CN114113614B

CN114113614B - 一种单宁酸免疫网络及盐酸克伦特罗试纸条检测方法

Info

Publication number: CN114113614B
Application number: CN202111462077.7A
Authority: CN
Inventors: 王建龙; 刘思杰; 张道宏; 舒蕊
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-12-02
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2041-12-02
Also published as: CN114113614A

Abstract

本发明公开了一种生物资源衍生的单宁酸支持的免疫网络用于检测盐酸克伦特罗的试纸条及其应用。通过使用单宁酸纳米球作为标记羊抗鼠免疫球蛋白的信号载体，偶联特异性单克隆抗体，以免疫层析试纸条为检测平台构建了一种灵敏、有效且简单的免疫层析方法，同时在无需使用任何额外的化学试剂的前提下实现了信号载体与免疫球蛋白的偶联。得益于单宁酸的有效的蛋白富集能力，所构建的免疫网络实现了免疫检测的信号放大，进一步节省了特异性单克隆抗体的消耗，并因此获得了10倍的灵敏度（以试纸条检测截断值为例）提升，本发明拓宽了可再生生物资源衍生的单宁酸的应用范围，所构建的免疫网络为向简单、高重复性、稳定的免疫层析系统的发展提供了新的路径。

Description

一种单宁酸免疫网络及盐酸克伦特罗试纸条检测方法

技术领域

本发明属生物检测领域，具体涉及一种生物资源衍生的单宁酸免疫网络的制备方法及以免疫层析试纸条为检测平台进行肉制品中盐酸克伦特罗检测的方法，具体涉及一种单宁酸纳米球构建免疫网络并标记特异性单克隆抗体的探针及试纸条制备，及其用于快速检测肉制品中盐酸克伦特罗的应用。。

背景技术

瘦肉精（clenbuterol, CLE）作为一种人工合成的β2-肾上腺素激动剂，在过去的几十年里不仅被用于控制支气管哮喘和肺部疾病，还被用作促生长药物。考虑到过量CLE摄入所引起的肌肉震颤、急性中毒、心悸等症状，以及CLE由于其稳定的化学性质可长期蓄积在动物体内的研究现状，食物中CLE的残留因此对人体健康构成了巨大威胁。同时许多国家已经明确禁止使用克仑特罗作为生长促进剂或制定了严格的限量标准。相比于已经开发的各种分析技术，包括高效液相色谱（HPLC），气相色谱-质谱（GC-MS），液相色谱串联质谱（LC-MS），毛细管电泳，电化学传感器和酶联免疫吸附检测（ELISA），免疫层析试纸条（LFIA）因其具备良好的特异性，稳定性，快速性，便携性，易于操作和低成本的优点，逐步成为在食品安全现场检测中的实用工具。然而，实现更高的灵敏度、更简单的抗体标记方式、更少的核心试剂消耗（如特异性单克隆抗体），仍是提高LFIA应用实际意义的重要途径。

鉴于盐酸克伦特罗的试纸条检测属于竞争性免疫学测定，检测方法本身所具备的检测灵敏度主要由信号输出强度和抗体使用浓度这两个因素决定，而现阶段大多数研究仅致力于信号输出强度的研究，关于结合纳米材料替代胶体金构建免疫网络以减少抗体使用浓度从而提升灵敏度的研究较少。一方面，通过使用纳米材料替代胶体金提升了信号标签本身的稳定性和信号强度，另一方面结合免疫球蛋白构建免疫网络，进一步减少了特异性单克隆抗体的消耗，促使限量的抗体与游离的分析物和固定化的抗原之间产生高效的竞争，从而获得更加灵敏的信号强度和分析物浓度的响应关系。因此，在偶联方式简单（简单搅拌即可偶联且无需调整pH）、减少核心试剂单克隆抗体消耗量、输出足够的信号强度的前提下获得较高的灵敏度仍是一个关键问题。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种生物资源衍生的免疫网络构建生物探针、检测盐酸克伦特罗的试纸条及应用，该免疫探针仅需聚单宁酸纳米酶、羊抗鼠免疫球蛋白与单克隆抗体依次简单混合即可制备，在保证信号输出强度的同时，极大的降低了抗体的用量，从而提高分析系统的灵敏度，这对于监控动物源性食品中的盐酸克伦特罗残留具有很重要的现实意义和应用价值，可视化检测线达到0.6 ng/mL，截断值为2ng/mL。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：

一种基于免疫网络的探针，包括生物资源衍生的聚单宁酸纳米球（PTAN）支持的免疫网络和特异性单克隆抗体，所述抗体为抗盐酸克伦特罗单克隆抗体。

具体的，聚单宁酸纳米球（PTAN）作为信号载体与羊抗鼠免疫球蛋白（GAMI）以6mg：20 μg的混合比在1 mL去离子水中首先制备免疫网络，随后加入2 μg抗体通过简单混合制备免疫探针。

具体的，所述的生物资源衍生的PTAN采用甲醛辅助交联法，在碱性乙醇水溶液中通过搅拌、水热反应制备，平均粒径约为131 nm。

一种检测盐酸克伦特罗的试纸条，所述的试纸条上运行上述的基于免疫网络的新型探针。

具体的，所述的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端、覆盖样品垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线。

进一步的，检测线包被有CLE-BSA的制备方法包括：0.5 mg/mL的CLE-BSA包被液以0.6 µL/cm的包被量包被于硝酸纤维素膜的检测线上。2.5 mg/mL羊抗鼠免疫球蛋白以0.6µL/cm的划线速率涂覆在控制线上为控制线。

所述的检测盐酸克伦特罗的试纸条用于检测牛肉和猪肝中盐酸克伦特罗残留的应用。

与现有技术相比，其优点与积极效果在于：

（1）偶联方式简单。本发明中的免疫网络的偶联方式基于单宁酸有效的蛋白吸附能力，在无需任何额外交联剂的前提下通过简单的混合即可完成免疫网络的制备。

（2）核心试剂消耗低。本发明采用聚单宁酸纳米球（PTAN）作为信号载体，通过引入羊抗鼠免疫球蛋白（GAMI）构建免疫网络，在获得相同信号输出强度的前提下减少了核心试剂单克隆抗体的消耗，在形同信号强度的前提下相比于无免疫网络的传统方法抗体消耗减少了7.5倍。

（3）灵敏度高、操作简便。本发明构建的免疫层析试纸条对盐酸克伦特罗的检测限为0.6 ng/mL，截断值为2 ng/mL。同时分析过程快速、简便，且节省成本。灵敏度约为无免疫网络时的5倍和传统胶体金试纸条的10倍（以截断值为例）。

附图说明

图1是本发明的免疫网络、探针与免疫层析试纸条原理示意图；

图2是对本发明免疫层析试纸条的性能评估；

图3是对本发明免疫层析试纸条的特异性评估；

图4是对本发明免疫层析试纸条的应用评估；

图5是本发明制备的基于免疫网络的免疫探针与传统方法的抗体消耗量和灵敏度对比；

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。

具体实施方式

本发明的免疫网络包括使用通过生物资源衍生的单宁酸通过甲醛辅助交联法合成并作为信号载体，通过简单混合一步实现偶联羊抗鼠免疫球蛋白形成免疫网络，随后偶联单克隆抗体作为检测探针，在保证信号输出强度的同时，降低了抗体用量，从而提高分析的灵敏度，这对于监控动物源性食品中的盐酸克伦特罗残留具有很重要的意义和应用价值。所制备的试纸条利用竞争性原理对样品中的盐酸克伦特罗进行特异性检测，在以牛肉和猪肝为代表的实际样品中具有可靠、灵敏、稳定、便携、快速和操作简单的特点。

作为新型信号载体，聚单宁酸纳米球由天然可再生资源衍生的单宁酸制备，单宁酸自身所具有的良好蛋白富集能力赋予了聚单宁酸纳米球偶联羊抗鼠免疫球蛋白构建免疫网络的基础能力。同时作为纳米材料，聚单宁酸纳米球相较于胶体金在抗体偶联过程中无需调节pH且仅需简单混合即可完成偶联，同时具备了胶体金简单偶联和纳米材料自身的优点。

信号载体聚单宁酸纳米球（PTAN）的制备：见图1，氨水加入预先混合的乙醇水混合溶液并持续搅拌，随后加入可再生天然资源衍生的单宁酸，加入甲醛后持续搅拌后移入反应釜中100℃反应24小时。待冷却后，离心干燥备用。具体的，作为信号载体的PTAN粒径约为131 nm。

单宁酸支持的免疫网络的构建：见图1，按比例向预先制备的PTAN溶液中加入羊抗鼠免疫球蛋白（GAMI），室温偶联40分钟后加入牛血清白蛋白（BSA）封闭未反应位点，随后置于4℃备用。

新型免疫探针的制备：见图1，按比例向预先制备的免疫网络中加入特异性抗盐酸克伦特罗单克隆抗体（AbCLE），室温偶联40分钟后离心去除多余的BSA，重悬后置于4℃备用。

本发明所用的针对盐酸克伦特罗的单克隆抗体是申请人课题组通过采用细胞融合技术筛选阳性细胞，诱导小鼠腹腔大量生产而得到的。参考Zhang Daohong等人在刊物《Analytical Chimica Acta》第635卷第63-69页题目为“Production of ultrasensitivegeneric monoclonal antibodies against major aflatoxins using a modified two-step screening procedure”一文中记载的方法制备得到的：将盐酸克仑特罗人工抗原即市售盐酸克仑特罗CLE-牛血清白蛋白的偶联物（CLE-BSA）免疫雌性Balb/c小鼠以诱导抗克伦特罗的抗血清产生，然后取小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，间接ELISA和间接竞争ELISA筛选得到能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，并进行单克隆化扩大培养。将得到的细胞注射到雌性Balb/c小鼠的腹腔中，该小鼠提前一周注射了0.5 mL弗氏不完全佐剂。几天后，收集腹水，用辛酸-硫酸铵法纯化抗体并冻干。将一部分抗体以浓度为1mg/mL溶解在10 mM磷酸盐缓冲液（PBS, pH7.4）中备用。

免疫层析试纸条的制备：见图1，试纸条由四部分构成，依次将硝酸纤维素膜、样品垫和吸收垫贴至衬板上，其中硝酸纤维素上划线包被有CLE-BSA和羊抗鼠免疫球蛋白分别做为检测线（T）和控制线（C）。

工作原理：见图1，盐酸克伦特罗的免疫测定是基于竞争原理，即样品中的分析物与固定在检测线上的抗原竞争结合信号标记的抗体。将样品溶液和制备的免疫探针混合后加入到试纸条下端的样品垫上，混合溶液通过毛细管作用沿试纸条向吸水垫方向移动。当样品中含有目标物时，其将和制备的生物探针结合并一同向上泳动，到达固定着抗原的检测线时，固定抗原将和目标物竞争生物探针中抗体上有限的抗原结合位点，样品中盐酸克伦特罗的含量越高，检测线上的固定抗原能够结合的探针将越少，形成的显色带颜色越浅。当固定抗原所结合的生物探针少于一定的数量时，检测线处将不会有棕色线条出现。无论样品中是否含有盐酸克伦特罗，未被检测线截获的探针或其与盐酸克伦特罗的结合物将继续移动至吸水垫，所以样品中不含盐酸克伦特罗（阴性）时为两条棕色条带，含有一定量盐酸克伦特罗（阳性）时检测线为比对照浅的棕色条带或者没有棕色条带。本发明专利所构建的基于免疫网络的探针，满足了相同信号输出强度下极其有限的抗体使用，因此在相同的检测线显色效果下，基于免疫网络的探针消耗更少的抗体，特别是对于竞争性免疫测定，极大的提高了检测灵敏度。

实施例1：

抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法

抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1. 腹水采集：

提前培养盐酸克伦特罗细胞，待细胞长至良好状态时，将细胞株注射预先用液体石蜡处理过的BALB/c小鼠，待小鼠腹部明显涨大时，收集该小鼠的腹水。

2. 抗体纯化：

采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：腹水用双层滤纸过滤，4 ℃，12000 r/min离心15 min，吸取上清。所得腹水上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸33 μL/mL腹水，室温混合30 min，4 ℃静置2 h。之后4 ℃，12000 r/min离心30 min，弃沉淀。上清用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的0.1 mol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L 氢氧化钠溶液调混合液pH值至7.4。上清4 ℃预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277 g/mL，4 ℃静置2 h。再4 ℃，12000 r/min离心30 min，弃上清。所得沉淀用1/10原腹水体积的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析。将充分透析好的蛋白溶液置-80 ℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体，将抗体置-20 ℃冰箱中备用。

醋酸盐缓冲液为0.29 g醋酸钠，0.141 mL醋酸加水定容至100 mL所得。0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8 g氯化钠，0.29 g十二水磷酸氢二钠，0.02 g氯化钾，磷酸二氢钾0.02 g加水定容至100 mL所得。所述的用2 mol/L氢氧化钠溶液为80 g氢氧化钠加水定容至1000 mL所得。

3. 单克隆抗体的性质鉴定：

用间接竞争ELISA法鉴定其对盐酸克伦特罗的灵敏度及交叉反应率。用聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化效果进行鉴定。

下述实施例2-5使用的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体为实施例1制备得到的。

实施例2：

1. 聚单宁酸纳米球（PTAN）通过甲醛辅助交联与水热反应的方法制备。

其具体方法为：分别取46 mL蒸馏水、8 mL乙醇和0.45 mL氨水于烧杯中，经过60min的磁性搅拌后，缓慢加入0.2 g的单宁酸粉末，观察到溶液的颜色由无色变为浅黄色，继续在搅拌状态下加入0.38 mL甲醛并持续搅拌24 h，随后移入反应釜100℃反应24 h。经过离心水洗之后得到聚单宁酸溶液，产物置于4 ℃冰箱备用。粒径约为131 nm。

2. 免疫网络探针的制备方法为：

取6 mg/mL的PTAN溶液，加入20 μL 1 mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白（GAMI）溶液，室温孵育40 min；加入10 %牛血清白蛋白（BSA）溶液至其终浓度为2 %，于4 ℃放置备用。

3. 免疫探针的制备方法为：

取上述制备的1 mL免疫网络（PTAN-GAMI），加入2 μL 1 mg/mL的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体（AbCLE）溶液，室温孵育40 min；离心后用标记洗涤保存液重悬，于4 ℃放置备用。

1 mg/mL AbCLE溶液为1 mg抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶解在1 mL纯水中制成；10 % BSA溶液为10 g牛血清白蛋白溶解在100 mL纯水中；标记洗涤保存液为：2.0 g聚乙二醇-20000，0.2 g叠氮钠，0.1235 g硼酸，纯水定容至1000 mL，0.22 µm滤膜过滤所得。

实施例3：

快速检测盐酸克伦特罗免疫层析试纸条的制备

快速检测盐酸克伦特罗的免疫层析试纸条，见图1，其设置有衬板，衬板上从上到下依次贴附有吸水垫、硝酸纤维素膜和样品垫。制备方法包括以下步骤：

1. 吸水垫的制备：

将吸水纸剪裁成长18 mm宽3 mm的规格，即得吸水垫。

2. 硝酸纤维素膜的制备：

0.5 mg/mL抗原（CLE-BSA）和2.5 mg/mL羊抗鼠免疫球蛋白（GAMI）分别以0.6 μL/cm的划线速率涂覆在NC膜上作为检测线（T-line）和控制线（C-line）。

3. 样品垫的制备：

将玻璃纤维膜剪裁成长8 mm宽3 mm的规格，放入封闭液中浸湿，于37 ℃条件下干燥10 h左右，得样品垫，然后置干燥器中室温保存；封闭液组成为：2% BSA，1% PVP-K30，和0.05% Tween-20。

4. 试纸条的组装：

首先将硝酸纤维素膜贴附于衬板上，然后样品垫压1-3 mm，压硝酸纤维素膜1-3mm，吸水垫压硝酸纤维素膜1-3 mm依次贴附于衬板上，即得快速检测盐酸克伦特罗的免疫层析试纸条。

实施例4：

快速检测盐酸克伦特罗的免疫层析试纸条的性能评价

将盐酸克伦特罗标准品溶于pH值为7.4的PBS中，连续稀释使浓度为0至24 ng/mL范围不同浓度的测试溶液，使用PBS作为空白对照。评价性能时将测试条的样品垫浸入100µL测试溶液中，观察检测结果。通过肉眼观察可明显发现T线的颜色随着检测物浓度的增加较阴性对照浅。当T线的颜色明显减弱时，定义相应的最小检测物浓度作为检测限。当T线的颜色完全消失时，定义相应的最小检测物浓度作为截断值。

检测结果：见图2a，本发明所使用的试纸条（PTAN-GAMI based LFIA）对于CLE的检测限为0.6 ng/mL，截断值为2 ng/mL。见图2b，仅采用聚单宁酸纳米球作为信号载体而不构建免疫网络的试纸条（PTAN-based LFIA）对于CLE的检测限为2 ng/mL，截断值为10 ng/mL。见图2c，采用胶体金作为信号载体且不构建免疫网络的试纸条（Au-based LFIA）对于CLE的检测限为4 ng/mL，截断值为20 ng/mL。表明所构建的基于免疫网络的盐酸克伦特罗检测试纸条分别实现了5倍和10倍的灵敏度提升（以截断值为例）。同时计算了不同模式下对于盐酸克伦特罗检测的计算检测限（cLOD），以10%抑制浓度计算。

实施例5：

快速检测盐酸克伦特罗的免疫层析试纸条的特异性评估

对于所构建的免疫层析试纸条，对可能产生干扰的链霉素（STR），17β-雌二醇（E2），3-羟酪胺盐盐酸（HYD），莱克多巴胺（RAC）和3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）进行特异性评估。

检测结果：见图3，所制备的试纸条不与其它结构类似物交叉反应，表现出对盐酸克伦特罗良好的特异性检测反应。

实施例6：

快速检测盐酸克伦特罗的免疫层析试纸条的应用评估

将实施例1-5制得的免疫网络、单克隆抗体和免疫层析试纸条用于检测实际样品中盐酸克伦特罗，包括以下步骤：

牛肉和猪肝作为实际样品，准确称取1 g切碎的样品后加入2 mL 3%的三氯乙酸中。振荡10分钟后，将混合物离心（10000 rpm，10分钟）并通过0.22 μm大小的膜过滤。随后用1 M NaOH调节上清至中性。最后将最终溶液用PBS稀释5倍，随后进行检测。

检测结果：见图4，检测试纸条的检测线不显色或颜色比对照试纸条检测线颜色浅，均判为阳性，而检测线颜色与对照试纸条颜色一致时，判为阴性。结果表明，该试纸条针对的检测灵敏度与性能检测结果基本一致。

实施例7：

为了评估本发明使用的基于免疫网络的探针较传统的直接标记抗体的方式消耗更少且灵敏度更高，进行了以下对比实验：

于实施例2中基于免疫网络的探针制备不同的是信号载体采用聚单宁酸纳米球（PTAN）分别制备基于免疫网络的探针（PTAN-GAMI）和传统方法制备（直接标记抗体，PTAN-AbCLE）的探针，在近似相同的信号输出强度（intensity）下比较抗体的消耗量（amount ofAbCLE）和探针的消耗量（volume of probe），同时以抑制率（inhibition rate）比较分析灵敏度。

检测结果：见图5，传统方式制备探针在获得相同信号强度的前提下抗体的消耗量是基于免疫网络的探针的7.5倍，同时探针消耗量为1.7倍，而灵敏度较差，同等浓度（2 ng/mL）下抑制率为基于免疫网络的探针的9.8倍，上述结果说明，本发明使用的基于生物资源衍生的单宁酸支持的免疫网络制备的探针在拥有较高的灵敏度的同时节省了核心试剂单克隆抗体的消耗。

Claims

1.一种检测盐酸克伦特罗的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括衬板，硝酸纤维素膜，吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜上沿横向依次设置检测线和控制线，还包括匹配使用的单宁酸支持的免疫网络探针，所述单宁酸支持的免疫网络探针是在单宁酸支持的免疫网络中加入2μg的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体混合而成，所述单宁酸支持的免疫网络是由聚单宁酸纳米球和羊抗鼠免疫球蛋白以6mg：20μg的混合比在1mL去离子水中制备而成。

2.根据权利要求1所述的一种检测盐酸克伦特罗的试纸条，其特征在于，所述聚单宁酸纳米球采用甲醛辅助交联法，在碱性乙醇水溶液中通过搅拌、水热反应制备，平均粒径为131nm。

3.根据权利要求1所述的一种检测盐酸克伦特罗的试纸条，其特征在于，所述检测线为0.5mg/mL克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物以0.6μL/cm划线速率涂覆在硝酸纤维素膜形成的，所述控制线为2.5mg/mL羊抗鼠免疫球蛋白以0.6μL/cm划线速率涂覆在硝酸纤维素膜形成的，所述试纸条配合单宁酸支持的免疫网络探针进行检测，所述单宁酸支持的免疫网络探针的用量为7.5µL/100µL测试溶液。

4.根据权利要求1-3任一权利要求所述试纸条用于牛肉和猪肝中盐酸克伦特罗的检测。