CN106405078B - 一种d-二聚体免疫荧光定量试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种d-二聚体免疫荧光定量试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种D‑二聚体免疫荧光定量试纸条及其制备方法。相对于普通储存液制备的试纸条，本发明所制备的D‑二聚体免疫荧光定量试纸条存储稳定性更佳，精密度更好，检测样品的出峰具有更高的信号和较平整的基线，准确度较高。

Description

一种D-二聚体免疫荧光定量试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域，更具体地涉及一种D-二聚体免疫荧光定量试纸条及其制备方法。
背景技术
D-二聚体是血液中的纤维蛋白原受凝血酶等作用而凝固形成的聚合物，是交联纤维蛋白的特异性降解产物。在正常生理状态下，机体保持着凝血与纤溶动态平衡，以保证纤维蛋白及时形成和清除。当这一平衡遭到破坏，血管内凝血倾向增强，纤维蛋白聚集，纤维蛋白降解产物增加，D-二聚体含量增加。因此，D-二聚体水平的升高反映体内凝血和纤溶系统的双重激活，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一，用于多种疾病的病程检测，如深静脉血栓、弥漫性血管内凝血、心肌梗死、重症肝炎、肺栓塞等。
目前，D-二聚体检测方法主要有：乳胶凝集法、酶联免疫法、荧光抗体检测法、金标法和胶乳免疫比浊法。乳胶凝集法只能定性检测，不能测定血浆中D-二聚体含量的变化；酶联免疫法操作容易受到酶活性变化的影响，结果不太准确；金标法容易受类风湿因子、肝素及血脂的影响，结果准确性差；胶乳比浊法反应特异性不好，所需试剂比较复杂。
荧光抗体检测技术能够实现样品中D-二聚体的定量检测，且具有检测仪器精巧轻便、操作简单迅速、结果精准等优点，因此，制备和生产D-二聚体免疫荧光定量试纸条非常有市场价值。然而，要实现D-二聚体免疫荧光定量试纸条的制备和长期保存，储存液是关键之一。储存液的好坏关乎试纸条的准确度和保存期，因此，通过改进储存液，开发高准确度的D-二聚体免疫荧光定量试纸条非常有现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种D-二聚体免疫荧光定量试纸条及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种D-二聚体免疫荧光定量试纸条，包括吸水垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、结合垫、样品垫、PVC底板(7)；其中，结合垫上喷有D-二聚体一抗-荧光微球偶联物；所述的检测线为D-二聚体一抗，质控线为D-二聚体二抗，且检测线和质控线依次固定于硝酸纤维素膜上；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并承载于PVC底板；D-二聚体一抗-荧光微球偶联物使用储存液进行浸渍处理、保存和稀释；所述的储存液配方为：PB的质量浓度为15～25mM、BSA的百分浓度为1.6％～2％、Tween-80的百分浓度为0.4％～0.6％、葡萄糖的百分浓度为0.4％～0.6％、甘氨酸的百分浓度为1.5％～2.5％、PEG4000的百分浓度为0.8％～1.2％、PEG20000的百分浓度为1％～2％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.01％～0.1％。
作为优选的储存液配方，PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％、葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03％。
试纸条加样层析后，检测质控线和检测线的荧光信号强度，并以质控线荧光信号强度校正检测线的荧光信号强度，实现D-二聚体的定量检测。
一种D-二聚体免疫荧光定量试纸条的制备方法，包括如下步骤：
(1)将荧光微球活化后与D-二聚体一抗偶联，偶联完毕后加入封闭剂，保存于储存液中；
(2)将D-二聚体一抗-荧光微球偶联物用储存液稀释后，喷于结合垫上，干燥保存；
(3)将D-二聚体一抗固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，将D-二聚体二抗固定于硝酸纤维素膜上作为质控线；
(4)在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，并剪切成适当宽度即成为D-二聚体免疫荧光定量试纸条，其中，样品垫材质为玻璃纤维素膜或滤血膜，结合垫材质为玻璃纤维素膜；
上述的储存液配方为：PB的质量浓度为15～25mM、BSA的百分浓度为1.6％～2％、Tween-80的百分浓度为0.4％～0.6％、葡萄糖的百分浓度为0.4％～0.6％、甘氨酸的百分浓度为1.5％～2.5％、PEG4000的百分浓度为0.8％～1.2％、PEG20000的百分浓度为1％～2％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.01％～0.1％。
作为优选的储存液配方，PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％、葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03％。
D-二聚体一抗-荧光微球偶联物在储存液中的保存浓度为0.1～10mg/mL。
本发明的有益效果是：
相对于普通储存液制备的试纸条，本发明所制备的D-二聚体免疫荧光定量试纸条存储稳定性更佳，精密度更好，检测样品的出峰具有更高的信号和较平整的基线，准确度较高。
附图说明
图1：优选的储存液制备的D-二聚体免疫荧光定量试纸条检测希森美康D-二聚体标准曲线；
图2：优选的储存液制备的D-二聚体免疫荧光定量试纸条检测D-二聚体重组抗原的检测值与理论值散点图；
图3：不同储存液制备的试纸条检测含不同浓度D-二聚体的病人血清样本的荧光检测折线图；
图4：不同储存液制备的试纸条检测含D-二聚体的病人血清样本检测值与希森美康-CA7000检测值的相关图；
具体实施方式
实施例1
D-二聚体免疫荧光定量试纸条的制备过程如下：
(1)优选储存液的制备：PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8％、Tween-80的百分浓度为0.5％、葡萄糖的百分浓度为0.5％、甘氨酸的百分浓度为2％、PEG4000的百分浓度为1％、PEG20000的百分浓度为1.5％、Proclin300百分浓度为0.03％，按上述配方配制混匀后过滤除菌，制得储存液；
(2)样品垫的制备：用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜10min，置于干燥间37℃湿度30％，烘干3h，制得样品垫，备用；
(3)结合垫的制备：用结合垫处理液浸泡玻璃纤维素膜10min，浸泡处理后，置于干燥间37℃湿度30％，烘干3h，制得结合垫，备用；
(4)将1mg的200nm聚苯乙烯荧光微球先后加入20μL的0.5mg/mL的EDC和0.5mg/mL的NHS，在活化缓冲液37℃活化1h；
(5)加入0.1mgD-二聚体一抗(鼠源D-二聚体单克隆抗体)，在200μL偶联缓冲液中与荧光微球偶联，完毕后加入封闭液20μL，制得D-二聚体一抗-荧光微球偶联物，18000rpm离心15min后，加入200μL储存液，制得D-二聚体一抗-荧光微球偶联物浓度为5mg/mL，2～8℃保存；
(6)用储存液将D-二聚体一抗-荧光微球偶联物稀释到0.5mg/mL，用喷金划膜仪喷于经结合垫处理液处理后的结合垫上，用鼓风干燥箱干燥7h。铝箔袋密封置于20-25℃、湿度约30％的条件下存放备用；
(7)将1mg/mLD-二聚体二抗(羊抗鼠IgG多克隆抗体)和1mg/mLD-二聚体一抗分别用包被液包被，以条带状1.0mm用喷金划膜仪分别固定于硝酸纤维素膜上分别作为质控线和检测线；
(8)在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸，并剪切成宽度4.1mm即成为D-二聚体免疫荧光定量试纸条；
(9)将切好的试纸条装卡，过压壳机，准备检测；
(10)样品垫处理液：100mMPBS、1％Triton、0.75％BSA、0.5％PVA、0.9％NaCl、0.3％葡聚糖、0.05％Proclin300，pH7.8；
(11)结合垫处理液：2％Tween-80、1.5％PVA、0.5％BSA、1％海藻糖，PH7.05-7.10；
(12)活化缓冲液为75mM MES，pH5.5；
(13)偶联缓冲液：20mM PB，pH7.5；
(14)封闭液：20％BSA；
(15)包被液：20mMPBS，1.2％异丙醇、0.4％葡聚糖20000、1.5％BSA、0.5％Tween-80、0.03％Proclin300，pH7.0。
实施例2
将实施例1制备的D-二聚体免疫荧光定量试纸条建立标准曲线并进行检测，实施方法如下：
(1)建立标准曲线：用希森美康D二聚体浓度为高低值校准品混合稀释至200ng/mL、500ng/mL、900ng/mL、1800ng/mL、3600ng/mL、6000ng/mL、8000ng/mL七个浓度。用制备好的试纸条加样80μL上免疫荧光分析以检测，每个浓度重复3次取平均值。以检测线所出的T峰面积和质控线所出的C峰面积的比值为纵坐标，标准品理论值为横坐标。
标准曲线如图1所示；y＝0.0023x-0.2779，R2＝0.9966，用该方程可计算样品中的D二聚体含量，实现定量，且相关性好。
(2)样品检测：用抗原稀释液对D二聚体重组抗原倍比稀释至250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、4000ng/mL、8000ng/mL六个浓度。抗原稀释液：20mMPBS，0.5％BSA，0.5％Tween-20，PH7.2；将求得T/C峰面代入y＝0.0023x-0.2779中Y，求得X为所测抗原值，
如图2所示，可以看出实施例2制备的试纸条检测值与理论值偏差小(R2＝0.9988)，检测的准确率高。
实施例3
配制对照储存液，具体配方为：PB的质量浓度为50mM、BSA的百分浓度为1％、Tween-80的百分浓度为1％、葡萄糖的百分浓度为1％、甘氨酸的百分浓度为0.5％、PEG4000的百分浓度为2％、Proclin300百分浓度为0.3％。
采用实施例1制备的优选储存液(以下简称储存液2)与对照储存液(以下简称储存液1)进行助稳性能和精密度对比，实施方法和结果如下：
用储存液1和储存液2，对相同工艺标记的D二聚体(D-Dimer)一抗-荧光微球进行喷膜干燥，分别组装成40个试纸条，放铝箔袋、干燥剂封口。一袋放置冰箱4℃保存7天(对照组)，另外一袋放置温箱37℃加速7天。完整7天后，取出卡条，分别加入浓度为50ng/mL和500ng/mL的D-Dimer重组抗原检测。根据理论37℃加速7天相当于4℃保存1年，模拟1年后的抗原检测情况，结果如下表1、表2所示。
表1、2种储存液制得的试纸条测试1.9ng/mL D-Dimer重组抗原的效果对比
表2、2种储存液制得的试纸条测试500ng/mL D-Dimer重组抗原的效果对比
从表1、2得出，优选的储存液2制备的试纸条在37℃加速七天后，检测值仅下降7％左右，且精密度较好；而对照储存液1制备的试纸条在37℃加速七天后，检测值下降35％左右，精密度相对较差。
实施例4
用储存液1和储存液2(同实施例3)，对相同工艺标记的D-二聚体一抗-荧光微球进行喷膜干燥，组装好试纸条，分别用浓度为120ng/mL、270ng/mL、310ng/mL、430ng/mL、460ng/mL、1920ng/mL的含D-二聚体的希森美康CA7000赋值的病人血清样本对两种试纸条加样检测，随后用配套检测仪器对试纸条窗口信息进行读取。通过仪器激光对窗口的荧光微球进行激发，再采集窗口300个位置(作横坐标)的发射荧光强度(作纵坐标)，利用荧光分析软件将300个点按顺序连在一起形成折线图。
如图3所示，折线图可反映荧光微球在NC膜上的跑膜情况，图中有两个峰，左边为T峰(对应肉眼视卡条为检测线)，右边为C峰(对应肉眼视卡条为质控线)。使用储存液2的整体出峰效果较好，说明储存液2对抗体-荧光微球偶联物从结合垫释放到NC膜效果较好。使用储存液1的则出峰信号不高，基线不平整，前段抬起较明显，影响软件对峰面积的计算，进而影响读值的准确度。
实施例5
用储存液1和储存液2(同实施例3)，对相同工艺标记的D-二聚体一抗-荧光微球进行喷膜干燥，分别组装15个试纸条，用15个不同浓度的含D-二聚体抗原的病人血清样本同时对两种试纸条加样检测。用配套检测仪器对试纸条窗口信息进行读取，用荧光分析软件计算T峰面积与C峰面积，同时用血凝方面权威公司希森美康旗下的CA7000全自动血凝仪检测的结果值。
以希森美康CA7000评价2种储存液制备的试纸条检测结果的临床诊断准确性。如图4所示，纵坐标为T峰面积/C峰面积，横坐标希森美康CA7000结果值，储存液2制备的试纸条检测结果与希森美康公司的CA7000仪器检测结果较吻合(R2＝0.991)，而储存液1的血清线性相关较差(R2＝0.965)，重复性也不好。这与前述储存液2让抗体-荧光微球偶联物释放效果更好，软件计算面积更加准确有关。

Claims (4)

1.一种D-二聚体免疫荧光定量试纸条，包括吸水垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、结合垫、样品垫、PVC底板；其中，所述的结合垫上喷有D-二聚体一抗-荧光微球偶联物；所述的检测线固定D-二聚体一抗，所述的质控线固定羊抗鼠IgG多克隆抗体D-二聚体二抗，且检测线和质控线依次固定于硝酸纤维素膜上；所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并承载于PVC底板；其特征在于：D-二聚体一抗-荧光微球偶联物使用储存液进行浸渍处理、保存和稀释；所述的储存液配方为：PB的摩尔浓度为20 mM、BSA的百分浓度为1.8%、Tween-80的百分浓度为0.5%、葡萄糖的百分浓度为0.5%、甘氨酸的百分浓度为2%、PEG4000的百分浓度为1%、PEG20000的百分浓度为1.5%、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03%。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：试纸条加样层析后，检测质控线和检测线的荧光信号强度，并以质控线荧光信号强度校正检测线的荧光信号强度，实现D-二聚体的定量检测。
3.一种D-二聚体免疫荧光定量试纸条的制备方法，包括如下步骤：
（1）将荧光微球活化后与D-二聚体一抗偶联，偶联完毕后加入封闭剂，保存于储存液中；
（2）将D-二聚体一抗-荧光微球偶联物用储存液稀释后，喷于结合垫上，干燥保存；
（3）将D-二聚体一抗固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，将羊抗鼠IgG多克隆抗体D-二聚体二抗固定于硝酸纤维素膜上作为质控线；
（4）在PVC底板上依次搭接地粘贴：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，并剪切成适当宽度即成为D-二聚体免疫荧光定量试纸条，其中，样品垫材质为玻璃纤维素膜或滤血膜，结合垫材质为玻璃纤维素膜；
其特征在于：所述的储存液配方为：PB的摩尔浓度为20 mM、BSA的百分浓度为1.8%、Tween-80的百分浓度为0.5%、葡萄糖的百分浓度为0.5%、甘氨酸的百分浓度为2%、PEG4000的百分浓度为1%、PEG20000的百分浓度为1.5%、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03%。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：D-二聚体一抗-荧光微球偶联物在储存液中的保存浓度为0.1～10 mg/mL。
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