CN117405877A - 一种elisa试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。该方法通过以下步骤：首先采用点包被模式，将包被液注入酶标板中，每孔注入包被液100±2μl；将包被好的酶标板进行温育；然后进行洗板封闭；二次温育、干燥：将封闭后的包被板在室温下进行温育，温育结束后，弃掉板中封闭液，干燥后即可。本发明提供的包被方法，提高了ELISA试剂盒的稳定性，包被效果好，能够节省原料（抗原），同时，检测区间线性系数R值更优，重复性好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。
背景技术
包被物质与板底表面的有效结合是ELISA中至关重要的一步。包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被，对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被(先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上，再通过特异性反应使抗原固相化)。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物，由于分子量太小，往往难于直接吸附在酶标板上，一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联，偶联物吸附于固相载体上。
蛋白质在固体表面吸附是现有的最简单的固定抗体的方法，但是，该方法中，抗原由于不是特异性固定，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与酶标板结合，从而使得检测背景较高，且降低了检测的灵敏度。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，包括以下步骤：
(1)包被温育：采用点包被模式，将包被液注入酶标板中，每孔注入包被液100±2μl； 将包被好的酶标板进行温育；
(2)洗板封闭：洗板2次，每孔加封闭液110±2 uL；
（3）二次温育、干燥：将封闭后的包被板在室温下进行温育，温育结束后，弃掉板中封闭液，干燥后即可。
进一步的，步骤（1）中，所述包被液为浓度为1μg/ml的重组链酶亲和素（R-SA）溶液；所述溶液为包被缓冲液；所述包被缓冲液为10mM、pH7.4的PBS缓冲液。
进一步的，步骤（1）的具体过程为：将包被液注入到酶标板板孔内，在24±2℃下，温育4h；温育结束后,用洗涤液进行洗板2次，洗板后加入生物素化抗原，在24±2℃下，温育反应18-24h。
本发明提供的包被方法中，每1000mL封闭液的组成为：Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白 10g、改性贻贝粘蛋白5g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶 20mL、D-海藻糖 50g。
上述改性贻贝粘蛋白的制备方法为：将贻贝粘蛋白加入超纯水进行稀释，得贻贝粘蛋白混悬液，然后向混悬液中首先加入D-氨基半乳糖，升温至38-45℃，搅拌2h，然后逐滴加入单宁酸溶液，继续保温反应1h，反应结束后，恢复至室温，除去多余的D-氨基半乳糖和单宁酸，干燥即可。
进一步的，所述贻贝粘蛋白混悬液的浓度为1.5-2%；所述贻贝粘蛋白和D-氨基半乳糖的质量比为1:4；所述贻贝粘蛋白和单宁酸的质量比为1:1.5。
进一步的，所述单宁酸溶液的质量浓度为15%。
进一步的，步骤（3）中，所述室温下温育的时间为2-3h。
本发明所使用的洗涤液为pH7.4的PBS缓冲液。
本发明的有益效果为：本发明提供的包被方法，提高了ELISA试剂盒的稳定性，包被效果好，能够节省原料（抗原），同时，检测区间线性系数R值更优，重复性好。
附图说明
图1为标准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
(1)包被温育：将重组链酶亲和素（R-SA）采用10mM的PBS缓冲液（pH7.4）稀释成浓度为1μg/ml，得包被液重组链酶亲和素（R-SA）溶液；采用点包被模式，将包被液注入酶标板中，每孔注入包被液100±2μl； 将包被好的酶标板进行在24±2℃下，温育4h；温育结束后,用洗涤液进行洗板2次，洗板后加入生物素化抗原，在24±2℃下，温育反应18-24h；
(2)洗板封闭：洗板2次，每孔加封闭液110±2 uL；
封闭液组成：Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白10g、改性贻贝粘蛋白5g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶20mL、D-海藻糖 50g，补足超纯水至1000mL；
所述改性贻贝粘蛋白的制备方法为：将贻贝粘蛋白加入超纯水进行稀释，得质量浓度为1.5%的贻贝粘蛋白混悬液，然后向混悬液中首先加入4倍质量的D-氨基半乳糖，升温至38-45℃，搅拌2h，然后逐滴加入1.5倍的质量浓度为15%的单宁酸溶液，继续保温反应1h，反应结束后，恢复至室温，除去多余的D-氨基半乳糖和单宁酸，干燥即可
（3）二次温育、干燥：将封闭后的包被板在室温下放置2-3h温育，温育结束后，弃掉板中封闭液，干燥后即可。
对比例1
(1)包被温育：采用点包被模式，将10mM的PBS缓冲液（pH7.4）注入酶标板中，每孔注入PBS缓冲液100±2μl； 将处理的酶标板进行在24±2℃下，温育4h；温育结束后,用洗涤液进行洗板2次，洗板后加入生物素化抗原，在24±2℃下，温育反应18-24h；
(2)洗板封闭：洗板2次，每孔加封闭液（组成同实施例1）110±2 uL；
（3）二次温育、干燥：将封闭后的包被板在室温下放置2-3h温育，温育结束后，弃掉板中封闭液，干燥后即可。
对比例2
(1)包被温育：将重组链酶亲和素（R-SA）采用10mM的PBS缓冲液（pH7.4）稀释成浓度为1μg/ml，得包被液重组链酶亲和素（R-SA）溶液；采用点包被模式，将包被液注入酶标板中，每孔注入包被液100±2μl； 将包被好的酶标板进行在24±2℃下，温育4h；温育结束后,用洗涤液进行洗板2次，洗板后加入生物素化抗原，在24±2℃下，温育反应18-24h；
(2)洗板封闭：洗板2次，每孔加封闭液110±2 uL；
封闭液组成：Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白10g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶 20mL、D-海藻糖 50g，补足超纯水至1000mL；
（3）二次温育、干燥：将封闭后的包被板在室温下放置2-3h温育，温育结束后，弃掉板中封闭液，干燥后即可。
对比例3
(1)包被温育：将重组链酶亲和素（R-SA）采用10mM的PBS缓冲液（pH7.4）稀释成浓度为1μg/ml，得包被液重组链酶亲和素（R-SA）溶液；采用点包被模式，将包被液注入酶标板中，每孔注入包被液100±2μl； 将包被好的酶标板进行在24±2℃下，温育4h；温育结束后,用洗涤液进行洗板2次，洗板后加入生物素化抗原，在24±2℃下，温育反应18-24h；
(2)洗板封闭：洗板2次，每孔加封闭液110±2 uL；
封闭液组成：Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白10g、贻贝粘蛋白5g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶 20mL、D-海藻糖 50g，补足超纯水至1000mL；
（3）二次温育、干燥：将封闭后的包被板在室温下放置2-3h温育，温育结束后，弃掉板中封闭液，干燥后即可。
效果实施例
（一）以狂犬抗体为例，将标准品的抗体效价值与对应的吸光值做曲线，导出线性回归方程：y=0.0210964+0.1230x；将待测样品吸光值代入方程，计算得到样品的抗体效价值。
具体结果见表1，标准曲线如图1所示。
表1
（二）以狂犬抗体为例，分别采用实施例1及对比例1-3提供的包被方法进行包被后，测试标准品（10IU/mL， 20IU/mL）及质控血浆(QC11.6IU/mL)，进行准确度验证，具体检测结果参见表2。
表2
（三）以狂犬抗体为例（狂犬抗体国标10IU/mL），将实施例1及对比例2-3提供的包被方法处理酶标板后，对其稳定性进行相关检测，室温（25℃）下进行，具体结果见表3所示。
表3
Claims (8)
1.一种ELISA试剂盒抗原间接包被酶标板的包被方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)包被温育：采用点包被模式，将包被液注入酶标板中，每孔注入包被液100±2μl；将包被好的酶标板进行温育；
(2)洗板封闭：洗板2次，每孔加封闭液110±2 uL；
（3）二次温育、干燥：将封闭后的包被板在室温下进行温育，温育结束后，弃掉板中封闭液，干燥后即可。
2.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，步骤（1）中，所述包被液为浓度为1μg/ml的重组链酶亲和素（R-SA）溶液；所述溶液为包被缓冲液；所述包被缓冲液为10mM、pH7.4的PBS缓冲液。
3.根据权利要求2所述的包被方法，其特征在于，步骤（1）的具体过程为：将包被液注入到酶标板板孔内，在24±2℃下，温育4h；温育结束后,用洗涤液进行洗板2次，洗板后加入生物素化抗原，在24±2℃下，温育反应18-24h。
4.根据权利要求1所述的包被方法，其特征在于，步骤（2）中，每1000mL封闭液的组成为：Na2HPO4·12H2O 5.8g、磷酸二氢钠 0.593g、氯化钠 15g、酪蛋白 10g、改性贻贝粘蛋白5g、硫柳汞钠 0.5g、BSA 30g、蔗糖 100g、山羊血清 200mL、明胶 20mL、D-海藻糖 50g。
5.根据权利要求4所述的包被方法，其特征在于，所述改性贻贝粘蛋白的制备方法为：将贻贝粘蛋白加入超纯水进行稀释，得贻贝粘蛋白混悬液，然后向混悬液中首先加入D-氨基半乳糖，升温至38-45℃，搅拌2h，然后逐滴加入单宁酸溶液，继续保温反应1h，反应结束后，恢复至室温，除去多余的D-氨基半乳糖和单宁酸，干燥即可。
6.根据权利要求5所述的包被方法，其特征在于，所述贻贝粘蛋白混悬液的浓度为1.5-2%；所述贻贝粘蛋白和D-氨基半乳糖的质量比为1:4；所述贻贝粘蛋白和单宁酸的质量比为1:1.5。
7.根据权利要求5或6所述的包被方法，其特征在于，所述单宁酸溶液的质量浓度为15%。
8.根据权利要求1或4所述的包被方法，其特征在于，步骤（3）中，所述室温下温育的时间为2-3h。
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