CN102692504A - D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条及其制备方法 - Google Patents

D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条及其制备方法 Download PDF

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黄力
王勇
陈伟
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Abstract

本发明涉及一种D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，包括在底衬上依次搭接地粘贴样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸水纸。样品垫为两层样品垫，结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的抗D-二聚体抗体A，硝酸纤维素膜上包被有抗D-二聚体抗体B为检测线和兔抗鼠IgG抗体作为质控线；荧光胶乳微球是由胶乳微球吸附荧光标记的链霉亲和素制备得到。本发明试纸条能够准确定量检测人血浆中D-二聚体含量，具有操作简便、准确度高、灵敏度高、成本低等特点。

Description

D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条及其制备方法。
背景技术
D-二聚体是血液中的纤维蛋白原受凝血酶等作用而凝固形成的聚合物，是交联纤维蛋白的特异性降解产物。在生理状态下，人体正常D-二聚体的水平一般在200μg/L以下，机体保持着凝血与纤溶动态平衡，以保证纤维蛋白及时形成和清除。如果这一平衡遭到破坏，血管内凝血倾向增强，纤维蛋白聚集，纤维蛋白降解产物增加，D-二聚体含量增加。因此，D-二聚体水平的升高反映体内凝血和纤溶系统的双重激活，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。D-二聚体含量升高可检测多种疾病的病程，如深静脉血栓（DVT）、弥漫性血管内凝血（DIC）、心肌梗死、重症肝炎、肺栓塞（PE）等疾病。因此血液中D-二聚体含量检测有助于血栓前状态及血栓形成性疾病的诊断，疗效观察及预后判断。
目前，D-二聚体检测方法主要有：乳胶凝集法、酶联免疫吸附（ELISA）法、荧光抗体检测法、免疫金标法和胶乳免疫比浊法等。胶乳凝集法只能定性检测，不能测定血浆中D-二聚体含量的变化。酶联免疫法操作容易受到酶活性变化的影响，结果不太准确。免疫胶体金法容易受类风湿因子、肝素及血脂的影响，结果准确性差。胶乳比浊法反应特异性不好，所需试剂比较复杂。
中国专利201110051367.2公开了一种D-二聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法，该试剂盒由下述成分组成：1）D-二聚体校准品；2）D-二聚体单克隆抗体包被的微孔板；3）铕元素标记的另一株D-二聚体单克隆抗体；4）洗涤液；5）增强液；6）分析缓冲液。该试剂盒采用铕元素标记抗体，铕元素属于镧系稀土金属元素，价格比较昂贵，且铕荧光寿命1ms,在水中不稳定，需要额外添加增强剂才能获得稳定的荧光。实施例中指出加入增强液之前，吸头应使用增强液洗两次，加入过程中应避免碰到小孔边缘或其底部，以免产生污染。因此，测定结果容易受操作的影响而不准确。另外，该发明中关于试剂盒的灵敏度、特异性等方面，只提供了结果，而没有提供具体的数据。因此，不知道该发明的试剂盒是否真实可行。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足，提供一种D-二聚体荧光免疫试纸条。
本发明的另一个目的是提供一种D-二聚体荧光免疫试纸条的制备方法。
本发明的目的可通过采用以下技术方案予以实现：
D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，在底衬上依次搭接地粘贴样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，所述结合垫上喷涂有荧光胶乳微球标记的抗D-二聚体抗体A，所述硝酸纤维素膜上有抗D-二聚体抗体B为检测线和兔抗鼠IgG抗体作为质控线。
所述胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
所述荧光胶乳微球是由胶乳微球吸附荧光标记的链霉亲和素制备得到的。
所述荧光为发射波长在480nm-700nm自发荧光物质，优选异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
所述抗D-二聚体抗体是抗D-二聚体单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。
所述结合垫的材质为聚酯膜或玻璃纤维素膜。
D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1）包被荧光胶乳微球标记D-二聚体抗体A结合垫的制备
a. 将荧光标记的链霉亲和素和胶乳微球吸附结合，制备得到荧光胶乳微球；
b. 将生物素与抗D-二聚体抗体A结合，制备得到生物素化抗D-二聚体A抗体；
c. 将步骤a所得荧光胶乳微球和步骤b所得生物素化抗D-二聚体抗体A混合，即得荧光胶乳微球标记抗D-二聚体抗体A；
d. 将步骤c所得荧光胶乳微球标记抗D-二聚体抗体A涂覆结合垫上。
2）硝酸纤维素膜的制备
用包被缓冲液分别稀释抗D-二聚体抗体B和兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的两种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜上，两种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成抗D-二聚体抗体B检测线和兔抗鼠IgG抗体包被的质控线。
3）在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
所述胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
所述荧光为发射波长在480nm-700nm自发荧光物质，优选异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
所述抗D-二聚体抗体是抗D-二聚体单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。
所述结合垫材质为聚酯膜或玻璃纤维素膜。
本发明有益效果
本发明的试纸条能够准确定量检测人血浆中D-二聚体含量，具有操作简便、准确度高、灵敏度高、成本低等特点。
附图说明
图1为本发明D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条结构示意图；
图2为本发明实施例1所制备的试纸条的校准曲线；
图3为本发明实施例1所制备的试纸条的线性范围相关性；
图4为本发明实施例1所制备的试纸条与德国Siemens公司D-二聚体试剂盒检测结果相关性比较；
其中，图1：1、底衬；2、第一层样品垫；3、第二层样品垫；4、结合垫；5、硝酸纤维素膜；6、吸水纸；7、检测线；8、质控线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，在底衬1上依次搭接地样品垫2、3，结合垫4，硝酸纤维素膜5和吸水纸6，所述结合垫4上喷涂有荧光胶乳微球标记的抗D-二聚体单克隆抗体M1，所述硝酸纤维素膜5上有包被抗D-二聚体单克隆抗体M2为检测线7和兔抗鼠IgG抗体作为质控线8。以上抗体均购自罗氏公司。
上述硝酸纤维素膜上检测线7还可以是包被抗D-二聚体的多克隆抗体，所述多克隆抗体是采用本领域熟练技术人员熟知的常规方法免疫鼠获得抗血清制备而得。
进一步所述的胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
所述荧光为发射波长在480nm-700nm自发荧光物质，优选异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
实施例1 
D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条制备方法如下：
1）荧光胶乳微球的制备
荧光胶乳微球的制备：用吸附缓冲液（50mM、pH5.8的柠檬酸盐缓冲液）稀释粒径为100nm胶乳微球至终浓度20mg/ml,体积为5ml，制得胶乳微球悬浮液; 添加适量的荧光素Cy5标记链霉亲和素（购自上海研晶生物科技有限公司）在吸附缓冲液里，终体积为5ml；将上述胶乳微球悬浮液加入到上述含有荧光素标记链霉亲和素的吸附缓冲液中，制得混合液；将所得混合液在室温下温浴1-2小时，并不断搅拌，然后离心，收集沉淀，沉淀用储存缓冲液（含有0.05%BSA的吸附缓冲液）溶解，放置4℃保存，备用。
2）生物素化抗D-二聚体抗体A的制备
将抗D-二聚体单克隆抗体M1用0.1mol/L、pH8.0碳酸氢钠缓冲液稀释至1mg/ml,交互用0.1mol/L、pH8.0碳酸氢钠缓冲液对D-二聚体抗体M1充分透析；用1ml DMSO溶解1mg的NHSB，得到NHSB溶液；向上述1mlD-二聚体单克隆抗体M1加入20μl NHSB溶液，室温搅拌2-4小时，继续室温搅拌10分钟，然后用20mM、pH7.2 PBS缓冲液透析，即得生物素化抗D-二聚体单克隆抗体M1。
3）荧光胶乳微球标记D-二聚体抗体A的制备
将步骤1)制得的荧光胶乳微球和步骤2）制得的生物素化D-二聚体抗体M1混合在一起，反应30分钟后离心，沉淀用用储存缓冲液溶解，恢复至原体积。
4）包被荧光胶乳微球标记D-二聚体抗体A结合垫4的制备
将步骤3）制得的荧光胶乳微球标记抗D-二聚体抗体M1，按3.0μl/cm3的用量喷在玻璃纤维素膜4上。
5）硝酸纤维素膜5的制备
a）包被缓冲液的制备：将0.025M、pH7.4的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期7天；
b）封闭液的制备：将含1%BSA，1%蔗糖，0.025M、pH7.5的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期3天；
c）D-二聚体抗体检测线7的制备：将抗D-二聚体单克隆抗体M2按2mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min,划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；
d）质控线8的制备：将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜5上划线，该线与检测线7平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；
e）用上述封闭液将含有检测线7和质控线8的硝酸纤维素膜5于37℃封闭60分钟，取出后置37℃下烘干处理两个小时，封袋备用。
6）试纸条组装
在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、3，玻璃纤维素膜4，硝酸纤维素膜5和吸水纸6得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
实施例2 
另一种D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条制备方法如下：
1）荧光胶乳微球的制备
荧光胶乳微球的制备：用吸附缓冲液（50mM、pH5.8的柠檬酸盐缓冲液）稀释粒径为400nm胶乳微球至终浓度30mg/ml,体积为6ml，制得胶乳微球悬浮液;添加适量的红色荧光素罗丹明标记链霉亲和素（购自上海酶联生物科技有限公司）在吸附缓冲液里，终体积为6ml；将上述胶乳微球悬浮液加入到上述含有红色荧光素罗丹明标记链霉亲和素的吸附缓冲液中，制得混合液；将所得混合液在室温下温浴1-2小时，并不断搅拌，然后离心，收集沉淀，沉淀用储存缓冲液（含有0.06%BSA的吸附缓冲液）溶解，放置4℃保存，备用。
2）生物素化抗D-二聚体抗体A的制备
将抗D-二聚体单克隆抗体M1用0.1mol/L、pH8.0碳酸氢钠缓冲液稀释至1mg/ml,交互用0.1mol/L、pH8.0碳酸氢钠缓冲液对D-二聚体抗体M1充分透析；用1ml DMSO溶解1mg的NHSB，得到NHSB溶液；向上述1mlD-二聚体单克隆抗体M1加入25μl NHSB溶液，室温搅拌2-4小时，继续室温搅拌10分钟，然后用20mM、pH7.2 PBS缓冲液透析，即得生物素化抗D-二聚体单克隆抗体M1。
3）荧光胶乳微球标记D-二聚体抗体A的制备
将步骤1)制得的荧光胶乳微球和步骤2）制得的生物素化D-二聚体抗体M1混合在一起，反应30分钟后离心，沉淀用用储存缓冲液溶解，恢复至原体积。
4) 涂覆荧光胶乳微球标记D-二聚体抗体A结合垫4的制备
将步骤3）制得的荧光胶乳微球标记抗D-二聚体抗体，按2μl/cm3的用量喷在聚酯膜4上。
5）硝酸纤维素膜5的制备
a）包被缓冲液的制备：将0.025M、pH7.4的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期7天；
b）封闭液的制备：将含1%BSA，1%蔗糖，0.025M、pH7.5的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期3天；
c）D-二聚体抗体检测线7的制备：将抗D-二聚体多克隆抗体按3mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min,划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；
d）质控线8的制备：将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜5上划线，该线与检测线7平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；
e）用上述封闭液将含有检测线7和质控线8的硝酸纤维素膜5于37℃封闭60分钟，取出后置37℃下烘干处理两个小时，封袋备用。
6）试纸条组装
在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、3，聚酯膜4，硝酸纤维素膜5和吸水纸6得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
实施例3 D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条定量检测
3.1 绘制标准曲线
在按实施例1制备好的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条样品垫上加入不同浓度D-二聚体抗原标准品（取七个不同浓度，分别为0、0.1、0.5、1、2、5、10mg/L，每个浓度设3个重复），10分钟后，通过南京基蛋生物科技有限公司的荧光免疫定量分析仪Getein1100读取检测线7和质控线8信号，实验结果及分析见表1：
表1 D-二聚体标准品检测结果
 以D-二聚体抗原标准品浓度与测定的信号平均值绘制标准曲线，如图2所示。
3.2 检测线性范围
采用本发明实施例1制备的试纸条，做检测线性范围实验。取D-二聚体标准品，用生理盐水稀释成8个浓度，其浓度范围是0.1mg/L-10mg/L，每个浓度重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程y = 1.0183x + 0.0313，相关系数r=0.99995，表明本发明试纸条在0.1mg/L-10mg/L线性范围内相关性很好（见附图3）。
3.3 灵敏度（最低检测限）
以5%人血清白蛋白为空白样本，用本发明实施例1制备的试纸条进行测定，重复20次，计算结果均值为0.021，标准差SD为0.036，根据以空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫定量分析仪Getein1100测定读数变化量为0.093。用稀释后浓度分别为0.05mg/L、0.1mg/L和0.15mg/L D-二聚体标准品溶液测定荧光免疫定量分析仪Getein1100测定读数变化值分别为0.045、0.098、0.112，因此本发明实施例1制备的试纸条检测D-二聚体灵敏度为0.1mg/L。
3.4 重复性和准确性
配制0.5mg/L和1.0mg/L的D-二聚体标准品溶液，采用本发明实施例1制备的试纸条进行测定，各浓度分别重复测定5次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为4.10%和3.97% ；以（1-均值/标准值）×100%计算相对偏差进行准确度考察，相对偏差分别为1.2%和4%。
表2 重复性和准确性实验
序号 标准值0.5mg/L 标准值1.0mg/L
1 0.48 0.98
2 0.52 0.97
3 0.49 1.03
4 0.53 1.05
5 0.51 0.96
平均值 0.506 0.998
标准差 0.0207 0.0396
变异系数（%） 4.10% 3.97%
相对偏差（%） 1.2% 4%
3.5 与德国Siemens公司D-二聚体试剂盒相关性比较
采用本发明实施例1制备的试纸条进行测定,将含有D-二聚体的血清等分，取100μl的样品加样至试纸条的样品垫上，通过南京基蛋生物科技有限公司的荧光免疫定量分析仪Getein1100读取检测线7和质控线8信号。从同一等分样品离心获得血浆，采用德国Siemens公司D-二聚体试剂盒（胶乳比浊法）在希森美康CA-7000全自动凝血分析仪检测。采用这种方式制备了75份样品并采用两个检测系统，图4显示了两个系统的测量值，其相关性很好r=0.9684，P＞0.05，两种方法间无统计学差异。

Claims (10)

1.D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，在底衬上依次搭接地粘贴样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于所述的结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的抗D-二聚体抗体A，所述的硝酸纤维素膜上包被有抗D-二聚体抗体B为检测线和兔抗鼠IgG抗体作为质控线。
2.根据权利要求1所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于所述胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
3.根据权利要求1所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于所述的荧光胶乳微球是由胶乳微球吸附荧光标记的链霉亲和素制备得到。
4.根据权利要求1或3所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于所述的荧光为发射波长在480nm-700nm自发荧光物质，为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
5.根据权利要求1所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于抗D-二聚体抗体是抗D-二聚体单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。
6.一种如权利要求1所述D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1）包被荧光胶乳微球标记D-二聚体抗体A结合垫的制备
a. 将荧光标记的链霉亲和素和胶乳微球吸附结合，制备得到荧光胶乳微球；
b. 将生物素与抗D-二聚体抗体A结合，制备得到生物素化抗D-二聚体A抗体；
c. 将步骤a所得荧光胶乳微球和步骤b所得生物素化抗D-二聚体抗体A混合，即得荧光胶乳微球标记抗D-二聚体抗体A；
d. 将步骤c所得荧光胶乳微球标记抗D-二聚体抗体A喷涂在结合垫上；
2）硝酸纤维素膜的制备
用包被缓冲液分别稀释抗D-二聚体抗体B和兔抗鼠IgG抗体，并将稀释后的两种抗体分别平行地喷于硝酸纤维素膜上，两种抗体渗入硝酸纤维素膜后分别形成抗D-二聚体抗体B检测线和兔抗鼠IgG抗体包被的质控线；
3）在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。
7.根据权利要求6所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条的制备方法，其特征在于所述的胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
8.根据权利要求6所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条的制备方法，其特征在于所述的荧光为发射波长在480nm-700nm自发荧光物质，为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
9.根据权利要求6所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条的制备方法，其特征在于所述的抗D-二聚体抗体是抗D-二聚体单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段或嵌合抗体。
10.权利要求1中所述的试剂条在检测D-二聚体中应用。
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