WO2011083604A1 - イムノクロマトグラフィー用試薬組成物 - Google Patents

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WO2011083604A1
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immunochromatography
polyoxyethylene
stimulating hormone
chelating agent
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伊藤　大輔
勇亮 芝井
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田中貴金属工業株式会社
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    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/76—Human chorionic gonadotropin including luteinising hormone, follicle stimulating hormone, thyroid stimulating hormone or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a high-performance, highly sensitive reagent composition for immunochromatography or a developing solution for immunochromatography that suppresses nonspecific reactions. Furthermore, the present invention relates to a detection kit and a test method capable of detecting / measuring a detection target in a sample quickly and easily by suppressing nonspecific reactions. More specifically, this detection kit relates to a detection kit that can be quickly, easily and highly accurately inspected by supplying the detection sample directly to the sample addition section of the detection kit without performing pretreatment of the detection sample.
  • immunochromatographic strip-type immunoassays that do not require pretreatment of detection samples are simple in vitro diagnostic kits or portable devices that detect antigens in sample solutions using the specific reactivity of antibodies.
  • diagnostic device for medical use the importance is increasing.
  • pregnancy test kits are familiar immunochromatographic devices that are also sold as over-the-counter drugs. Since the hCG secreted from the placenta is excreted in the urine of a pregnant woman, research on an immunochromatographic apparatus for detection using an antibody that specifically reacts with hCG in the urine has been advanced. It was.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • 2Na ethylenediaminetetraacetic acid
  • EDTA ⁇ 3K diethylenetriaminepentaacetic acid
  • DTPA a technique of adding a chelating agent such as “DTPA”
  • background coloration coloration of portions other than the stationary phase antibody in the determination part
  • blank color development coloration of the immobilized phase in the absence of a detection substance
  • an additive-impregnated part is provided between the sample introduction part and the judgment part of the porous carrier that constitutes the detection piece, and there is a substance that has an effect of canceling hydrophobic bonds and electrical interactions, for example, surface activity
  • An immunochromatography apparatus in which at least one of an agent, an ammonium salt, and a pH buffer is supported is disclosed (see Patent Document 5).
  • various additives are used to suppress side reactions based on biological affinity or to suppress non-specific reactions.
  • a protein for example, bovine serum albumin, casein, gelatin, etc.
  • a high molecular compound for example, polyethylene glycol, dextran, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.
  • non- Ionic surfactants for example, Tween 20, Triton X-100, etc.
  • ionic surfactants or polyanions for example, dextran sulfate, heparin, polystyrene sulfonic acid, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, etc.
  • the present inventors have conducted experiments by focusing on nonionic surfactants among the above nonionic surfactants (eg, Tween 20, Triton X-100, etc.), ionic surfactants or polyanions. As a result, it has been observed that a non-specific reaction still occurs when an object to be detected in a sample is detected by an immunochromatography method, and there remains a problem that the non-specific reaction cannot be sufficiently suppressed.
  • nonionic surfactants eg, Tween 20, Triton X-100, etc.
  • an object of the present invention to provide a high-performance, high-sensitivity reagent composition for immunochromatography or a developing solution for immunochromatography that suppresses nonspecific reactions as compared with the prior art.
  • Another object of the present invention is to provide an immunochromatography apparatus capable of suppressing a nonspecific reaction and performing a test quickly, simply and with high accuracy as compared with the prior art.
  • an object of the present invention is to provide an immunochromatography apparatus capable of performing a rapid and simple pregnancy test by specifically reacting with human chorionic gonadotropin (hCG) in urine.
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • An object of the present invention is to provide a detection kit which can be easily and highly accurately inspected.
  • an object of the present invention is to provide a detection kit capable of performing a pregnancy test quickly, simply and with high accuracy by supplying urine directly to a sample addition section of the detection kit.
  • the present invention also relates to a method for detecting a detection target in a sample by an immunochromatography method while suppressing a nonspecific reaction.
  • the present invention provides the following (a) to (j) immunochromatographic reagent composition, immunochromatographic developing solution, immunochromatography apparatus and immunochromatography method using the same, and detection kit.
  • (A) The first feature of the present invention is that the ratio of the oxyethylene repeating unit of the polyoxyethylene block having an alkyl group at one end to the buffer solution, the chelating agent, and the oxypropylene repeating unit of the polyoxypropylene block is a molar ratio.
  • hCG Human chorionic gonadotropin
  • hCG Human chorionic gonadotropin
  • LH luteinizing hormone
  • FSH follicle stimulating hormone
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • the second feature of the present invention resides in the immunochromatographic reagent composition according to the above (a), wherein the chelating agent is an aminocarboxylic acid chelating agent.
  • the third feature of the present invention is that the ratio of the oxyethylene repeating unit of the polyoxyethylene block having an alkyl group at one end to the buffer solution, the chelating agent, and the oxypropylene repeating unit of the polyoxypropylene block is a molar ratio.
  • hCG Human chorionic gonadotropin
  • a detection target selected from the group consisting of luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH) and thyroid stimulating hormone (TSH).
  • LH luteinizing hormone
  • FSH follicle stimulating hormone
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • the fourth feature of the present invention is that the sample adding part, the labeling substance holding part, the chromatography medium part, human chorionic gonadotropin (hCG), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone ( FSH) and a thyroid stimulating hormone (TSH), comprising a detection part for detecting a detection target selected from the group consisting of thyroid-stimulating hormone (TSH) and an absorption part in sequence, and between the end of the sample addition part and the absorption part
  • TSH thyroid-stimulating hormone
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • Immunok containing a nonionic surfactant comprising a polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer in the range of ⁇ 1.5 Lying in immunochromatography device, wherein the site containing the Matrix-chromatographic reagent composition is provided.
  • a fifth feature of the present invention resides in the immunochromatography apparatus according to (d) above, wherein the chelating agent is an aminocarboxylic acid chelating agent.
  • the sixth feature of the present invention is that a sample addition part, a labeling substance holding part, a chromatography medium part, human chorionic gonadotropin (hCG), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone ( FSH) and a thyroid stimulating hormone (TSH), comprising a detection part for detecting a detection target selected from the group consisting of thyroid-stimulating hormone (TSH) and an absorption part in sequence, and between the end of the sample addition part and the absorption part
  • TSH thyroid-stimulating hormone
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • Immunok containing a nonionic surfactant comprising a polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer in the range of ⁇ 1.5
  • detection kit characterized in that it consists immunochromatographic device portion is provided containing Mato chromatographic reagent composition.
  • the seventh feature of the present invention is that the ratio of the oxyethylene repeating unit of the polyoxyethylene block having an alkyl group at one end to the buffer solution, the chelating agent, and the oxypropylene repeating unit of the polyoxypropylene block is a molar ratio.
  • Human chorionic gonadotropin (hCG) in a sample characterized in that it comprises a nonionic surfactant comprising a polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer in the range of 0.1 to 1.5, It is an immunochromatographic developing solution used for detecting a detection target selected from the group consisting of luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH) and thyroid stimulating hormone (TSH).
  • the eighth feature of the present invention is that the ratio of the oxyethylene repeating unit of the polyoxyethylene block having an alkyl group at one end to the buffer solution, the chelating agent, and the oxypropylene repeating unit of the polyoxypropylene block is a molar ratio.
  • a developing solution for immunochromatography containing a nonionic surfactant composed of a polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer in the range of 0.1 to 1.5 is used as a developing solution constituting a mobile phase. Detecting a detection target selected from the group consisting of human chorionic gonadotropin (hCG), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH) and thyroid stimulating hormone (TSH) in the sample. In the immunochromatography method.
  • the immunochromatographic reagent composition of the present invention contains a buffer solution, a chelating agent, and a nonionic surfactant, so that the details of the principle of its suppression mechanism are unknown when detecting a detection target in a sample.
  • a nonionic surfactant since non-specific reactions are suppressed, there is no decrease in sensitivity, and results can be accurately determined. For example, when detecting hCG in urine used as a specimen, a non-specific reaction is remarkably suppressed, so that there is no decrease in sensitivity and the result of a pregnancy test can be accurately determined.
  • providing the site containing the immunochromatography reagent composition of the present invention in the region of the immunochromatography device means that the immunochromatography reagent composition is placed in the region between the end of the sample addition unit and the absorption unit. It is applied, adsorbed or impregnated, and then supported, held or formed by drying.
  • the immunochromatography reagent composition is placed in the region between the end of the sample addition unit and the absorption unit. It is applied, adsorbed or impregnated, and then supported, held or formed by drying.
  • hCG in urine used as a specimen is detected.
  • the site containing the immunochromatographic reagent composition of the present invention is provided in the region of the immunochromatography apparatus, that is, in the region between the end of the sample addition unit and the absorption unit in the holding, holding or forming, Any place.
  • the site containing the immunochromatographic reagent composition of the present invention can be a sample addition part, a labeled substance holding part, or a part on the immunochromatography medium closer to the sample addition part than the detection part, but the position, size (width), concentration, etc. of the area part are its performance. Can be determined arbitrarily, and is within the scope of design matters.
  • the present inventors have used a reagent composition containing a buffer, a chelating agent and a nonionic surfactant as a reagent composition for immunochromatography. Hydrophobic binding between the mobile phase antibody and the porous carrier and electrical interaction between the mobile phase antibody and the stationary phase carrier are highly canceled by the interaction of the buffer, nonionic surfactant, and chelating agent, and further detected Stabilization of the substance and the labeled detection reagent, and stabilization of the complex due to the reaction between the detected substance and the labeled antibody are carried out by the synergistic action of the buffer, chelating agent and nonionic surfactant. By smoothing the movement as a mobile phase, non-specific reactions are remarkably suppressed, and the substance to be detected in the sample is highly sensitive. And the rapid detection / measurement which has led to the first time knowledge to complete to be able to.
  • the buffering agent which is one component in the reagent composition for immunochromatography of the present invention, has a fatal effect even when a sample is added, the concentration changes due to evaporation or dilution of the sample, or some foreign matter is mixed in from the outside. There is no particular limitation as long as it has no action (buffer action).
  • acetate buffer acetic acid + sodium acetate
  • phosphate buffer phosphate + sodium phosphate
  • citrate buffer citric acid + sodium citrate
  • borate buffer Tris-HCl buffer (Tris (hydroxylmethyl) aminomethane + hydrochloric acid)
  • TE buffer Tris + ethylenediaminetetraacetic acid
  • TAE buffer Tris + acetic acid + ethylenediaminetetraacetic acid
  • TBE buffer Tris + boric acid + ethylenediamine) Tetraacetic acid
  • HEPES buffer (2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid.
  • the chelating agent which is one component in the reagent composition for immunochromatography of the present invention is not particularly limited as long as it has an action capable of becoming a ligand having a plurality of coordination sites.
  • the chelating agent of the present invention is preferably an aminocarboxylic acid chelating agent.
  • the aminocarboxylic acid chelating agent of the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having an amino group capable of complexing with a heavy metal ion or an alkaline earth metal ion and a carboxylic acid functional group. Examples include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), and hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (HEDTA). More preferably, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is used.
  • Nonionic surfactants which are one component in the reagent composition for immunochromatography of the present invention include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene / polyoxypropylene alkyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester (trade name “ Tween ”series), polyoxyethylene pt-octylphenyl ether (trade name“ Triton ”series), polyoxyethylene pt-nonylphenyl ether (trade name“ Triton N ”series), alkylpolyglucoside, fatty acid diethanolamide And alkyl monoglyceryl ether.
  • a nonionic surfactant can be used individually or in mixture of 2 or more types.
  • polyoxyethylene / polyoxypropylene alkyl ether is preferably used as the nonionic surfactant that is one component in the reagent composition for immunochromatography of the present invention.
  • polyoxyethylene / polyoxypropylene alkyl ether is preferably used.
  • it is a polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer having an alkyl group at one end, and the alkyl group at one end may be linear or branched, preferably An alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, more preferably an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms.
  • Polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymers with hydroxyl groups at both ends inhibit the denaturation of contaminants such as glycoproteins that cause non-specific reactions, resulting in poor solubility and dispersibility in processing solutions Alternatively, because the electrostatic or hydrophobic affinity of the labeled antibody or the detection antibody cannot be controlled, the nonspecific reaction cannot be suppressed and an accurate determination cannot be made. In addition, in the case of an alkyl group at one end having more than 18 carbon atoms, formation of a complex due to the reaction between a detection target substance required for measurement and a labeled antibody is inhibited, and sufficient sensitivity cannot be obtained.
  • the ratio of the oxyethylene repeating unit of the polyoxyethylene block to the oxypropylene repeating unit of the polyoxypropylene block is preferably 0.1 to 1.5, preferably 0.15 to 1.1, in the molar ratio of the former to the latter. More preferred.
  • the alkyl group at one end is preferably bonded to the polyoxyethylene block. If the molar ratio of the above repeating units is less than 0.1, denaturation of contaminants such as glycoproteins that cause non-specific reactions is inhibited, and the solubility and dispersibility in the processing solution are reduced, or Non-specific reaction cannot be suppressed and accurate determination cannot be performed because the electrostatic or hydrophobic affinity with the labeled antibody or the detection antibody cannot be controlled. On the other hand, if the ratio exceeds 1.5, formation of a complex due to the reaction between the target substance to be measured and the labeled antibody is inhibited, and sufficient sensitivity cannot be obtained.
  • the content of the nonionic surfactant that is one component in the reagent composition for immunochromatography of the present invention is in the range of 0.01 to 10% by weight, preferably in the range of 0.05 to 5% by weight.
  • the reagent composition for immunochromatography If it is less than 0.05% by weight, a non-specific reaction cannot be suppressed and an accurate determination cannot be made. If it is 10% by weight or more, the concentration becomes higher than necessary, and it does not have a favorable influence on the suppression of the nonspecific reaction, and is not economical and wasted.
  • nonionic surfactant which is one component in the reagent composition for immunochromatography of the present invention, it is desirable to contain only a polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer having an alkyl group at one end.
  • other nonionic surfactants, ionic surfactants, and the like can be blended and used within a range that does not have an adverse effect.
  • the concentration of the buffering agent as one component in the immunochromatography reagent composition of the present invention is in the range of 0.01 to 250 mM, preferably in the range of 10 to 200 mM, and more preferably in the range of 30 to 180 mM.
  • concentration is lower than 0.01 mM, the buffering action is insufficient. If it is 250 mM or more, the concentration becomes higher than necessary, which is not economical and wasteful.
  • the immunochromatographic reagent composition of the present invention preferably contains no buffer other than Tris-HCl buffer. However, other buffering agents can be blended and used within a range not adversely affecting.
  • the concentration of the chelating agent as one component in the reagent composition for immunochromatography of the present invention is in the range of 0.01 to 10 mM, preferably in the range of 0.1 to 5 mM, and in the range of 0.5 to 2 mM. More preferred. If it is less than 0.01 mM, a nonspecific reaction cannot be suppressed and an accurate determination cannot be performed. If it is 10 mM or more, the concentration becomes higher than necessary, which is not economical and wasteful.
  • the reagent composition for immunochromatography of the present invention includes additives known to suppress side reactions based on biological affinity or to suppress nonspecific reactions, such as promotion of antigen-antibody reaction or nonspecificity.
  • Proteins eg bovine serum albumin, casein, gelatin, etc.
  • polymer compounds eg polyethylene glycol, methylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, dextran, etc.
  • ionic surfactants or polyanions For example, dextran sulfate, heparin, polystyrene sulfonic acid, chondroitin sulfate, etc.
  • one or more antibacterial agents can be added and used, and it is not hindered.
  • one or more of proteins, polymer compounds, ionic surfactants or polyanions, antibacterial agents, etc. for promoting these antigen-antibody reactions or suppressing nonspecific reactions are added to the stationary phase. It is possible and effective to keep it on the mobile phase of the mobile phase of the chromatographic medium to be constructed, and it does not prevent anything.
  • the components of the immunochromatographic reagent composition of the present invention may be applied to or impregnated into a sample pad (sample added portion) in an immunochromatography apparatus, and then dried. Depending on the method, the sample pad can be supported or held.
  • an additive holding part is provided at an arbitrary position between the end part of the sample addition part and the absorption part. It can be set as the aspect made to hold. For example, it can be on a sample addition part, a labeling substance holding part or an immunochromatography medium. In particular, an embodiment in which the sample is added or held only on the sample addition portion and / or the labeling substance holding portion is preferable.
  • the method of using the immunochromatography reagent composition of the present invention is not limited to the above method of use, and can be used as a developing solution or as a sample dilution.
  • a developing solution water is usually used as a solvent, and a buffer solution, a chelating agent, and a nonionic surfactant are added thereto. The order of addition is not particularly specified, and they can be added simultaneously.
  • the sample to be detected and the developing solution mixed in advance can be supplied and dropped on the sample pad (sample added portion), or the sample can be developed first. After supplying / dropping on the addition part), the developing solution may be supplied / dropping on the sample pad (sample addition part) for development.
  • the diluted solution obtained by diluting the sample can be used by supplying and dropping it as a developing solution on the sample pad (sample added portion) as it is.
  • a sample including the detection target of the present invention
  • a biological sample that is, blood, serum, plasma, urine, saliva, spinal fluid, sweat, tears, amniotic fluid, nipple discharge, nasal discharge, sputum
  • examples include nasal cavity or pharyngeal wiping solution, exudate from skin, extracts from tissues and cells and feces, and the like.
  • the detection target of the present invention is not particularly limited as long as a substance that specifically binds to it, such as an antigen-antibody reaction, exists or can be produced. Even if the object to be detected is an antigenic substance such as a complete antigen, or an antigenic substance such as a hapten (incomplete antigen) is not an antigenic substance, it can be made to be antigenic by making it a chemically modified product. It may be something that you have. Any substance that specifically binds to or can be produced by these detection targets may be used, and a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be used.
  • Examples of the detection target of the present invention include peptide hormones (growth hormone (GH), adrenocorticotropic hormone (ACTH), melamine cell stimulating hormone (MSH), prolactin, thyroid stimulating hormone (TSH), luteinizing hormone (LH).
  • GH growth hormone
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • MSH melamine cell stimulating hormone
  • TSH thyroid stimulating hormone
  • LH luteinizing hormone
  • FSH Follicle stimulating hormone
  • PAP prostatic acid phosphatase
  • PSA Prostate specific antigen
  • alkaline phosphatase transaminase
  • trypsin pepsinogen
  • ⁇ -fetoprotein AFP
  • cancer specific substance such as carcinoembryonic antigen (CEA)
  • serum protein component such as immunoglobulin G (IgG)
  • rheumatism Factor cello Natural follicle hormones such as nin, urokinase, ferritin, substance P, estrone, fecal occult blood, syphilis antibody, influenza virus, adenovirus, rotavirus, HBs antigen, HBs antibody, chlamydia antigen, group A ⁇ -streptoco
  • male hormones such as testosterone, corticosteroids such as cortisol, cholesterol, bile acids, cardiotonic steroids, other steroids such as sapogenin, epinephrine, dopamine, bioactive alkaloids, amino group-containing psychotropic drugs , Low molecular weight peptides such as TRH, thyroid hormones such as diiodothyronine, prostaglandins, vitamins, antibiotics such as penicillin, other in vivo components, drugs administered in vivo and metabolites thereof
  • the detection object human chorionic gonadotropin (hCG), luteinizing hormone (LH), follicle stimulating hormone (FSH), used thyroid stimulating hormone (TSH), used especially hCG is more preferable.
  • the substance to be detected detected from the specimen is hCG secreted by the pregnant woman from the placenta and excreted in the urine.
  • the reagent composition for immunochromatography of the present invention is particularly effective for a urine sample, and is suitably used for detecting a substance to be detected with higher sensitivity while suppressing nonspecific reaction due to impurities in urine.
  • An immunochromatography apparatus for detecting hCG excreted in urine has a known structure and operation / detection technique.
  • a reaction that specifically binds using, for example, an immunochromatography apparatus in which the reagent composition for immunochromatography of the present invention is supported in a sample pad of a conventional immunochromatography apparatus, for example, impregnated and dried, for example, an antigen antibody By the reaction, it is possible to inspect the object to be detected in the sample, for example, identification / quantification of hCG in urine.
  • the sample addition part (1) in FIG. 1 is composed of a porous sheet having such a property that the sample is rapidly absorbed, but the holding power is weak, and the sample quickly moves to the reaction part.
  • the porous sheet include cellulose filter paper, glass filter paper, polyurethane, polyacetate, cellulose acetate, nylon, and cotton cloth.
  • glass filter paper is preferably used.
  • the sample pad (1) in order to suppress non-specific reaction, is pre-impregnated with a reagent composition for immunochromatography containing a buffer, a chelating agent, and a nonionic surfactant, It is possible to adopt a mode in which it is supported by a means such as drying.
  • a reagent composition for immunochromatography containing each component of Tris-HCl buffer, EDTA, and a polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer having an alkyl group at one end are supported or held in advance. It can be set as an aspect.
  • the labeling substance holding part (2) carries or holds a labeling reagent in which the reagent component is labeled with the labeling component.
  • labeling components include metal colloidal particles such as gold colloidal particles and silver colloidal particles, colored latex particles obtained by dyeing synthetic polymers synthesized by (co) polymerization of various monomers, enzymes, fluorescent compounds, etc. Can be used.
  • the reagent component is a particle or molecule capable of recognizing an analyte, preferably a monoclonal antibody, a polyclonal antibody or a fragment thereof (second reagent).
  • the chromatographic medium (3) is one in which the detection site (4) is created on the membrane carrier.
  • the membrane carrier is not particularly limited as long as it can absorb and move the sample specimen by capillary action.
  • nitrocellulose, cellulose acetate, nylon, polyethersulfone, polyvinyl alcohol, polyester, glass fiber, polyolefin, cellulose, or an artificial polymer composed of a mixed fiber thereof is selected.
  • a monoclonal antibody or a polyclonal antibody or a fragment thereof (first reagent) is supported and fixed on a nitrocellulose sheet.
  • a material having the ability to quickly absorb an excessive sample, glass filter paper, or the like is used.
  • the backing sheet (6) is a base material.
  • the backing sheet (6) is not particularly limited as long as the backing sheet (6) becomes impermeable and impermeable to the sample solution by the adhesive.
  • One or both of the reagent component (first reagent) used for the detection unit (4) and the reagent component (second reagent) used for the labeling reagent may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. In consideration of manufacturing costs and stable supply of antibodies while maintaining specificity, at least one of them is preferably a polyclonal antibody.
  • the reagent component (second reagent) used for the labeling reagent is more preferably a monoclonal antibody having high specificity in terms of measurement sensitivity and the like, and the reagent component (first reagent) used for the detection unit (4) is a polyclonal antibody. Is more preferable.
  • Monoclonal antibodies and polyclonal antibodies or fragments thereof are known and available, and can be prepared by known methods.
  • Examples of antibody-producing animal species include humans, mice, rats, rabbits, goats, and the like.
  • the immunoglobulin may be IgG, IgM, IgA, IgE, or IgD.
  • a monoclonal antibody hybridizes spleen cells and osteosarcoma cells of a mouse immunized with an antigen (hCG), selects a hybridoma that produces the target antibody, and selects a monoclonal antibody produced from this hybridoma. To gain. See, for example, the Koehler and Milstein technique (Nature 256 (1975) 495-497).
  • Polyclonal antibodies are obtained by isolating a target antibody from antiserum obtained by immunizing an animal (eg, human, mouse, rat, rabbit, goat, horse, etc.) with an antigen (hCG) by a conventional method. can get.
  • an animal eg, human, mouse, rat, rabbit, goat, horse, etc.
  • an antigen hCG
  • HCG is a 36.7 kDa glycoprotein consisting of 237 amino acids.
  • hCG has an ⁇ -subunit and a ⁇ -subunit.
  • the ⁇ -subunit is the same as luteinizing hormone (LH), follicle-stimulating hormone (FSH), and thyroid-stimulating hormone (TSH), which are proteins similar to hCG, but the ⁇ -subunit is unique to hCG. Is unique.
  • the reagent component (first reagent) used for the detection site (4) and the reagent component (second reagent) used for the labeling reagent include anti-hCG ⁇ antibody or anti-antibody having a reaction binding site in the ⁇ -subunit or ⁇ -subunit, respectively.
  • Either hCG ⁇ antibody can be used, but when one uses an anti-hCG ⁇ antibody, the other uses an anti-hCG ⁇ antibody.
  • the reagent component (second reagent) used for the labeling reagent an anti-hCG ⁇ antibody having a reaction binding site in the ⁇ -subunit is more preferably used from the viewpoint of reaction efficiency.
  • the reagent component (first reagent) used for the detection site (4) it is more preferable to use an anti-hCG ⁇ antibody having a reaction binding site in the ⁇ -subunit.
  • luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone, and thyroid-stimulating hormone have the same ⁇ -subunit as that of hCG and have similar structures as antigens. Similar effects can be expected when the detection system is applied.
  • a predetermined amount (usually 0.1 to 2 ml) of a sample for example, female urine
  • the immunochromatographic reagent composition carried, held, or formed in the sample pad (1) is dissolved in the moisture of the sample and starts moving together with the sample.
  • the sample in which the reagent composition for immunochromatography is dissolved first moves to the labeling substance holding part (2).
  • the labeling reagent (second reagent) held in the labeling substance holding part (2) is dissolved in the moisture of the sample and moves together with the sample.
  • the labeling reagent dissolved in the moisture of the sample passes through the detection site (4) on the chromatography medium (3).
  • the non-specific binding reaction is suppressed by the immunochromatographic reagent composition dissolved in the sample.
  • the detection site (4) is colored by specifically reacting and binding to the detection site (4), that is, sandwiched between the supported and immobilized antibody and the labeling reagent.
  • the detection part (4) Since the binding reaction does not occur, the detection part (4) is not colored. 4). Finally, the moisture in the sample moves to the absorption site (5). Thus, the presence or absence of pregnancy can be accurately determined by examining the presence or absence of hCG in a sample, for example, urine.
  • the reagent composition for immunochromatography is impregnated or coated in the sample pad (1), and then dried, supported or held or formed, the sample and the reagent composition for immunochromatography are mixed in advance, and the developing solution As described above, by dropping / supplying onto the sample pad (1), the same inspection as described above can be performed, and the same result as above can be achieved.
  • the above immunochromatographic reagent composition is used as a sample diluent, and the detection unit (4
  • the reagent component (first reagent) used for the reagent and the reagent component (second reagent) used for the labeling reagent were collected approximately 100 times by using the anti-influenza virus monoclonal antibody and the sample collected by the above immunochromatographic reagent composition.
  • the sample is diluted to 150 ⁇ L and dropped / supplied onto the sample pad (1) and developed, the same test as described above can be performed, and the same result as described above can be achieved.
  • the colloidal labeling reagent was well dispersed using an ultrasonic crusher, and then centrifuged at 8000 ⁇ g for 15 minutes. The supernatant was removed, the phosphate buffer solution was added, and the mixture was well dispersed with an ultrasonic crusher to obtain a labeling reagent solution.
  • Test example 1 A sample pad was impregnated with 150 ⁇ L of diluted specimen solution added to a Tris-HCl buffer (pH 8.0) 33 mM, MN811 0.1%, EDTA 0.56 mM, and then dried. And the evaluation was measured. The results are shown in Table 2.
  • Test example 2 In place of MN811 in Test Example 1, a sample pad was impregnated with the same method except that Tween 20 was 0.1%, and dried, and the evaluation was measured. The results are shown in Table 2.
  • Test example 3 A sample pad was impregnated with 150 ⁇ L of diluted specimen solution so that it was adjusted to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.15% MN811 and 0.83 mM EDTA, and then dried. And the evaluation was measured. The results are shown in Table 2.
  • Test example 4 A sample pad was impregnated with 150 ⁇ L of diluted specimen solution added to a concentration of 33 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) 33 mM, MN811 0.05%, Tween 20 0.05%, EDTA 0.56 mM. A dried product was prepared and its evaluation was measured. The results are shown in Table 2.
  • Test Example 5 A sample pad was impregnated with 150 ⁇ L of diluted specimen solution to which Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) 33 mM, MN811 0.3%, EDTA 1.6 mM was added, and then dried. And the evaluation was measured. The results are shown in Table 2.
  • Test Example 6 Similarly, Table 2 shows the measurement results for those added to Tris-HCl buffer (pH 8.0) 100 mM, MN811 0.3%, and EDTA 1.6 mM.
  • Test Example 7 Similarly, Table 2 shows the measurement results of the tris-HCl buffer (pH 8.0) added to 167 mM, Tween 20 0.10%, MN811 0.20%, and EDTA 1.6 mM.
  • Test Example 8 The same determination was made when 55 mM 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES buffer) was used instead of the Tris-HCl buffer in Test Example 7. The test results are shown in Table 2. Suppression of false positives was confirmed at the time of 5 minutes, but false positives were confirmed over time at the concentration of 55 mM HEPES buffer.
  • the sample pad is pre-impregnated with a nonionic surfactant having an alkyl group at one end with a tris-HCl buffer, EDTA, and a polyoxyethylene / polyoxypropylene block copolymer. It has been found that can be suppressed.
  • nonion MN811 nonion MN811
  • molar ratio of oxypropylene / oxyethylene The measurement was performed in the same manner except that the molar ratio was 0.15). It is possible to achieve substantially the same object as Table 1, Table 2, and Table 3.
  • the measurement was performed in the same manner as in the above test example, except that nitrilotriacetic acid (NTA) was used instead of EDTA.
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • Buffering agent Nonionic surfactant Chelating agent (1) Acetate buffer MN811 NTA (2) Phosphate buffer solution Adekatol LB-53B EDTA (3) Tris-HCl buffer nonionic TA-411 ASDA
  • the detection kit of the present invention suppresses non-specific reactions and can specifically detect hCG in urine, it has industrial applicability that a pregnancy test can be performed by measuring hCG quickly and easily. .
  • Sample pad 2 Labeling substance holding part 3 Chromatography medium 4 Detection part 5 Absorption part 6 Backing sheet

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Abstract

【課題】免疫クロマトグラフィー装置を用いて検出対象物を検出する従来技術に比して、非特異的反応を抑制することができるイムノクロマトグラフィー用試薬組成物、もしくは試料希釈液の提供、およびそれを用いた、高性能、高感度な免疫クロマトグラフィー装置ならびに迅速、簡便な検査ができる検出キットを提供する。 【解決手段】　イムノクロマトグラフィー法により試料中の検出対象物を検出する際に、緩衝液、キレート剤、および非イオン界面活性剤を含有するイムノクロマトグラフィー用試薬組成物またはイムノクロマトグラフィー用展開液もしくはイムノクロマトグラフィー用試料希釈液を用いることにより非特異的反応を抑制することができる。

Description

イムノクロマトグラフィー用試薬組成物
　本発明は、非特異的反応を抑制する高性能、高感度なイムノクロマトグラフィー用試薬組成物又はイムノクロマトグラフィー用展開液に関する。さらに、本発明は、非特異的反応を抑制して、迅速、簡便に試料中の検出対象物を検査／測定ができる検出キットおよび検査法に関するものである。さらに詳しくは、この検出キットは、検出試料の前処理を行うこと無く、直接この検出キットの試料添加部に検出試料を供給することによって、迅速、簡便および高精度に検査ができる検出キットに関する。
　近年、検出試料の前処理を行う必要の無い、免疫クロマトグラフィー用ストリップ形式のイムノアッセイは、抗体の持つ特異的反応性を利用して、試料液中の抗原を検出する簡便な体外診断キットもしくは携帯用診断装置として重要性が高まっている。特に、妊娠検査キットは、一般用医薬品としても販売されている身近な免疫クロマトグラフィー装置である。妊娠した女性の尿中には、胎盤から分泌されるｈＣＧが排泄されてくるので、この尿中のｈＣＧと特異的に反応する抗体を利用して検出する免疫クロマトグラフィー装置の研究が進められてきた。
　ところで、検出試料が尿である場合、尿中には多様な成分が含有され、さらに組成や比重にも相違があるため、免疫化学結合に少なからず影響を与え、免疫化学結合を利用するアッセイ法による結果の正確さを左右する妨害因子となっている。これらの妨害因子の影響を最小化するために、補正手段を種々組み入れた対処が行なわれている（特許文献１参照）。
　また、高速液体クロマトグラフィー法によって検体中のヘモグロビンを測定する際に、ヘモグロビンの変性を防止する目的で、エチレンジアミンテトラ酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」と略す）・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・３Ｋ、ジエチレントリアミン五酢酸（以下、「ＤＴＰＡ」と略す）などのキレート化剤を添加する技術が公知である（特許文献２参照）。
　しかしながら、糞便等の試料中に含まれるヘモグロビンの安定化に対して、ＥＤＴＡは十分な安定化作用が期待できないことが確認されており、単なるＥＤＴＡのみよりも遷移金属イオンの水溶性金属錯体を使用した方が、安定化効果が高いことが知られている（特許文献３参照）。
　さらに、イムノクロマトグラフィー法によって検体中のヘモグロビンを測定する際に、感作金属コロイド試薬溶液に鉄イオン、銅イオン、または鉛イオンから選ばれる金属イオンとキレート化剤からなる物質を安定化剤として配合する方法が知られている（特許文献４参照）。
　一方で、従来から免疫クロマトグラフィー装置において、バックグラウンド着色（判定部の固定相抗体以外の部分の着色）およびブランク発色（検出物質が存在しない場合での固定化相の発色）が、検出時のＳＮ比を下げるだけでなく、誤動作の原因にもなるため問題視されていた。バックグラウンド着色は、可視化された移動相抗体と多孔質担体との疎水的な結合が原因であり、また、ブランク発色は、負電荷を帯びた移動相抗体と正電荷を帯びた固定相担体との電気的相互作用が原因であるとされている。この対策として、検出片を構成する多孔質担体の試料導入部から判定部までの間に添加剤含浸部を設けて、そこに疎水結合や電気的相互作用を打ち消す効果のある物質、例えば界面活性剤、アンモニウム塩、およびｐＨ緩衝剤の少なくとも１種を担持させた免疫クロマトグラフィー装置が開示されている（特許文献５参照）。
　また、ｐＨ緩衝剤などを含む展開液を用いる免疫クロマトグラフィー検出方法において、生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、非特異反応を抑制するために種々の添加剤を使用しており、例えば、抗原抗体反応の促進あるいは非特異反応の抑制のための蛋白質（例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ－１００等）、イオン性界面活性剤又はポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸等）若しくはその塩等が、添加剤として挙げられている（特許文献６参照）。
　しかしながら、バックグラウンド着色およびブランク発色などの対策、さらには生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、非特異反応を抑制するための対策などに用いられている界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ－１００等）、イオン性界面活性剤又はポリアニオンが挙げられてきてはいるものの、未だ十分に目的が達成されず、依然として非特異反応を抑制できないという同様な問題があった。
　本発明者等は、上記の非イオン性界面活性剤（例えば、ツイーン２０、トリトンＸ－１００等）、イオン性界面活性剤又はポリアニオンの中でも、特に非イオン性界面活性剤に着目して、実験を行なった結果、試料中の検出対象物をイムノクロマトグラフィー法により検出する際、非特異反応が依然として起こることを観察しており、非特異反応を十分に抑制できないという課題が依然としてあった。
特表２００７－５２６４４３号公報 特開平２－２２１８５９号公報 特開平７－２２９９０２号公報 特開２０００－１４６９６７号公 特開平１１－１５３６０１号公報 特開２００７－３２２３１０号公報
　本発明は、従来技術に比して、非特異的反応を抑制する高性能、高感度なイムノクロマトグラフィー用試薬組成物又はイムノクロマトグラフィー用展開液を提供することにある。また、従来技術に比して、非特異的反応を抑制して、迅速、簡便および高精度に検査ができるイムノクロマトグラフィー装置を提供することにある。例えば、尿中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）と特異的に反応して迅速、簡便な妊娠検査ができる免疫クロマトグラフィー装置を提供することにある。
　さらに、試料の前処理を行うこと無く、試料を直接この検出キットの試料添加部に供給することによって、非特異的反応を抑制して、試料中の検出対象物と特異的に反応して迅速、簡便、高精度に検査ができる検出キットを提供することにある。例えば、尿を直接この検出キットの試料添加部に供給することによって、迅速、簡便および高精度に妊娠検査ができる検出キットを提供することにある。
また、本発明は、非特異的反応を抑制して、試料中の検出対象物をイムノクロマトグラフィー法により検出する方法に関する。
　本発明は、下記の（ａ）～（ｊ）のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物、イムノクロマトグラフィー用展開液、それを用いたイムノクロマトグラフィー装置およびイムノクロマトグラフィー法ならびに検出用キットを提供するものである。
（ａ）本発明の第１の特徴は、緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むことを特徴とする試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する為のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物にある。
（ｂ）本発明の第２の特徴は、キレート剤が、アミノカルボン酸系キレート剤である上記（a）に記載のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物にある。
（ｃ）本発明の第３の特徴は、緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むことを特徴とする試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する為のイムノクロマトグラフィー用試料希釈組成物にある。
（ｄ）本発明の第４の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体部、試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する検出部および吸収部から実質的に順次構成されており、且つ試料添加部の端部と吸収部との間のいずれかの領域部に、緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を含む部位が設けられていることを特徴とするイムノクロマトグラフィー装置にある。
（ｅ）本発明の第５の特徴は、キレート剤が、アミノカルボン酸系キレート剤である上記（ｄ）に記載のイムノクロマトグラフィー装置にある。
（ｆ）本発明の第６の特徴は、試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体部、試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する検出部および吸収部から実質的に順次構成されており、且つ試料添加部の端部と吸収部との間のいずれかの領域部に、緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を含む部位が設けられているイムノクロマトグラフィー装置からなることを特徴とする検出キットにある。
（ｇ）本発明の第７の特徴は、緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むことを特徴とする試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ），黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する為に用いるイムノクロマトグラフィー用展開液にある。
（ｈ）本発明の第８の特徴は、緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むイムノクロマトグラフィー用展開液を、移動相を構成する展開液として使用して、試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフィー法にある。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物は、緩衝液、キレート剤、および非イオン界面活性剤を含むことにより、試料中の検出対象物を検出する際に、その抑制機構の原理の詳細は不明であるが、非特異反応を抑制するため、感度の低下がなく、正確に結果の判定が可能である。例えば、検体として用いる尿中のｈＣＧを検出する際に、非特異反応を顕著に抑制するため、感度の低下がなく、正確に妊娠検査の結果の判定が可能である。
　また、本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を含む部位をイムノクロマトグラフィー装置の領域部内に設けるとは、試料添加部の端部と吸収部との間の領域内にイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を、塗布、吸着もしくは含浸させて後、乾燥させることによって担持または保持もしくは形成させるものである。例えば、イムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド（試料添加部分）中へ前記試薬組成物を塗布または含浸させた後、乾燥させたイムノクロマトグラフィー装置にあっては、例えば、検体として用いる尿中のｈＣＧを検出する際に、試料である尿の前処理を行う必要が無く、尿を直接この検出キットの試料添加部に供給することによって、非特異的反応を抑制して、尿中のｈＣＧと特異的に反応して迅速、簡便な妊娠検査ができるという特徴を有する。本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を含む部位をイムノクロマトグラフィー装置の領域部に設ける、即ち、担持または保持もしくは形成させるにおいては、試料添加部の端部と吸収部との間の領域部であれば任意の場所とすることができる。例えば、試料添加部分、標識物質保持部やもしくはイムノクロマトグラフィー媒体上で検出部より試料添加部側に近い部分とすることもできるが、領域部の位置、大きさ（幅）、濃度などはその性能を考慮して、任意に決めることができるものであり、設計事項の範囲内である。
イムノクロマトグラフィー装置の試験片の概略図
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明者等は、免疫クロマトグラフィー装置において、鋭意研究を重ねた結果、イムノクロマトグラフィー用試薬組成物として緩衝剤、キレート剤および非イオン性界面活性剤を含有する試薬組成物を使用することにより、移動相抗体と多孔質担体との疎水結合や移動相抗体と固定相担体との電気的相互作用を、緩衝剤、非イオン性界面活性剤及びキレート剤の相互作用によって高度に打ち消し、さらに被検出物質や標識化した検出試薬の安定化、並びに被検出物質と標識抗体との反応による複合体の安定化が緩衝剤、キレート剤及び非イオン性界面活性剤の相乗作用によってなされると同時にそれらの移動相としての移動をスムーズにする作用を果たすことにより、非特異反応を極めて顕著に抑制して、試料中の被検出物質を特異的に高感度かつ迅速に検出／測定が出来ることを初めて知見し完成に至ったものである。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中の１成分である緩衝剤としては、試料の添加や試料の蒸発や希釈による濃度の変化、外部からの多少の異物の混入によっても致命的な影響を生じない作用（緩衝作用）を持つものであれば特に制限はない。
　本発明において、緩衝剤としては、酢酸緩衝液（酢酸＋酢酸ナトリウム）、リン酸緩衝液（リン酸＋リン酸ナトリウム）、クエン酸緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム）、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液（トリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン＋塩酸）、ＴＥ緩衝液（トリス＋エチレンジアミン四酢酸）、ＴＡＥ緩衝液（トリス＋酢酸＋エチレンジアミン四酢酸）、ＴＢＥ緩衝液（トリス＋ホウ酸＋エチレンジアミン四酢酸）又はＨＥＰＥＳ緩衝液（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルフォン酸）等が挙げられる。好ましくは、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などであり、より好ましくは、トリス塩酸緩衝液である。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中の１成分であるキレート剤としては、複数の配位座を持つ配位子となり得る作用をもつであれば特に制限はない。
　本発明において、キレート剤としては、エチレンジアミン、ジピリジン、エチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」という）、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・３Ｎａ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ、ＥＤＴＡ誘導体（例えば、ＥＤＴＡ・２ＮＨ４、ＥＤＴＡ・３Ｋ、ＥＤＴＡ・特殊アミン塩等）、ＥＤＴＡ金属塩（例えば、ＥＤＴＡ・Ｃａ・２Ｎａ等）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）系、ジヒドロキシエチルエチレンジアミン二酢酸（ＤＨＥＤＤＡ）系、１，３－プロパンジアミン四酢酸（１，３ＰＤＴＡ）系、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）系、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）系、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）系、グルコン酸系、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）系、Ｌ－アスパラギン酸－Ｎ、Ｎ－二酢酸（ＡＳＤＡ）系、アミノトリメチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）系、ヒドロキシエタンホスホン酸（ＨＥＤＰ）系、３－ヒドロキシ－２，２’－イミノジコハク酸４ナトリウム、フェナントロリン、ポルフィリン、クラウンエーテル等が挙げられる。
　本発明のキレート剤としては、好ましくは、アミノカルボン酸系キレート剤である。
　本発明のアミノカルボン酸系キレート剤としては、重金属イオンやアルカリ土類金属イオンと錯化可能なアミノ基とカルボン酸官能基を有する化合物であれば特に限定されるものではない。例えば、上記したエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）等が挙げられる。より好ましくは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いる。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中の１成分である非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ－ｔ－ノニルフェニルエーテル（商品名「ＴｒｉｔｏｎＮ」シリーズ）、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテル等を挙げることができる。非イオン性界面活性剤は、単独でも２種以上を混合しても用いることが出来る。
本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中の１成分である非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンアルキルエーテルが好適に用いられる。詳しくは、片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体であって、片末端のアルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよく、好ましくは炭素数１～１８のアルキル基であり、より好ましくは炭素数１０～１８のアルキル基である。両末端が水酸基のポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体では、非特異的反応の要因となる糖タンパク質等の夾雑物の変性が阻害される、処理液中への可溶性や分散性が落ちる、あるいは標識抗体や検出抗体との静電的または疎水結合的な親和力を制御できないなどの理由のため、非特異的反応を抑制できず正確な判定が行なえない。また、炭素数１８を超える片末端のアルキル基の場合では、測定に必要な被検出物質と標識抗体との反応による複合体生成が阻害され、十分な感度が得られないため適当でない。さらに、ポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合は、前者対後者のモル比で０．１～１．５が好ましく、０．１５～１．１がより好ましい。片末端のアルキル基は、ポリオキシエチレンブロックに結合しているのが好ましい。前述の繰り返し単位のモル比が０．１未満では、非特異的反応の要因となる糖タンパク質等の夾雑物の変性が阻害される、また、処理液中への可溶性や分散性が落ちる、あるいは標識抗体や検出抗体との静電的または疎水結合的な親和力を制御できないなどの理由のため、非特異的反応を抑制できず正確な判定が行なえない。また、１．５を超えると測定に必要な被検出物質と標識抗体との反応による複合体生成が阻害され、十分な感度が得られないため適当でない。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中の１成分である非イオン性界面活性剤の含有量としては、０．０１～１０重量％の範囲であり、好ましくは０．０５～５重量％の範囲でイムノクロマトグラフィー用試薬組成物に含有させることができる。０．０５重量％未満では、非特異的反応を抑制できず正確な判定が行なえない。１０重量％以上では、必要以上の濃度となり、非特異的反応の抑制には好ましい影響を与えることがないばかりか、経済的でなく無駄となる。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中の１成分である非イオン性界面活性剤としては、片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体のみを含有させることが望ましい。しかしながら、悪影響を及ぼさない範囲内においてその他の非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤などを配合して使用することも可能である。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中の１成分である緩衝剤の濃度としては、０．０１～２５０ｍＭの範囲であり、１０～２００ｍＭの範囲が好ましく、３０～１８０ｍＭの範囲がより好ましい。濃度が０．０１ｍＭより低くなると緩衝作用が不十分になる。２５０ｍＭ以上では、必要以上の濃度となり経済的でなく無駄となる。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物は、トリス塩酸緩衝剤以外の緩衝剤を含有しないことが望ましい。しかしながら、悪影響を及ぼさない範囲内においてその他の緩衝剤を配合して使用することもできる。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物中の１成分であるキレート剤の濃度としては、０．０１～１０ｍＭの範囲であり、０．１～５ｍＭの範囲が好ましく、０．５～２ｍＭの範囲がより好ましい。０．０１ｍＭ未満では、非特異的反応を抑制できず正確な判定が行なえない。１０ｍＭ以上では、必要以上の濃度となり経済的でなく無駄となる。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物には、生物学的親和性に基づく副反応を抑制したり、非特異的反応を抑制することが公知の添加剤、例えば、抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するための蛋白質（例えば、牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン等）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、デキストラン等）、イオン性界面活性剤又はポリアニオン（例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン、ポリスチレンスルホン酸、コンドロイチン硫酸等）、あるいは、抗菌剤等々の１種もしくは２種以上を添加して使用することも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。また、これらの抗原抗体反応の促進あるいは非特異的反応を抑制するための蛋白質、高分子化合物、イオン性界面活性剤又はポリアニオン、あるいは、抗菌剤等々の１種もしくは２種以上を、固定相を構成するクロマトグラフィー媒体上の、移動相の移動経路上に保持させておくことも可能かつ有効であって、何ら妨げるものではない。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物の成分をイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を含む部位を設ける方法としては、例えば、イムノクロマトグラフィー装置におけるサンプルパッド（試料添加部分）中へ塗布又は含浸させた後、乾燥させる方法により、サンプルパッド中へ担持または保持させる態様とすることができる。本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物をイムノクロマトグラフィー媒体上に担持させる他の態様としては、試料添加部の端部と吸収部との間の任意の場所に、添加剤保持部を設けて、そこに保持させる態様とすることができる。例えば、試料添加部分、標識物質保持部やイムノクロマトグラフィー媒体上とすることもできる。なかでも試料添加部分および／または標識物質保持部位のみに担持または保持させる態様が好ましい。
　本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物の使用方法としては、上記の使用方法に限定されるものではなく、展開液として用いることもできるし、試料の希釈液としても使用することができる。展開液としては、通常、溶媒として水を用い、これに緩衝液、キレート剤、および非イオン界面活性剤を加える。加える順序は特に特定されず、同時に加えても差支えない。展開液として用いる場合には、検出する試料と展開液を予め混合したものを、サンプルパッド（試料添加部分）上に供給・滴下して展開させることもできるし、先に試料をサンプルパッド（試料添加部分）上に供給・滴下して後、展開液をサンプルパッド（試料添加部分）上に供給・滴下して展開させてもよい。試料希釈液として使用する場合には、試料を希釈した希釈液は、そのまま展開液としてサンプルパッド（試料添加部分）上に供給・滴下することにより使用できる。
　本発明の検出対象物を含む試料（検体）としては、例えば、主として生体試料、即ち、血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液、汗、涙、羊水、乳頭分泌液、鼻汁、痰、鼻腔又は咽頭拭い液、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び糞便からの抽出物等々が挙げられる。
　本発明の検出対象物としては、それと特異的に結合する、例えば、抗原－抗体反応のように特異的に結合する物質が存在するもしくは製造できるものであればよく、特に限定されない。検出対象物が完全抗原といったそれ自体が抗原性を有するものであっても、もしくはハプテン（不完全抗原）といったそれ自体が抗原性を有しなくても化学的変成物とすることにより抗原性を持つに至るものであってもよい。これらの検出対象物と特異的に結合する物質が存在するもしくは製造できるものであればよく、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体とすることができる。本発明の検出対象物を例示すれば、ペプチドホルモン（成長ホルモン（ＧＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、メラミン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、下垂体ホルモン、カルシユウム代謝調節ホルモン、膵ホルモン、消化管ホルモン、血管作用ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）等の胎盤ホルモン、前立腺性酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、アルカリ性フォスファターゼ、トランスアミナーゼ、トリプシン、ペプシノーゲン、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）等のガン特異物質、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）等の血清蛋白成分、リュウマチ因子、セロトニン、ウロキナーゼ、フェリチン、サブスタンＰ、エストロン等の卵胞ホルモン、便潜血、梅毒抗体、インフルエンザウィルス、アデノウィルス、ロタウィルス、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、プロゲストロン等の天然又は合成黄体ホルモン、テストステロン等の男性ホルモン、コルチゾール等の副腎皮質ホルモン、コレステロール、胆汁酸、強心性ステロイド、サポゲニン等のその他のステロイド類、エピネフリン、ドーパミン、生理活性アルカロイド類、アミノ基含有向精神薬類、ＴＲＨ等の低分子ペプチド類、ジヨードサイロニン等の甲状腺ホルモン類、プロスタグランジン類、ビタミン類、ペニシリン等の抗生物質類、その他生体内成分、生体内投与薬物およびその代謝産物等が挙げられる。好ましい検出対象物としては、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）が用いられ、特にｈＣＧがより好ましく用いられる。
　本発明の検体として尿を用いた場合は、尿は、何ら処理を施す必要がないので、イムノクロマトグラフィー装置におけるサンプルパッド上に供給／滴下するだけでよい。そのため、簡便であって、誰にでも何処にあっても、例えば、在宅でも妊娠検査が可能である。この場合に、検体から検出する被検出物質としては、妊娠した女性が胎盤から分泌して、尿中に排泄されたｈＣＧである。本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物は、尿検体に特に有効であり、尿中の夾雑物による非特異的反応を抑制しつつより高い感度での被検出物質の検出に好適に用いられる。
　尿中に排泄されたｈＣＧを検出するためのイムノクロマトグラフィー装置は、その構造およびその動作・検出手法は公知である。
　従来のイムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド中へ本発明のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を担持させた、例えば、含浸後、乾燥させたイムノクロマトグラフィー装置を用いて、特異的に結合する反応、例えば、抗原抗体反応により試料中の検出対象物、例えば、尿中のｈＣＧ等の同定・定量等の検査をすることができる。
　図１の試料添加部（１）は、試料が迅速に吸収されるが、保持力は弱く、速やかに反応部へと試料が移動していくような性質の多孔質シートで構成されている。多孔質シートとしては、セルロース濾紙、ガラス濾紙、ポリウレタン、ポリアセテート、酢酸セルロース、ナイロン、綿布等が挙げられる。本発明の多孔質シートとしては、ガラス濾紙が好ましく用いられる。本発明においては、非特異的反応を抑制するために、サンプルパッド（１）中に、緩衝液、キレート剤、および非イオン界面活性剤を含むイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を予め含浸させて後、乾燥させる等の手段により担持させる態様とすることができる。例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＤＴＡ、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体の各成分を含有するイムノクロマトグラフィー用試薬組成物の成分を予め担持または保持させておく態様とすることができる。
　標識物質保持部（２）には、標識成分によって試薬成分を標識した標識試薬を担持または保持させてなる。標識成分としては、金コロイド粒子、銀コロイド粒子等の金属コロイド粒子、各種のモノマーを（共）重合させて合成した合成高分子を染色して得られる着色ラテックス粒子、酵素、蛍光化合物、その他を用いることができる。試薬成分としては、分析物を認識する能力を有する粒子又は分子であり、好ましくはモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントである（第二試薬）。
　クロマトグラフィー媒体（３）は、膜担体上に検出部位（４）を作成したものである。膜担体としては、毛細管現象により試料検体を吸収し移動させることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる人工ポリマーからなる群から選択される。検出部位（４）には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体若しくはそのフラグメント（第一試薬）が、ニトロセルロースのシート上に担持固定されている。
　吸収部（５）は、過剰の試料を迅速に吸収する能力を有する材料、ガラス濾紙等が用いられる。
　バッキングシート（６）は、基材である。片面に粘着剤を塗布したり、粘着テープを貼り付けることにより、片面が粘着性を有し、該粘着面上に試料添加部（１）、標識物質保持部（２）、クロマトグラフィー媒体（３）、検出部（４）、および吸収部（５）の一部または全部が密着して設けられている。バッキングシート（６）は、粘着剤によって試料液に対して不透過性、非透湿性となるようなものであれば、基材としては、特に限定されない。
　検出部（４）に用いる試薬成分（第一試薬）および標識試薬に用いる試薬成分（第二試薬）は、その一方又は両方がモノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいが、特異性を保った上で製造コストや抗体の安定供給を考慮する場合は少なくとも一方がポリクローナル抗体であることが好ましい。更に、標識試薬に用いる試薬成分（第二試薬）は、測定感度等の点から特異性の高いモノクローナル抗体がより好ましく、検出部（４）に用いる試薬成分（第一試薬）としては、ポリクローナル抗体を用いるのがより好ましい。
　モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体若しくはそのフラグメントは、公知であり、入手可能であり、公知の方法により調整することができる。抗体産生動物種としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等々である。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでも良い。
　モノクローナル抗体は、常法に従って、抗原（ｈＣＧ）で免疫したマウスの脾臓細胞と骨隋腫細胞をハイブリッドさせ、目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選択し、このハイブリドーマから産生されてくるモノクローナル抗体を収得する。例えば、ケーラーとミルスタインの技法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６（１９７５）４９５－４９７）を参照。
　ポリクローナル抗体は、常套手法により、抗原（ｈＣＧ）を産生動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等）に免疫して得た抗血清中から目的とする抗体を分離することにより得られる。
　ｈＣＧは、２３７のアミノ酸からなっている、３６．７ｋＤａの糖蛋白質である。ｈＣＧは、α－サブユニットとβ－サブユニットを持っている。α－サブユニットは、ｈＣＧと類似の蛋白質である黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ），甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）と同一のものであるが、β－サブユニットは、ｈＣＧに特有の独自のものである。検出部位（４）に用いる試薬成分（第一試薬）および標識試薬に用いる試薬成分（第二試薬）としては、それぞれα－サブユニットあるいはβ－サブユニットに反応結合部位を持つ抗ｈＣＧα抗体あるいは抗ｈＣＧβ抗体のどちらも用いることができるが、一方に抗ｈＣＧα抗体を用いた場合は他方は抗ｈＣＧβ抗体を用いる。標識試薬に用いる試薬成分（第二試薬）としては、β－サブユニットに反応結合部位を持つ抗ｈＣＧβ抗体を用いることが反応の効率性の観点からより好ましい。検出部位（４）に用いる試薬成分（第一試薬）としては、α－サブユニットに反応結合部位を持つ抗ｈＣＧα抗体を用いることがより好ましい。上記のように黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン，甲状腺刺激ホルモンは、ｈＣＧと同一のα－サブユニットを有し抗原としての構造が類似するため、それぞれを抗原としたイムノクロマト検出系においても本発明の検出系を適用した場合に同様の効果が期待できる。
　判定の原理を概説すると、
１．試料（例えば、女性の尿）を、サンプルパッド（１）上に、所定量(通常、０．１～２ｍｌ)滴下する。試料が滴下されると、サンプルパッド（１）中に担持または保持もしくは形成されているイムノクロマトグラフィー用試薬組成物は試料の水分に溶解し、試料と共に移動を始める。
２．イムノクロマトグラフィー用試薬組成物を溶解した試料は、まず標識物質保持部（２）へと移動する。ここを試料が通過する際、標識物質保持部（２）に保持されていた標識試薬（第二試薬）が試料の水分に溶解し、試料と共に移動する。
３．ついで、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフィー媒体（３）上の検出部位（４）を通過する。ここでは、試料中に溶解しているイムノクロマトグラフィー用試薬組成物により非特異的結合反応は抑制され、抗原・抗体の特異的結合反応により、女性が妊娠している場合には、尿中のｈＣＧが、検出部位（４）に保持、即ち、担持固定されている抗体と標識試薬とによってサンドイッチ状に挟まれるように特異的に反応結合して、検出部位（４）が着色する。女性が妊娠していない場合には、尿中にｈＣＧが含まれていないため、試料の水分に溶解した標識試薬は、クロマトグラフィー媒体（３）上の検出部（４）を通過しても特異的結合反応が起こらないので、検出部（４）が着色しない。
４．最後に、試料の水分は、吸収部位（５）へと移動する。
このように、試料、例えば、尿中のｈＣＧの有無を検査することにより、妊娠の有無を正確に判定することができる。
　イムノクロマトグラフィー用試薬組成物は、サンプルパッド（１）中に含浸あるいは塗布して後、乾燥させて担持または保持もしくは形成する代わりに、試料とイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を予め混合して、展開液としてサンプルパッド（１）上に滴下／供給することにより、上記と同様の検査を行なうこともでき、上記と同様な結果を達成することができる。また、試料が、鼻汁、痰、鼻腔又は咽頭拭い液であり、その検出対象物がインフルエンザウィルスである場合には、上記のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を試料希釈液として使用し、検出部（４）に用いる試薬成分（第一試薬）および標識試薬に用いる試薬成分（第二試薬）としては、抗インフルエンザウィルスモノクローナル抗体を用いて、採取した試料を上記のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物により約１００倍に希釈して、その１５０μＬをサンプルパッド（１）上に滴下／供給して展開することにより、上記と同様の検査を行なうことができ、上記と同様な結果を達成することができる。
　以下、本発明の有効性を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．クロマトグラフ媒体上への判定部の作製
　２５×２．５ｃｍのセルロースからなる膜（ミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０）に、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社製）を用いて、５重量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した濃度１．０ｍｇ／ｍｌの抗ｈＣＧポリクローナル抗体（α－ｈＣＧα）を塗布し乾燥させ、クロマトグラフ媒体上へ判定部を作製した。
２．標識試薬溶液の作製
　金コロイド懸濁液（田中貴金属工業（株）製：８０ｎｍ）０．５ｍｌにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．１ｍｌ加え混和し、リン酸緩衝液で希釈した抗ｈＣＧモノクローナル抗体（α－ｈＣＧβ）を０．１ｍｌ加え、室温で１０分間静置した。次いで、リン酸緩衝液で希釈された１０重量％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を　０．１ｍｌ加え、十分攪拌した後、８０００×ｇで１５分間遠心分離を行った。上清を除去した後、リン酸緩衝液を加えた。超音波破砕機を用いてコロイド状の標識試薬をよく分散させた後、８０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を除去し、前記リン酸緩衝液を加えて超音波破砕機にてよく分散し、標識試薬溶液とした。
３．クロマトグラフ媒体の作製
　上記作製した標識試薬溶液３００μＬを１６×１００ｍｍのグラスファイバー製パッド（ミリポア社製）に均一に添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識試薬保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記にて判定部位を作製したニトロセルロース膜、標識試薬保持部材、試料を添加する部分に用いるグラスファイバー製サンプルパッド、および展開した試料や標識試薬などを吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が５ｍｍとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体を作製した。
４．測定
　上記３．にて作製したクロマトグラフ媒体を用いて、被検物質であるｈＣＧを０　ｍＩＵ／ｍＬあるいは５０　ｍＩＵ／ｍＬの濃度で含むリン酸緩衝液で希釈した試料１５０μLを用いてその存在の有無を測定した。
その際、サンプルパッドに上記の希釈された被検物質試料に対してトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭに、０．１５重量％となるようにポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン－アルキルエーテル（日本油脂（株）製：商品名ノニオン（登録商標）ＭＮ８１１、アルキル基の炭素数＝１４、オキシプロピレンのモル比／オキシエチレンのモル比＝１．１）、およびＥＤＴＡ０．８３ｍＭとなるように加えたものを含浸させた後に乾燥したものを作製し、サンプルパッド中への上記化合物の含浸処理による影響を評価した。試料滴下後５分で目視判定を行い、判定部位におけるテストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、よりはっきりと確認できるものを「＋＋」、赤い線を確認できないものを「－」とした。
結果、サンプルパッド中にトリス塩酸緩衝液、ノニオンＭＮ８１１およびＥＤＴＡが含浸されていない場合は非特異的反応による偽陽性が確認され、含浸処理のパッドを使用した場合には偽陽性が確認されなかった。
　サンプルパッド中への含浸処理による影響の測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
５．成分の配合比による影響の評価
　サンプルパッド中にトリス塩酸緩衝液、ノニオンＭＮ８１１およびＥＤＴＡが配合されることにより偽陽性が抑制されることから、各成分の配合（希釈検体液に対する）比を検討した。
その際、サンプルパッドに上記の希釈された被検物質試料に対してトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３３～５０ｍＭ、０～０．３重量％となるようにポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン－アルキルエーテル（日本油脂（株）製：商品名ノニオン（登録商標）ＭＮ８１１、アルキル基の炭素数＝１４、オキシプロピレンのモル比／オキシエチレンのモル比＝１．１）、Ｔｗｅｅｎ２０（商品名、ＨＬＢ値１６．７）０～０．１０％、およびＥＤＴＡ０．５６～１．６ｍＭとなるように加えたものを含浸させた後に乾燥したものを作製し、サンプルパッド中への上記化合物の含浸処理による影響を評価した。
試料滴下後５分で目視判定を行い、判定部位におけるテストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、よりはっきりと確認できるものを「＋＋」、赤い線を確認できないものを「－」とした。
検体として、ｈＣＧを０　ｍＩＵ／ｍＬあるいは５０　ｍＩＵ／ｍＬの濃度に希釈したＰＢＳを用い、試験あたり１５０μＬを滴下した。５分毎に目視にて判定し、判定部位におけるテストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、赤い線は確認できるが非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「－」とした。
各成分の配合濃度と目視判定の結果を表２に示す。
なお、２５　ｍＩＵ／ｍＬの時、５分後に「＋」判定できた場合はその後の判定を実施しなかった。
　以下に、本発明の試験例を説明するが、これらの試験例に限定されるものではない。
　試験例１
　希釈検体液１５０μＬに対して、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）　３３ｍＭ、ＭＮ８１１　０．１％、ＥＤＴＡ　０．５６ｍＭとなるように加えたものをサンプルパッド中へ含浸させた後に乾燥したものを作製し、その評価を測定した。結果を表２に示す。
　試験例２
　上記試験例１におけるＭＮ８１１に代えて、Ｔｗｅｅｎ２０　０．１％となるようにした以外は同様にしたものをサンプルパッド中へ含浸させた後に乾燥したものを作製し、その評価を測定した。結果を表２に示す。
　試験例３
　希釈検体液１５０μＬに対して、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）　５０ｍＭ、ＭＮ８１１　０．１５％、ＥＤＴＡ　０．８３ｍＭとなるように加えたものをサンプルパッド中へ含浸させた後に乾燥したものを作製し、その評価を測定した。結果を表２に示す。
　試験例４
希釈検体液１５０μＬに対して、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）　３３ｍＭ、ＭＮ８１１　０．０５％、Ｔｗｅｅｎ２０　０．０５％、ＥＤＴＡ　０．５６ｍＭとなるように加えたものをサンプルパッド中へ含浸させた後に乾燥したものを作製し、その評価を測定した。結果を表２に示す。
　試験例５
　希釈検体液１５０μＬに対して、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）　３３ｍＭ、ＭＮ８１１　０．３％、ＥＤＴＡ　１．６ｍＭとなるように加えたものをサンプルパッド中へ含浸させた後に乾燥したものを作製し、その評価を測定した。結果を表２に示す。
　試験例６
　同様に、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）　１００ｍＭ、ＭＮ８１１　０．３％、ＥＤＴＡ　１．６ｍＭとなるように加えたものについての測定結果を表２に示す。
　試験例７
　同様に、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）　１６７ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２０　０．１０％、ＭＮ８１１　０．２０％、ＥＤＴＡ　１．６ｍＭとなるように加えたものについての測定結果を表２に示す。
　試験例８
　上記試験例７におけるトリス塩酸緩衝液に代えて、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ緩衝液）５５ｍＭを使用した場合について、同様に判定を行なった試験結果を表２に示す。５分経過の時点では偽陽性の抑制が確認されたが、５５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度では、時間の経過と共に偽陽性が確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記試験例２におけるＴｗｅｅｎ２０に代えて、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を、Ｔｗｅｅｎ２０とＴｒｉｔｏｎＸ－１００との混合物をそれぞれ用いてもＴｗｅｅｎ２０のみの場合と同様の測定結果が得られた。また、上記試験例８におけるＨＥＰＥＳ緩衝液に代えて、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を使用した場合についても、ＨＥＰＥＳ緩衝液と同様の試験結果が得られた。
６．非特異的反応の出易い尿検体での評価
　サンプルパッド中に上記３成分を配合することで、偽陽性反応を抑制できることが明らかとなった。そこで、尿中成分による偽陽性反応を抑制できるかどうか検討した。尿中には多種多様な因子が含まれており、非特異的反応を起こしやすい。偽陽性の抑制効果を検証するため、検体として、ｈＣＧを尿中で０　ｍＩＵ／ｍＬ、２５　ｍＩＵ／ｍＬに希釈したものを用い、試験あたり１５０μＬを滴下した。５分毎に目視にて判定し、判定部位におけるテストラインの赤い線を確認できるものを「＋」、赤い線は確認できるが非常に色が薄いものを「±」、赤い線を確認できないものを「－」とした。
各成分の配合濃度と目視判定の結果を表３に示す。
なお、２５　ｍＩＵ／ｍＬの時、５分後に「＋」判定できた場合はその後の判定を実施しなかった。
　試験の結果、サンプルパッドを未処理の場合は偽陽性が確認されたが、トリス塩酸緩衝液、ノニオンＭＮ８１１およびＥＤＴＡを配合した場合は偽陽性が抑制された。また、トリス塩酸緩衝液の濃度が高いほど、偽陽性が長時間抑制されることが認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　以上により、サンプルパッド中にトリス塩酸緩衝液、ＥＤＴＡおよび、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体で片末端にアルキル基を持つ非イオン界面活性剤をあらかじめ含浸させることにより、非特異的反応を抑制することが出来ることが見出された。
　別の実施態様として、上記の試験例において、ノニオンＭＮ８１１に代えて、ノニオンＴＡ－４１１（日本油脂（株）製：アルキル基の炭素数＝１１～１８の混合物、オキシプロピレンのモル比／オキシエチレンのモル比＝０．１５）を使用したこと以外は、同様にして測定を行なった。表１、表２および表３と略同様の目的を達成することが可能である。
　別の実施態様として、上記の試験例において、ノニオンＭＮ８１１に代えて、アデカトールＬＢ－５３Ｂ（旭電化工業（株）製：アルキル基の炭素数＝１２、オキシプロピレンのモル比／オキシエチレンのモル比＝０．３）を使用したこと以外は、同様にして測定を行なった。表１、表２および表３と略同様の目的を達成することが可能である。
　また、別の実施態様として、上記の試験例において、ＥＤＴＡに代えて、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を使用したこと以外は、同様にして測定を行なった。ＮＴＡを用いた場合には、物質に起因して性能に若干の相違があるが、表１、表２および表３と略同様の目的を達成することが可能であることが確認できる。
　さらに、別の実施態様として、例えば、下記のような組み合わせで行っても同様の目的を達成することが可能である。
 
　　　　緩衝剤　　　　　　　　非イオン界面活性剤　　　　　　　キレート剤　　
（１）酢酸緩衝液　　　　　　　　ＭＮ８１１　　　　　　　　　　　ＮＴＡ
（２）リン酸緩衝液　　　　　アデカトールＬＢ－５３Ｂ　　　　　　ＥＤＴＡ　　　
（３）トリス塩酸緩衝液　　　　　ノニオンＴＡ－４１１　　　　　　ＡＳＤＡ
 
　本発明の検出キットは、非特異的反応を抑制し、特異的に尿中のｈＣＧを検出できるので、ｈＣＧを迅速・簡便に測定することで妊娠検査できるという、産業上の利用可能性を有する。
１　試料添加部（サンプルパッド）
２　標識物質保持部
３　クロマトグラフィー媒体
４　検出部
５　吸収部
６　バッキングシート

Claims (8)

  1. 　緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むことを特徴とする試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）おより甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する為のイムノクロマトグラフィー用試薬組成物。
  2. 　キレート剤が、アミノカルボン酸系キレート剤である請求項１に記載のイムノクロマトグラフイー用試薬組成物。
  3. 　緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むことを特徴とする試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する為のイムノクロマトグラフィー用試料希釈組成物。
  4. 　試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体部、試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する検出部および吸収部から実質的に順次構成されており、且つ試料添加部の端部と吸収部との間のいずれかの領域部に、緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を含む部位が設けられていることを特徴とするイムノクロマトグラフィー装置。
  5. 　キレート剤が、アミノカルボン酸系キレート剤である請求項4に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
  6. 　試料添加部、標識物質保持部、クロマトグラフィー媒体部、試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ），卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する検出部および吸収部から実質的に順次構成されており、且つ試料添加部の端部と吸収部との間のいずれかの領域部に、緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むイムノクロマトグラフィー用試薬組成物を含む部位が設けられているイムノクロマトグラフィー装置からなることを特徴とする検出キット。
  7. 　緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むことを特徴とする試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出する為に用いるイムノクロマトグラフィー用展開液。
  8. 　緩衝液、キレート剤、および片末端にアルキル基を持つポリオキシエチレンブロックのオキシエチレン繰り返し単位とポリオキシプロピレンブロックのオキシプロピレン繰り返し単位の割合がモル比で０．１～１．５の範囲であるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロック共重合体からなる非イオン界面活性剤を含むイムノクロマトグラフィー用展開液を、移動相を構成する展開液として使用して、試料中のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群から選択される検出対象物を検出することを特徴とするイムノクロマトグラフィー法。
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