CN103033616A - 一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测检测方法及试剂盒，在膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和所述固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质。本发明本发明试剂盒具有保质期较长、交叉反应少、显色性能较优等特点。

Description

一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法及试剂盒。

背景技术

肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，以下简称HFRS），我国习称流行性出血热（Epidemic hemorrhagic fever，EHF），是由汉坦病毒（Hantavirus，HV）引起的以发热、出血、肾脏损害为主要临床特征的自然疫源传染病，鼠为主要的传染源，寄生螨类参与传播，主要通过接触宿主动物排泄物经伤口、气溶胶、饮食传播。其临床表现复杂，预后差。

对HFRS的实验室诊断方法主要有常规检查、超声检查、基因检测、病毒分离鉴定与血清学检测等。目前临床主要依据患者的症状、体征及血、尿常规作诊断，这对一些典型病人尚可，而一旦遇到不典型的病人，诊断就比较困难，常造成误诊或遗漏，不仅使病人在经济上蒙受不应有的损失，甚至丧失最佳抢救治疗的时机，导致病人死亡，因此，早期诊断尤为重要。超声检查HFRS对仪器与技术要求较高。基因检测多采用反转录PCR（RT-PCR）技术，但由于HFRS病程早期病毒载量较小，故在临床标本的检测方面还不够稳定。病毒分离鉴定法所需周期较长且需要特殊设备。

血清学检测方法是HFRS早期检测的一种主要手段，如酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA）、间接免疫荧光法（IFA）等，ELISA检出率高，敏感度和特异性都较好，但大都需要特殊设备，操作人员需要专门的操作技能，一次测试从采样到孵育、洗板、显色需要很长的时间，浪费大量人力物力，难以在缺少设备的边远山区、基层医院、诊所开展。间接免疫荧光法需要荧光显微镜等设备，在基层也受到一定限制。

流行性出血热起病后2～3天血清中可检测出流行性出血热IgM抗体，7～10天达高峰。而流行性出血热IgG抗体在病后数周出现，可持续多年，因此，IgM抗体阳性可对该疾病进行早期诊断。目前较为简便快捷的血清学检测主要是采用胶体金斑点渗滤法检测HFRS-IgM抗体，其原理为：液体通过微孔滤膜时，标本中的抗体与膜上的抗原相接触并结合，再加入金标记的抗人抗体显色，达到快速检测的目的（一般在3～5min左右完成），同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到洗涤目的，成为“床边检验”主要方法之一。该方法以操作简单便捷、检测速度快、节省人力物力为特点，使得临床检验甚至可以在床边进行，不需任何仪器、设备及复杂的样本处理过程，结果立即可取，真正做到了床边检验（Point of Care Test，POCT），减轻了操作人员的劳动强度。但目前胶体金斑点渗滤试剂的金标液保存期较短，容易受外界温度等因素影响而发生沉淀等现象，某些诊断试剂盒的保存缓冲液出于商业原因等并未给出具体组分，给试剂盒的开发应用带来不便。另外，由于试剂盒洗涤液或样本方面的原因，例如溶血、高血脂、高胆红素等，本底会发红，影响结果判读，尤其是对于弱阳性标本检测结果的判读。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种适用于临床辅助诊断和鉴别的肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法及试剂盒，以解决现有技术存在的金标液保存期较短，容易受外界温度等因素影响而发生沉淀现象等问题。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种肾综合征出血热病毒IgM抗体的检测方法，在膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和所述固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质；

所述金标工作液采用如下方法制得：

⑴制备金标浓缩液：取0.5～1%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.4～0.8wt%柠檬酸三钠溶液0.8～1ml，混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸5～15分钟，停止加热，冷却至室温，向得到的溶液中加入1mg/ml的鼠抗人IgM单抗0.2～0.5ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液；

⑵制备稀释液：将121.1～242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.2mg的氯化钠和0.5～0.7mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，再加入0.04～0.07wt%诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入1～2wt%海藻糖、2ml甘油、0.03～0.05wt%黄原胶与0.8～2.0wt%的羧甲基壳聚糖，再加入0.5ml水杨酸异辛酯一并混匀，最后用盐酸将其pH调节至7.0～7.5，得到所述稀释液；

⑶将所述金标浓缩液与稀释液按1：15～30的体积比混合，得到金标工作液；

所述洗涤液，包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得：将121.1mg～242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg～1mg的氯化钠和0.1mg～1mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，加入0.1～0.2wt%的EDTA，然后再加入体积比为1.5～2.0%的丙醇，混匀后加入0.8～1.5wt%的二氯醋酸及0.2～0.4wt%的TritonX-100，最后再用氢氧化钠溶液将其pH调节为8.5～9.0，得到洗涤液。

优选的，所述包被膜为硝酸纤维素膜。

优选的，所述稀释液和洗涤液瓶置于2～8℃下保存。

优选的，所述金标工作液由所述金标浓缩液与稀释液按1：20的体积比混合得到。

一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测试剂盒，包括检测盒、按照权利要求1所述方法制备的金标工作液和洗涤液，所述检测盒内设有包被膜，所述包被膜上设有检测点和质控点，所述检测点包被有固相肾综合征出血热抗原，所述质控点包被有羊抗鼠抗体。

优选的，所述肾综合征出血热抗原包被量为0.2mg/ml的肾综合征出血热抗原0.5μl，所述羊抗鼠抗体包被量为2mg/ml的羊抗鼠抗体0.5μl。

优选的，所述包被膜为硝酸纤维素膜。

优选的，所述检测盒放置在湿度小于40%的环境下干燥2小时后，放置在铝箔袋内封口保存。

采用上述技术方案后，本发明的有益效果是：

（1）由于改善了金标工作液配方，通过添加糖类与甘油组合物，减少了温度等环境变化对金标溶液体系稳定性的影响，同时由于紫外线吸收剂水杨酸异辛酯的加入，避免了过度光照引起的金标物聚集，从而延长了金标液以及整个试剂盒的保质期，试验证明此发明所述金标工作液可稳定16个月之久；

（2）通过添加对于血红素助溶及洗涤作用的物质，减少或消除了因标本（例如溶血标本、高胆红素标本）或试剂原因出现的底色发红的现象，提高了检测的灵敏度，尤其是避免了对弱阳性样本的漏检。

本发明试剂盒具有保质期较长、交叉反应少、显色性能较优的特点，使用方法简单便捷、检测速度快，临床检验不需任何仪器，避免了实验过程中各种因素对结果的影响以及减轻了操作人员的劳动强度；可满足医院诊所及卫生检疫部门的临床需求，也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断研究。

具体实施例

实施例1

金标工作液的配制

1、原料：氯金酸、柠檬酸三钠，鼠抗人IgM单抗，盐酸、碳酸钾、三羟甲基氨基甲烷、海藻糖、氯化钠、甘油，牛血清白蛋白，PROCLIN300，水杨酸异辛酯、黄原胶、PEG20000，羧甲基壳聚糖。

2、仪器设备：容量瓶；磁力搅拌器；万分之一电子天平；冰箱；离心机。

3、配制步骤：

（1）制备金标浓缩液：取1wt%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.5wt%柠檬酸三钠溶液0.8ml，迅速混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸10分钟，停止加热，冷却至室温；

向得到的溶液中加入1mg/ml的鼠抗人IgM单抗0.3ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液，备用；

（2）制备稀释液：将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化钠和0.5mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，轻摇使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，再加入0.06wt%PROCLIN300诊断试剂防腐剂，然后依次加入2wt%海藻糖、2ml甘油、0.03wt%黄原胶与1wt%的羧甲基壳聚糖，再加入0.5ml水杨酸异辛酯与并混匀，最后用盐酸将其pH调节至7.4，在2～8℃下保存，备用；

（3）将金标浓缩液与稀释液按1：20的体积比混合，得到金标工作液。

对比例1配制方法：

（1）制备金标浓缩液：取1%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.5%柠檬酸三钠溶液0.8ml，迅速混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸10分钟，停止加热，冷却至室温；向得到的溶液中加入1mg/ml的鼠抗人IgM单抗0.3ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液，备用；

（2）制备稀释液：将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化钠和0.5mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，轻摇使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，最后用盐酸将其pH调节至7.4，即为金标稀释液。在2～8℃下保存，备用；

（3）将稀释液与金标浓缩液按20：1的体积比混合，得到金标工作液。

对比例2配制方法：方法同对比例1，仅在稀释液制备步骤中另外添加0.1%的PEG20000。

4、验证金标工作液配方的稳定性及有效性：

将加有稳定剂的金标工作液与对比工作液置于室温保存条件下，前期隔月进行检测，后期每月进行检测，检测时，观察金标工作液的物理状态，并在硝酸纤维素膜上包被HFRS抗原（检测点）与羊抗鼠抗体（质控点），利用强阳性、中阳性、弱阳性质控品（各10份）检验显色性能。检验结果如下：

表1 金标工作液物理状态稳定性结果

表2 金标工作液显色性能稳定性结果

注：“+++”表示强阳性；“++”表示中阳性；“+”表示弱阳性；“-”表示阴性

试验表明，加有稳定剂的金标液保存期较长，可稳定至少16个月，期间金标工作液的颜色、性状以及对于强中弱阳性质控品的显色性能均比常规只加有BSA或PEG的工作液保存期长，因此此稳定性金标液可作为试剂盒的较优选择。

实施例2

洗涤液的配制

1、原料：三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、氢氧化钠、丙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，牛血清白蛋白，PROCLIN300，二氯醋酸、TritonX-100、乙二胺四乙酸EDTA，PEG20000。

2、仪器设备：容量瓶；磁力搅拌器；万分之一电子天平；冰箱。

3、配制步骤：

将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化钠和0.1mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，轻摇使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，加入0.15%的EDTA，然后加入加入体积比为1.5%的丙醇，混匀后加入1.2%的二氯醋酸及0.3%的TritonX-100，最后再用0.1M稀氢氧化钠将其pH调节为8.6，得到洗涤液，放在洗涤液瓶内，置于2～8℃下保存；

对比例配制方法：

将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化钠和0.1mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，轻摇使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，再用盐酸将其pH调节为7.4，得到洗涤液，放在洗涤液瓶内，置于2～8℃下保存；

4、对标本的检测对比试验：

用包被缓冲液稀释抗体，在0.45μm的硝酸纤维素膜的检测点位置7包被0.5μl 0.2mg/ml的HFRS抗原，质控点位置8包被0.5μl 2mg/ml的羊抗鼠抗体。包被缓冲液为pH7.4的PBS，添加3%的海藻糖。将盒盖、一定大小的硝酸纤维素膜、吸水垫和盒体按照从上到下的顺序组装并扣紧，使上盖的窗口扣在包被膜中心位置，检测盒在湿度10%-40%的环境下室温干燥1小时。对临床上收集的一定程度溶血的弱阳性及阴性样本、临床确诊的高胆红素弱阳性及阴性标本、高血脂弱阳性及阴性样本采用实施例洗涤液及对比例洗涤液分别进行对比检测，检测结果如下表所示：

表3 对比例与实施例对不同类型血清样本的检测结果

结果表明，添加特效物质的洗涤液可有效淡化本底，使结果易判读。标本溶血是临床检验中较常见的干扰和影响因素，溶血、高脂血及高胆红素等样本可能会使检验结果失去真实性和准确性，影响疾病的诊断和治疗。本发明所述试剂盒中由于洗涤液采取了独特配方，可明显淡化本底，最大程度满足各种标本准确性检验的要求。

实施例3

一种肾综合征出血热病毒IgM抗体的检测方法，在硝酸纤维素膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质；

金标工作液采用如下方法制得：

⑴制备金标浓缩液：取0.5wt%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.4wt%柠檬酸三钠溶液0.8ml，混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸5分钟，停止加热，冷却至室温，向得到的溶液中加入1mg/ml的鼠抗人IgM单抗0.2ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液；

⑵制备稀释液：将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化钠和0.5mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，再加入0.04～0.07wt%诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入1wt%海藻糖、2ml甘油、0.03wt%黄原胶与0.8wt%的羧甲基壳聚糖，再加入0.5ml水杨酸异辛酯一并混匀，最后用盐酸将其pH调节至7.0，得到稀释液；

⑶将金标浓缩液与稀释液按1：15的体积比混合，得到金标工作液；

洗涤液，包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得：将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化钠和0.1mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，加入0.1wt%的EDTA，然后再加入体积比为1.5%的丙醇，混匀后加入0.8wt%的二氯醋酸及0.2wt%的TritonX-100，最后再用氢氧化钠溶液将其pH调节为8.6，得到洗涤液。

稀释液和洗涤液瓶置于2℃下保存。

实施例4

一种肾综合征出血热病毒IgM抗体的检测方法，在硝酸纤维素膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质；

金标工作液采用如下方法制得：

⑴制备金标浓缩液：取1wt%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.8wt%柠檬酸三钠溶液1ml，混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸15分钟，停止加热，冷却至室温，向得到的溶液中加入1mg/ml的鼠抗人IgM单抗0.5ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液；

⑵制备稀释液：将242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.2mg的氯化钠和0.7mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，再加入0.07wt%诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入2wt%海藻糖、2ml甘油、0.03～0.05wt%黄原胶与2.0wt%的羧甲基壳聚糖，再加入0.5ml水杨酸异辛酯一并混匀，最后用盐酸将其pH调节至7.5，得到稀释液；

⑶将金标浓缩液与稀释液按1：30的体积比混合，得到金标工作液；

洗涤液，包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得：将242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、1mg的氯化钠和1mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，加入0.2wt%的EDTA，然后再加入体积比为2.0%的丙醇，混匀后加入1.5wt%的二氯醋酸及0.4wt%的TritonX-100，最后再用氢氧化钠溶液将其pH调节为9.0，得到洗涤液。

稀释液和洗涤液瓶置于4℃下保存。

实施例5

一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测试剂盒，包括：

1、检测盒，盒内设有包被膜，包被膜上设有检测点和质控点，检测点包被有固相肾综合征出血热抗原，包被量为0.2mg/ml的肾综合征出血热抗原0.5μl，质控点包被有羊抗鼠抗体，包被量为2mg/ml的羊抗鼠抗体0.5μl，包被膜为硝酸纤维素膜。

检测盒在湿度20%的环境下室温干燥2小时，干燥后的检测盒用铝箔袋包装，并在袋内放置干燥剂，封口。

2、金标工作液

（1）制备金标浓缩液：取1%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.5%柠檬酸三钠溶液0.8ml，迅速混匀，待溶液颜色由淡黄→蓝色→紫色→完全透明的酒红色，继续煮沸10分钟，停止加热，冷却至室温；向得到的溶液中加入1mg/ml的鼠抗人IgM单抗0.3ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液，备用；

（2）制备稀释液：将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化钠和0.5mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，轻摇使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，再加入0.06%PROCLIN300诊断试剂防腐剂，然后依次加入2%海藻糖、0.05%黄原胶、混匀后再加入1.5%的羧甲基壳聚糖，最后用盐酸将其pH调节至7.4，在2～8℃下保存，备用；

（3）将稀释液与金标浓缩液按20：1的体积比混合，得到金标工作液。并放置在金标工作液瓶1内；

3、洗涤液

将121.1mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg的氯化钠和0.1mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，轻摇使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，加入0.15%的EDTA，再加入体积1.5%的丙醇，混匀后加入1.2%的二氯醋酸及0.3%的TritonX-100，最后再用稀氢氧化钠将其pH调节为8.6，得到洗涤液，放在洗涤液瓶内，置于2～8℃下保存；

4、在金标工作液瓶和洗涤液瓶上贴好标签后与检测盒一起组装成试剂盒。

本发明试剂盒的使用、检测方法如下：

（1）样本收集

将静脉血置于干净、未加抗凝剂或促凝剂的容器内，静置使血自然收缩，离心取血清检测。

（2）检测

a、取出试剂盒，室温平衡20～30分钟；

b、滴加洗涤液1滴于反应孔中，待液体将膜完全湿润；

c、加待测血清150μl于反应孔中，待液体充分吸入；

d、滴加金标液3滴于反应孔中，待液体充分吸入；

e、滴加洗涤液3滴于反应孔中，待液体充分吸入后于3分钟内观察结果。

（3）结果判断

阳性：若被测标本中含有HFRS IgM抗体，标本中的特异性抗体便与硝酸纤维素膜4上的固相HFRS抗原发生特异性结合形成复合物，而其他无关物质则被滤过，再加上金标抗体，滤过时金标抗体便与复合物结合，即可在检测点7观察到红色反应标记。同时，金标抗体与质控点8上包被的羊抗鼠抗体结合，在质控点8形成红色反应标记，为阳性结果。

阴性：若被测标本中不含有HFRS IgM抗体，反应体系中的金标抗体与包被的固相HFRS抗原无法形成金标复合物，即在检测点7无红色反应标记。同时，金标抗体与质控点8上包被的羊抗鼠抗体结合，在质控点8形成红色反应标记，为阴性结果。

无效：若质控点8不显色，表明操作失误或试剂失效。运用此发明所述试剂盒进行如下试验：

1.临床血清检测：使用本发明实施例的试剂盒对临床上确诊的295例阳性标本、705例阴性标本进行检测，结果如下：

表4 临床血清检测结果

由上表可以看出，本发明所述试剂盒诊断肾综合征出血热病毒IgM特异性抗体的灵敏度与特异性较高，加之其使用简单便捷的特点，完全满足临床检验的需要。

2.特异性：收集临床上确诊的类风湿因子阳性血清20份、抗巨细胞病毒IgM抗体阳性血清23份、抗风疹病毒IgM抗体阳性血清19例、抗乙型肝炎病毒抗体阳性血清30例，分别用本试剂盒进行检测，结果全为阴性。

3.试剂盒稳定性研究：将本发明所述试剂盒置37℃进行破坏性试验，每天考察试剂盒稳定性。同时将试剂盒置于2-8℃常规保存条件进行稳定性考察。检测标准如下：

（1）物理检测

检测板：平整洁净、装配严密，检测孔内膜片无划痕、破损和污点。

金标液：瓶盖瓶体无变形；瓶内液体红色透明，无浑浊、沉淀现象。

洗涤液：瓶盖瓶体无变形；瓶内液体无色透明，无浑浊、沉淀现象。

（2）阴性质控品符合率：用10份HFRS抗体阴性质控品检测，检测结果全部呈阴性。

（3）阳性质控品符合率：用30份HFRS抗体阳性（包括强、中、弱阳性）质控品检测，检测结果全部呈阳性。

试剂盒稳定性考察结果如下：

表5 试剂盒37℃加速破坏结果

备注：“+++”表示强阳性；“++”表示中阳性；“+”表示弱阳性；“-”表示阴性

经试验在37℃可稳定至少8天。

表6 常规条件下（2-8℃）试剂盒稳定性结果

经试验在常规条件下可稳定至少16个月，可满足医院诊所及卫生检疫部门的临床需求，也可用于大专院校和科研机构的疾病诊断研究。

本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法，在膜上固定肾综合征出血热病毒抗原，加入待检血清，待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体和所述固定在膜上的抗原结合，再加入含有鼠抗人IgM单抗的金标工作液，鼠抗人IgM单抗与待检血清中的肾综合征出血热病毒IgM抗体结合，显示出红色，最后加入洗涤液，洗去多余的金标工作液和其他杂质，其特征在于：

所述金标工作液采用如下方法制得：

⑴制备金标浓缩液：取0.5～1wt%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，加入0.4～0.8wt%柠檬酸三钠溶液0.8～1ml，混匀，待溶液颜色由淡黄至蓝色至紫色至完全透明的酒红色，继续煮沸5～15分钟，停止加热，冷却至室温，向得到的溶液中加入1mg/ml的鼠抗人IgM单抗0.2～0.5ml，然后将混合溶液进行离心处理，弃去上清液，得到下层金标浓缩液；

⑵制备稀释液：将121.1～242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1～0.2mg的氯化钠和0.5～0.7mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，再加入0.04～0.07wt%诊断试剂防腐剂PROCLIN300，然后依次加入1～2wt%海藻糖、2ml甘油、0.03～0.05wt%黄原胶与0.8～2.0wt%的羧甲基壳聚糖，再加入0.5ml水杨酸异辛酯一并混匀，最后用盐酸将其pH调节至7.0～7.5，得到所述稀释液；

⑶将所述金标浓缩液与稀释液按1：15～30的体积比混合，得到金标工作液；

所述洗涤液，包括三羟甲基氨基甲烷、氯化钠和牛血清白蛋白，并采用如下方法制得：将121.1mg～242.2mg的三羟甲基氨基甲烷、0.1mg～1mg的氯化钠和0.1mg～1mg的牛血清白蛋白置于容量瓶内，加入双蒸水，使之完全溶解，然后继续加入双蒸水至100mL，加入0.1～0.2wt%的EDTA，然后再加入体积比为1.5～2.0%的丙醇，混匀后加入0.8～1.5wt%的二氯醋酸及0.2～0.4wt%的TritonX-100，最后再用氢氧化钠溶液将其pH调节为8.5～9.0，得到洗涤液。

2.如权利要求1所述的一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法，其特征在于：所述膜为硝酸纤维素膜。

3.如权利要求1所述的一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法，其特征在于：所述稀释液和洗涤液置于2～8℃下保存。

4.如权利要求1所述的一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测方法，其特征在于：所述金标工作液由所述金标浓缩液与稀释液按1：20的体积比混合得到。

5.一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：包括检测盒、按照权利要求1所述方法制备的金标工作液和洗涤液，所述检测盒内设有包被膜，所述包被膜上设有检测点和质控点，所述检测点包被有固相肾综合征出血热抗原，所述质控点包被有羊抗鼠抗体。

6.如权利要求5所述的一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：所述肾综合征出血热抗原包被量为0.2mg/ml的肾综合征出血热抗原0.5μl，所述羊抗鼠抗体包被量为2mg/ml的羊抗鼠抗体0.5μl。

7.如权利要求5所述的一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：所述包被膜为硝酸纤维素膜。

8.如权利要求5所述的一种肾综合征出血热病毒IgM抗体检测试剂盒，其特征在于：所述检测盒放置在湿度小于40%的环境下干燥2小时后，放置在铝箔袋内封口保存。