CN106442966B - 一种c反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种c反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法。相对于普通储存液制备的试纸条,本发明所制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条存储稳定性更佳,精密度更好,检测样品的出峰具有更高的信号和较平整的基线,准确度较高。

Description

一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域,更具体地涉及一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法。
背景技术
C反应蛋白(C-reaction,CRP)是由肝脏合成的一种急性时相蛋白,痕量存在于健康人血清中,当机体受到感染或组织损伤时含量迅速升高,随着病情改善或组织结构功能的恢复其含量恢复到正常水平。根据血清、血浆或全血中CRP的浓度水平,可以有效的判断有无感染、疾病的危险程度及疾病是否处于活动期。因此,CRP作为全身性炎症反应早期检测的灵敏指标,已在临床许多疾病的诊断、治疗和预后中广泛应用。
目前CRP的检测方法有免疫扩散法、乳胶凝集法、免疫标记法、速率散射比浊法及免疫透射比浊法。其中,免疫扩散法特异性高、重复性好、操作简单、价格低廉、不需要特殊仪器,但是敏感性较差;乳胶凝集法操作简单、快速、特异性较高,但易受补体、类风湿因子等干扰,产生假阳性结果;速率散射比浊法和免疫透射比浊法的检测时间、操作方法、结果精确度、重复性、灵敏度方面均较优,但需要配备大型的全自动蛋白分析仪。
免疫荧光标记是免疫层析技术和荧光标记技术的结合,被广泛应用于多类抗原物质的检测,具有检测仪器精巧轻便、操作简单迅速、结果精准等优点。因此,制备和生产C反应蛋白免疫荧光定量试纸条非常有市场价值。然而,要实现C反应蛋白免疫荧光定量试纸条的制备和长期保存,储存液是关键之一。储存液的好坏关乎试纸条的准确度和保存期,因此,通过改进储存液,开发高准确度的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条非常有现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条,包括吸水垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、结合垫、样品垫、PVC底板;其中,结合垫上喷有C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物;检测线为C反应蛋白一抗,质控线为C反应蛋白二抗,且检测线和质控线依次固定于硝酸纤维素膜上;样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并承载于PVC底板;C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物使用储存液进行浸渍处理、保存和稀释;所述的储存液配方为:PB的质量浓度为15~25mM、BSA的百分浓度为1.6%~2%、Tween-80的百分浓度为0.4%~0.6%、葡萄糖的百分浓度为0.4%~0.6%、甘氨酸的百分浓度为1.5%~2.5%、PEG4000的百分浓度为0.8%~1.2%、PEG20000的百分浓度为1%~2%、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.01%~0.1%。
作为优选的储存液配方,PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8%、Tween-80的百分浓度为0.5%、葡萄糖的百分浓度为0.5%、甘氨酸的百分浓度为2%、PEG4000的百分浓度为1%、PEG20000的百分浓度为1.5%、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03%。
试纸条加样层析后,检测质控线和检测线的荧光信号强度,并以质控线荧光信号强度校正检测线的荧光信号强度,实现C反应蛋白的定量检测。
一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条的制备方法,包括如下步骤:
(1)将荧光微球活化后与C反应蛋白一抗偶联,偶联完毕后加入封闭剂,保存于储存液中;
(2)将C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物用储存液稀释后,喷于结合垫上,干燥保存;
(3)将C反应蛋白一抗固定于硝酸纤维素膜上作为检测线,将C反应蛋白二抗固定于硝酸纤维素膜上作为质控线;
(4)在PVC底板上依次搭接地粘贴:样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫,并剪切成适当宽度即成为C反应蛋白免疫荧光定量试纸条,其中,样品垫材质为玻璃纤维素膜或滤血膜,结合垫材质为玻璃纤维素膜;
上述的储存液配方为:PB的质量浓度为15~25mM、BSA的百分浓度为1.6%~2%、Tween-80的百分浓度为0.4%~0.6%、葡萄糖的百分浓度为0.4%~0.6%、甘氨酸的百分浓度为1.5%~2.5%、PEG4000的百分浓度为0.8%~1.2%、PEG20000的百分浓度为1%~2%、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.01%~0.1%。
作为优选的储存液配方,PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8%、Tween-80的百分浓度为0.5%、葡萄糖的百分浓度为0.5%、甘氨酸的百分浓度为2%、PEG4000的百分浓度为1%、PEG20000的百分浓度为1.5%、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03%。
C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物在储存液中的保存浓度为0.1~10mg/mL。
本发明的有益效果是:
相对于普通储存液制备的试纸条,本发明所制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条存储稳定性更佳,精密度更好,检测样品的出峰具有更高的信号和较平整的基线,准确度较高。
附图说明
图1:优选的储存液制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条检测芬兰ORIONDIAGNOSTICA的C反应蛋白标准曲线;
图2:优选的储存液制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条检测C反应蛋白重组抗原的检测值与理论值散点图;
图3:不同储存液制备的试纸条检测含不同浓度C反应蛋白的病人血清样本的荧光检测折线图;
图4:不同储存液制备的试纸条检测含C反应蛋白的病人血清样本检测值与芬兰ORION DIAGNOSTICA QuikRead CRP检测值的相关图。
具体实施方式
实施例1
C反应蛋白免疫荧光定量试纸条的制备过程如下:
(1)优选储存液的制备:PB的质量浓度为20mM、BSA的百分浓度为1.8%、Tween-80的百分浓度为0.5%,葡萄糖的百分浓度为0.5%、甘氨酸的百分浓度为2%、PEG4000的百分浓度为1%、PEG20000的百分浓度为1.5%、Proclin300百分浓度为0.03%,按上述配方配制混匀后过滤除菌,制得储存液;
(2)样品垫的制备:用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜10min,置于干燥间37℃湿度30%,烘干3h,制得样品垫,备用;
(3)结合垫的制备:用结合垫处理液浸泡玻璃纤维素膜10min,浸泡处理后,置于干燥间37℃湿度30%,烘干3h,制得结合垫,备用;
(4)将1mg的200nm聚苯乙烯荧光微球先后加入20μL的0.5mg/mL的EDC和0.5mg/mL的NHS,在活化缓冲液37℃活化1h;
(5)加入0.1mgC反应蛋白一抗(鼠源C反应蛋白单克隆抗体),在200μL偶联缓冲液中与荧光微球偶联,完毕后加入封闭液20μL,制得C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物,18000rpm离心15min后,加入200μL储存液,制得C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物浓度为5mg/mL,2~8℃保存;
(6)用储存液将C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物稀释到0.5mg/mL,用喷金划膜仪喷于经结合垫处理液处理后的结合垫上,用鼓风干燥箱干燥7h。铝箔袋密封置于20-25℃、湿度约30%的条件下存放备用;
(7)将1mg/mLC反应蛋白二抗(羊抗鼠IgG多克隆抗体)和1mg/mLC反应蛋白一抗分别用包被液包被,以条带状1.0mm用喷金划膜仪分别固定于硝酸纤维素膜上分别作为质控线和检测线;
(8)在PVC底板上依次搭接地粘贴:样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸,并剪切成宽度4.1mm即成为C反应蛋白免疫荧光定量试纸条;
(9)将切好的试纸条装卡,过压壳机,准备检测;
(10)样品垫处理液:100mMPBS、1%Triton、0.75%BSA、0.5%PVA、0.9%NaCl、0.3%葡聚糖、0.05%Proclin300,pH7.8;
(11)结合垫处理液:2%Tween-80、1.5%PVA、0.5%BSA、1%海藻糖,PH7.05-7.10;
(12)活化缓冲液为75mM MES,pH5.5;
(13)偶联缓冲液:20mM PB,pH7.5;
(14)封闭液:20%BSA;
(15)包被液:20mMPBS,1.2%异丙醇、0.4%葡聚糖20000、1.5%BSA、0.5%Tween-80、0.03%Proclin300,pH7.0。
实施例2
将实施例1制备的C反应蛋白免疫荧光定量试纸条建立标准曲线并进行检测,实施方法如下:
(1)建立标准曲线:用国际临床化学联合会(IFCC)C反应蛋白标准品浓度为41.2mg/L稀释至5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL、1000ng/mL八个浓度。用制备好的试纸条加样80μL上免疫荧光分析以检测,每个浓度重复3次取平均值。以检测线所出的T峰面积和质控线所出的C峰面积的比值为纵坐标,标准品理论值为横坐标。
标准曲线如图1所示;y=0.0174x+0.0785,R2=0.9933,用该方程可计算样品中的C反应蛋白含量,实现定量,且相关性好。
(2)样品检测:用抗原稀释液对C反应蛋白重组抗原倍比稀释至5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL八个浓度。抗原稀释液:20mMPBS,0.5%BSA,0.5%Tween-20,PH7.2;将求得T/C峰面代入y=0.0174x+0.0785中Y,求得X为所测抗原值,
如图2所示,可以看出实施例2制备的试纸条检测值与理论值偏差小(R2=0.996),检测的准确率高。
实施例3
配制对照储存液,具体配方为:PB的质量浓度为50mM、BSA的百分浓度为1%、Tween-80的百分浓度为1%,葡萄糖的百分浓度为1%、甘氨酸的百分浓度为0.5%、PEG4000的百分浓度为2%、Proclin300百分浓度为0.3%。
采用实施例1制备的优选储存液(以下简称储存液2)与对照储存液(以下简称储存液1)进行助稳性能和精密度对比,实施方法和结果如下:
用储存液1和储存液2,对相同工艺标记的C反应蛋白(CRP)一抗-荧光微球进行喷膜干燥,分别组装成40个试纸条,放铝箔袋、干燥剂封口。一袋放置冰箱4℃保存7天(对照组),另外一袋放置温箱37℃加速7天。完整7天后,取出卡条,分别加入浓度为5ng/mL和50ng/mL的CRP重组抗原检测。根据理论37℃加速7天相当于4℃保存1年,模拟1年后的抗原检测情况,结果如下表1、表2所示。
表1、2种储存液制得的试纸条测试5ng/mL CRP重组抗原的效果对比
表2、2种储存液制得的试纸条测试50ng/mL CRP重组抗原的效果对比
从表1、2得出,优选的储存液2制备的试纸条在37℃加速七天后,检测值下降比例小于8%,且精密度较好;而对照储存液1制备的试纸条在37℃加速七天后,检测值下降30%以上,精密度相对较差。
实施例4
用储存液1和储存液2(同实施例3),对相同工艺标记的C反应蛋白一抗-荧光微球进行喷膜干燥,组装好试纸条,分别用浓度为2mg/mL、5mg/mL、16mg/mL、34mg/mL、184mg/mL的含C反应蛋白的芬兰ORION DIAGNOSTICA QuikRead CRP赋值的病人全血样本对两种试纸条加样检测,随后用配套检测仪器对试纸条窗口信息进行读取。通过仪器激光对窗口的荧光微球进行激发,再采集窗口300个位置(作横坐标)的发射荧光强度(作纵坐标),利用荧光分析软件将300个点按顺序连在一起形成折线图。
如图3所示,折线图可反映荧光微球在NC膜上的跑膜情况,图中有两个峰,左边为T峰(对应肉眼视卡条为检测线),右边为C峰(对应肉眼视卡条为质控线),使用储存液2的整体出峰效果较好,说明储存液2对抗体-荧光微球偶联物从结合垫释放到NC膜效果较好。使用储存液1的则出峰信号不高,基线不平整,前段抬起较明显,影响软件对峰面积的计算,进而影响读值的准确度。
实施例6
用储存液1和储存液2(同实施例3),对相同工艺标记的C反应蛋白一抗-荧光微球进行喷膜干燥,分别组装15个试纸条,用15个不同浓度的含C反应蛋白抗原的病人全血样本同时对两种试纸条加样检测。由于C反应蛋白在病人样本浓度较大,本实施例稀释200倍检测。用配套检测仪器对试纸条窗口信息进行读取,用荧光分析软件计算T峰面积与C峰面积,同时用该项目准确度较高的芬兰ORION DIAGNOSTICA的QuikRead CRP(POCT免疫比浊仪)检测的结果值。
以QuikRead CRP评价2种储存液制备的试纸条检测结果的临床诊断准确性。如图4所示,纵坐标为T峰面积/C峰面积,横坐标QuikRead CRP结果值,储存液2制备的试纸条检测结果与芬兰ORION DIAGNOSTICA的QuikRead CRP仪器检测结果较吻合(R2=0.981),而储存液1的全血线性相关较差(R2=0.873),重复性也不好。这与前述储存液2让抗体-荧光微球释放效果更好,软件计算面积更加准确有关。

Claims (4)

1.一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条,包括吸水垫、硝酸纤维素膜、质控线、检测线、结合垫、样品垫、PVC底板;其中,所述的结合垫上喷有C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物;所述的检测线固定C反应蛋白一抗,所述的质控线固定羊抗鼠IgG多克隆抗体,且检测线和质控线依次固定于硝酸纤维素膜上;所述的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接并承载于PVC底板;其特征在于:C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物使用储存液进行浸渍处理、保存和稀释;所述的储存液配方为:PB的摩尔浓度为20 mM、BSA的百分浓度为1.8%、Tween-80的百分浓度为0.5%、葡萄糖的百分浓度为0.5%、甘氨酸的百分浓度为2%、PEG4000的百分浓度为1%、PEG20000的百分浓度为1.5%、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03%。
2.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于:试纸条加样层析后,检测质控线和检测线的荧光信号强度,并以质控线荧光信号强度校正检测线的荧光信号强度,实现C反应蛋白的定量检测。
3.一种C反应蛋白免疫荧光定量试纸条的制备方法,包括如下步骤:
(1)将荧光微球活化后与C反应蛋白一抗偶联,偶联完毕后加入封闭剂,保存于储存液中;
(2)将C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物用储存液稀释后,喷于结合垫上,干燥保存;
(3)将C反应蛋白一抗固定于硝酸纤维素膜上作为检测线,将羊抗鼠IgG多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上作为质控线;
(4)在PVC底板上依次搭接地粘贴:样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫,并剪切成适当宽度即成为C反应蛋白免疫荧光定量试纸条,其中,样品垫材质为玻璃纤维膜或滤血膜,结合垫材质为玻璃纤维膜;
其特征在于:所述的储存液配方为: PB的摩尔浓度为20 mM、BSA的百分浓度为1.8%、Tween-80的百分浓度为0.5%、葡萄糖的百分浓度为0.5%、甘氨酸的百分浓度为2%、PEG4000的百分浓度为1%、PEG20000的百分浓度为1.5%、Proclin300或叠氮钠的百分浓度为0.03%。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:C反应蛋白一抗-荧光微球偶联物在储存液中的保存浓度为0.1~10 mg/mL。
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