普查提供更加可靠的依据。

Description

一种检测结核抗体的化学发光免疫分析试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明利用化学发光免疫分析与生物素-亲和素系统相结合，提供了一种检测结核抗体的化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，结核病又称为痨病和“白色瘟疫”，是一种古老的传染病，可侵入人体全身各种器官。结核病共分为5类:原发性肺结核、血行播散型肺结核、继发性肺结核、结核性胸膜炎及其他肺外结核等，结核病是当今对人类最具威胁的感染性疾病之一，也是单一传染因子导致死亡的最常见原因，已超过艾滋病、疟疾、腹泻、热带病死亡人数的总和，严重危害人类健康，成为全球重大公共卫生问题。据世界卫生组织(WHO)统计，目前全球人口的1/3曾经感染过结核分枝杆菌，每年出现大约800万新病例，约300万人死于该病。1993年4月23日，在伦敦召开的第46届世界卫生大会上，世界卫生组织史无前例地宣布“全球结核病处于紧急状态”。1998年，再次发出“遏制结核病行动刻不容缓”的呼声。在我国结核病是国家重点控制的传染病，但结核病的疫情依然相当严重，部分地区有蔓延趋势，患病人数在世界居第2位，占全球结核病人的1/4，在传染病中居第1位，传染性肺结核病人约150万，每年约有12.7万人死于结核。降低结核病死亡率的关键是早期诊断，从而能准确及时的制定合理、科学的治疗方案。

结核病的初步诊断技术主要有:1、痰涂片检查:简便易行、准确性高，但阳性率低；2、痰结核菌培养:可信度高，但费时、昂贵且易受用药的影响，应用受到限制；3、胸部X光:准确快速，但易与其他肺部疾病混淆；以上诊断技术普遍存在灵敏度低、特异性差、耗时长等缺点，因此与对结核病的诊断价值有限。随着分子生物学技术的迅速发展，用高度敏感的方法检测结核菌及其特异性DNA片段，如PCR、生物探针和基因芯片等，在结核菌检测方面有简便、敏感、特异等优点，但需要相应的检测设备，技术要求高，费用高，难以推广。目前ELISA、金标等免疫诊断技术检测血清中结核抗体，具有简便快速、无需精密仪器、易于推广等特点，但当前所用的诊断抗原，存在假阳性率高、特异性差等缺点，因此寻找强特异性及免疫原性的诊断抗原，将几种抗原联合检测能提高灵敏度，不影响特异性，比单一抗原法具有更高的敏感性，对结核病的诊断和方法学建立具有十分重要的意义。

结核菌抗原38KD是一种分泌蛋白，具有良好的抗原性；ESAT-6抗原是一种分泌性抗原，在结核菌感染早期产生，并被宿主系统识别，蛋白分子表位众多，且仅在致病性结核菌中表达，不存在于其他非致病性分支杆菌中，因而是一种具有诊断价值的特异性抗原；CFP10也是一种分泌性抗原，编码与ESAT-6相邻，均位于结核杆菌的基因区；因此这3种抗原联合检测结核菌感染，具有灵敏度高、特异性强等优点，对结核病的血清学诊断具有很高价值。本发明则采用38KD、ESAT-6、CFP10抗原联合检测血清中的结核抗体。

生物素-亲和素系统(BAS)是近年来发展起来的一种新型生物反应放大系统。生物素与亲和素间的结合亲和力高、特异性强，具有的多级放大作用。将亲和素(链霉亲和素)包被固相载体，抗体或抗原与生物素结合，然后通过亲和素—生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化，这种方法不仅可增加吸附的的抗体或抗原量，而且包被均匀、牢固，其结合位点充分暴露，提高了反应的敏感性。本发明即采用这种包被方法，增加了检测的灵敏度。

目前化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法。其优点是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫分析方法相结合，是目前发展和推广应用较快的免疫分析方法，主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。

发明内容

本发明解决以上诊断技术的不足，将链亲和素包被固相载体，使38KD、ESAT-6、CFP10抗原生物素化，与链亲和素结合，加入待测样本后，再加入酶标记的相同抗原，与载体上包被的抗原和被测样品中的结核抗体形成“双抗原夹心”结构，最后加入化学发光底物液，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，具有比酶联免疫分析更强的特异性，临床符合率也大大提高，可为结核抗体的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

本发明的目的是提供一种检测结核抗体的试剂盒及其制备方法。

本发明的试剂盒包括:阴性对照、阳性对照，链亲和素化的固相载体，生物素标记的抗原，碱性磷酸酶标记的抗原，浓缩洗涤液以及化学发光底物液。其中，所述链亲和素包被的固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管；所述化学发光底物的发光剂为AMPPD、CSPD或CDP-Star；优选地，所述化学发光底物液为2.4％Tris、16％NaCl、0.4％KCl、1.5％HCl、20％AMPPD和0.1％Proclin300；所述浓缩洗涤液为Tris-HCl缓冲液。

本发明的技术方案为:

1)将链亲和素包被的固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。

2)链亲和素包被固相载体的制备:将适当浓度的链亲和素与0.05MpH值为7.2的PBS缓冲液混合，将所得混合液负载于固相载体上；酪蛋白封闭液(含1％酪蛋白、1％Proclin 300、1.21％Tris和0.88％NaCl的pH7.5的Tris缓冲液)封闭；抽湿干燥后用铝箔袋密封，2～8℃保存。

3)将38KD、ESAT-6、CFP10结核抗原混合在一起，用PBS将纯化的抗原稀释；加入过碘酸钠，4℃反应10min；装入透析袋，对PBS透析2次，每次1h，再转入NaHCO3中透析；加入二甲基亚砜溶解的生物素酰肼，室温作用12h；加入硼氢化钾溶液，再对PBS4℃透析24h，即为生物素化的结核抗原，加等体积甘油，4℃保存备用。

4)用戊二醛法将碱性磷酸酶与结核菌抗原偶联，加入等量甘油，4℃保存。

5)将正常人血清过滤除菌后，经含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液稀释后制成阴性对照；将结核抗体阳性血清过滤除菌后灭活后，经含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液稀释后制成阳性对照。

6)配制浓缩洗涤液:配制pH值为7.4的25倍浓缩的Tris-HCl缓冲液，经纯化水稀释25倍后使用。

7)配制化学发光底物液:所述化学发光底物液包含2.4％Tris、16％NaCl、0.4％KCl、1.5％HCl、20％AMPPD和0.1％Proclin300。

8)分装上述各组分，组装为成品。

本发明的试剂盒，通过大量临床实验，选择了最佳的测定方法，既有效地利用了化学发光技术原理，又充分利用了生物素-亲和素系统，并使用高特异性的38KD、ESAT-6、CFP10抗原，确保了检测的灵敏度与特异性，能够准确地检测出多种结核病血清中的结核抗体，可用于结核病的临床血清学诊断。

具体实施方式

实施例1制备本发明的结核抗体化学发光免疫分析检测试剂盒

本发明的结核抗体测定试剂盒包括:链亲和素包被的微孔板，阴、阳性对照，生物素化的结核菌抗原，碱性磷酸酶标记的结核菌抗原，浓缩洗涤液及化学发光底物液；

一、链亲和素包被微孔板的制备

(1)包被

将0.05M pH值为7.2的PBS缓冲液与适当浓度的链亲和素混匀制成包被液，加至发光板内，每孔100μL，4℃过夜；

具体地，PBS缓冲液配制方法为2.2gNaH₂PO₄·2H₂O，12.9gNa₂HPO₄·12H2O，9gNaCl，用纯化水定容至1000mL，调pH至7.2。

(2)封闭

配制酪蛋白封闭液，分别将12.1gTris，8.8g NaCl，10g酪蛋白，1mlProclin300加至1000mL纯化水中，用HCl调pH至7.5。每孔分别加酪蛋白封闭液200μL，4℃过夜，甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥18-24小时，然后用铝箔袋密封，2～8℃保存。

二、生物素化结核菌抗原的制备

1)从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增38KD、ESAT-6和CFP10抗原的基因，连接入pBVIL1表达载体，在大肠杆菌HB101株中进行表达，获得了结核分枝杆菌38KD、ESAT-6、CFP10抗原；

2)用0.1mol/L pH值为7.4的PBS将纯化的结核菌抗原稀释为1～2mg/mL；

3)加入60mmol/L过碘酸钠0.1mL，4℃反应10min；

4)装入透析袋，对PBS透析2次，每次1h，再转入0.1mol/LNaHCO3中透析1h；

5)加入二甲基亚砜溶解的生物素酰肼(16mg/mL)0.3mL，室温作用12h；

6)加入硼氢化钾溶液(5mg/mL)0.1mL，室温作用3h后，再对PBS4℃透析24h，其间换液3～4次，即为生物化的结核抗原，加等体积甘油，小量分装，4℃保存备用。

使用时，取一定量生物素化的结核抗原，按1:800浓度加到稀释液中，4℃保存。稀释液为包含0.24％BSA、0.1％TritonX-100和0.1％Proclin300的磷酸盐缓冲液。

三、阴、阳性对照的制备

阴性对照:将正常人血清过滤除菌后，加到含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为1:200的溶液，分装后2～8℃保存；

阳性对照:将结核抗体阳性血清过滤除菌并且灭活后，加到含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为1:180的溶液，分装后2～8℃保存。

四、碱性磷酸酶标记结核抗原的制备

用戊二醛交联法将结核抗原与碱性磷酸酶偶联在一起，加1/3甘油，小量分装，4℃以下保存。使用时，取一定量的酶标结核抗原，加到含有1.2％ Tris、0.5％ BSA和0.1％ Proclin300的稀释液中，充分混匀，配制成浓度为1:1600的酶标记物，2～8℃保存。

五、浓缩洗涤液的制备

配制pH值为7.4的25倍浓缩的Tris-HCl缓冲液，包含30gTris、200gNaCl、5gKCl、18.75mLHCl和1mLProclin300，置2～8℃避光保存。纯化水稀释25倍后使用。

六、化学发光底物液的制备

基于1000mL化学发光底物液，包含24gTris、160gNaCl、4gKCl、15mLHCl、200mLAMPPD和1mLProclin300，置2～8℃避光保存。

七、将各组分组装为成品试剂盒。

实施例2～3制备本发明的结核抗体化学发光免疫分析检测试剂盒

除分别以塑料珠、塑料管作为载体，其余均以与实施例1相同的方法制备结核抗体化学发光免疫分析检测试剂盒。

实施例4本发明的试剂盒的使用方法

1)自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡30分钟；

2)将试剂盒提供的浓缩洗涤液液用纯化水稀释25倍后使用；

3)加生物素化的抗原50μL于各孔内；然后设阴性对照3孔，每孔50μL；阳性对照2孔，每孔50μL；空白1孔，其余孔加待测样品50μL，用微量震荡器充分振荡混匀，贴上封板膜，置37℃温育30分钟；

4)洗板5次，每孔400μL，最后在干净的吸水纸上扣干；

5)除空白孔外，其余孔加酶标记物50μL，振荡混匀，贴上封板膜，置37℃温育30分钟；

6)洗板3次，每孔400μL，最后在干净的吸水纸上扣干；

7)每孔加化学发光底物液100μL，振荡混匀，室温避光反应30分钟。

8)必须于加化学发光底物液后的第30～60分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

9)结果判定:根据测定标本(S)的RLU值与临界值(CUT-OFF)的比值确定。

临界值(CUT-OFF)＝2.1×阴性对照孔平均RLU值；

若S/CO值≥1，则为阳性反应，说明样本中含有结核抗体；

若S/CO值<1，则为阴性反应，说明样本中不含有结核抗体。

实施例5本发明的试剂盒与ELISA试剂盒对血样检测比较

本发明的试剂盒与ELISA试剂盒同时检测临床确诊的活动性结核病患者血清160例，非结核性疾病患者血清253例，正常人对照血清120例，检测结果见下表1:

表1  本发明的试剂盒与ELISA试剂盒检测结果

从表1可以看出，本发明的试剂盒对活动性结核病患者的阳性检出率明显高于ELISA试剂盒，而检测非结核性疾病患者的阳性率(即假阳性率)却明显少于ELISA试剂盒，对正常人血清检测均为阴性，可见本发明的试剂盒比ELISA试剂盒更敏感、特异、准确。

实施例6本发明的试剂盒对几种结核病血清中结核抗体的检测

由于结核病种类较多，本发明的试剂盒对几种发病率较多的结核病患者，采集新鲜血清检测结核抗体，检测情况如下表2:

表2  本发明试剂盒检测结果

 

病种	标本量	检出阳性数	阳性率(％)
				结核性胸膜炎	16	16	100

 

肾结核	2	2	100
				淋巴结核	3	2	100
肠结核	4	4	100
				肺结核	62	60	96.8
肺外结核	81	76	93.8
				支气管内膜结核	32	30	93.7
结核性脑膜炎	8	5	62.5
				肝结核	7	6	85.7

从表2可以看出，本发明试剂盒对结核性胸膜炎、肾结核、淋巴结核和肠结核病患者血清中结核抗体的检出率均达到了100％，对其它几种结核病结核抗体的检出率，也较目前结核抗体的检测试剂大大提高，说明本发明试剂盒具有更高的临床符合率，可为目前结核病的检测提供更准确、可靠的价值。

Claims (10)

1、一种检测结核抗体的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：链亲和素包被的固相载体，阴、阳性对照，生物素化的抗原，碱性磷酸酶标记的抗原，浓缩洗涤液及化学发光底物液。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板、塑料珠或塑料管。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液为包含2.4％Tris、16％NaCl、0.4％KCl、1.5％HCl、20％AMPPD和0.1％Proclin300的溶液。

4、如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物发光剂为AMPPD、CSPD或CDP-Star。

5、根据权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以链亲和素包被固相载体；配制阴、阳性对照；使结核杆菌抗原生物素化；以碱性磷酸酶标记结核杆菌抗原；配制浓缩洗涤液及化学发光底物液；分装上述阴、阳性对照、酶标记物、浓缩洗涤液和化学发光底物液；以及组装为成品。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述链亲和素包被固相载体的步骤为：将适当浓度的链亲和素与0.05MpH值为7.2的PBS缓冲液混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；然后将酪蛋白封闭液负载于上述固相载体上。

7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阴性对照是正常人血清经0.5％BSA的磷酸盐缓冲液稀释后制备而成；阳性对照是结核抗体阳性血清经0.5％BSA的磷酸盐缓冲液稀释后制备而成。

8、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述结核杆菌抗原生物素化的步骤包括：纯化结核杆菌38KD、ESAT-6、CFP10抗原；用0.1mol/LpH值为7.4的PBS将纯化的抗原稀释为1～2mg/mL；加入60mmol/L过碘酸钠0.1mL，4℃反应10min；装入透析袋，对PBS透析2次，每次1h，再转入0.1mol/LNaHCO3中透析1h；加入二甲基亚砜溶解的生物素酰肼(16mg/mL)0.3mL，室温作用12h；加入硼氢化钾溶液(5mg/mL)0.1mL，室温作用3h后，再对PBS4℃透析24h，其间换液3～4次，即为生物素化的结核抗原，加等体积甘油，4℃保存备用。

9、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物液为包含2.4％Tris、16％NaCl、0.4％KCl、1.5％HCl、20％AMPPD和0.1％Proclin300的溶液。

10、如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物发光剂为AMPPD、CSPD或CDP-Star。