CN211061561U - 一种基于流体控制的CRP/MxA联合检测试纸条及试剂盒 - Google Patents
一种基于流体控制的CRP/MxA联合检测试纸条及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型涉及基于流体控制的CRP/MxA联合检测试剂盒。本实用新型提供一种基于流体控制的CRP/MxA联合检测侧向流动析试纸条,其包括样品垫和结合垫,其中a)样品垫和结合垫之间,和/或b)结合垫与结合垫之间设置有控制反应的空隙,其中所述空隙为0.6mm‑6mm。本实用新型还提供包含所述侧向流动析试纸条的试剂盒。本实用新型可同时将检测灵敏度要求不同的CRP和MxA两个项目整合到一个检测试纸上,可同时对CRP和MxA进行检测,可用于区分病毒或者细菌感染,极具实用价值。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种基于流体控制的CRP/MxA联合检测试剂盒。
背景技术
C反应蛋白(CRP)是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白。CRP的检测被广泛用于监测不同的炎症状态,也可用于监测对炎症的治疗效果。
MxA是由Ⅰ型干扰素诱导产生的分布于细胞质中的一种78kD蛋白质,具有广谱的抗病毒活性,可用于区分机体是否受到病毒感染的特异性指标。快速检测机体MxA水平对于疾病诊断、合理用药、评价疗效具有重要意义。
CRP和MxA联合检测可用于区分机体感染是由病毒引起的还是细菌引起的,辅助指导临床用药。Diagnosis of viral infections using myxovirus resistance protein A(MxA).[J].Pediatrics,2015,135(4):985-93.文章指出MxA联合CRP或者PCT检测,具有更高的诊断价值和更好的可靠性;
现在的CRP检测方法多为免疫比浊法等;而MxA检测多为酶联免疫法,存在操作复杂、精密度低、耗时较长、成本高等不足;
近年来,侧向层析原理已广泛用于临床快速诊断与检测领域,尤其是胶体金诊断试纸条,检测项目涉及传染病、肿瘤标志物、优生优育、心肌标志物、炎症标志物、毒品检测和食品安全等十几类领域,并伴随新技术、新材料的不断涌现而呈现出高速增长的态势。
2010年前后,随着技术的不断发展,出现了很多新的标记物用于替代胶体金,比如荧光素、荧光微球、上转发光微粒、量子点等,这些新的标记物与侧向层析结合,克服了胶体金无法定量的问题,且灵敏度得到了很大的提升。
目前普遍使用的侧向层析试纸条诊断装置由外壳和诊断试纸条组成,其中诊断试纸条如图2所示,包括PVC板,以及粘贴在PVC板上的样品垫、结合垫、 NC膜和吸水纸等组成,各层之间有部分层叠。样本先与结合垫中抗原或抗体反应,形成复合物,再与NC膜上的抗原或抗体反应,呈现T线、C线,未反应的物质由于吸水作用继续层析至吸水纸,多为单向层析过程。但是以上方法很难解决不同动态范围项目联检的问题,比如检测灵敏度要求分别在pg/mL、ng/mL、ug/mL水平的项目,其动态检测范围相差多个数量级,很难整合在同一个检测试纸条中,即便勉强整合在一起,效果也很不理想。
由于CRP在人体样本中的浓度很高,因此常规层析法很难满足CRP的动态检测范围,检测往往需要对样本进行大比例稀释,而MxA项目的灵敏度要求要比 CRP高的多,两者相差至少2个数量级,联合检测难度很高,目前尚无CRP和MxA 联合快速检测试剂。
实用新型内容
本实用新型的目的是提供一种新型的、能够同时快速定量检测CRP和MxA 的侧向层析试剂,克服现有侧向层析方法不同动态范围项目联合检测困难的问题,使得不同灵敏度和线性范围要求的项目能够进行联合检测,既满足了高灵敏要求项目的灵敏度需求,又满足了低灵敏度要求项目的线性范围,兼顾两种检测需要,真正实现联检目的。
本实用新型的目的可以通过以下一种或多种技术方案来实现:
1.一种侧向流动析试纸条,其包括样品垫,和结合垫,其中a)样品垫和结合垫之间,和/或b)结合垫与结合垫之间设置有控制反应的空隙。在一些实施方案中,空隙大小可设置为适合控制反应过程或时间的任何适当大小,例如 0.6-6mm或者甚至更大,例如所述空隙可以为0.6mm,1.6mm,2.6mm,3.6mm,4.6mm, 6mm,或甚至更大的空隙。
2.项目1所述的侧向流动析试纸条,其还包括能于与所述试纸条一起形成封闭空间的外壳,所述外壳上的样品孔可用来控制反应。
3.项目1或2所述的侧向流动析试纸条,其中:1)其包括一个结合垫,其中样品垫和结合垫之间设置有控制反应的空隙,其中所述空隙为0.6-6mm,例如 0.6mm,1.6mm,2.6mm,3.6mm,4.6mm,6mm,或者2)其包括两个结合垫,两个结合垫之间设置有控制反应的空隙其中所述空隙为0.6-6mm,例如0.6mm,1.6mm, 2.6mm,3.6mm,4.6mm,6mm。
4.项目2-3任一项所述的侧向流动析试纸条,其外壳上的样品孔可用于向试纸条施加正压。
5.项目1-4任一项所述的侧向流动析试纸条,其中所述空隙和样品孔控制反应过程和/或反应速度。
6.项目1-5任一项所述的侧向流动析试纸条,1)其包括一个结合垫,其中样品垫含有抗CRP抗体,结合垫中含有经过标记的抗CRP抗体和抗MxA抗体,其中样品垫和结合垫之间的空隙控制样品垫中分析物抗体和分析物之间的反应时间;或者2)其包括两个结合垫,其中第一个结合垫中含有抗CRP抗体,第二个结合垫中含有经过标记的抗CRP抗体和抗MxA抗体,其中两个结合垫之间的空隙控制分析物抗体和分析物之间的反应时间。
7.试剂盒,其包含项目1-6任一项所述的侧向流动析试纸条,任选地还包含通过所述空隙控制控制反应的装置,例如产生压力的装置。
在一些实施方案中,本发明涉及一种基于流体控制的侧向层析检测试剂或试剂盒(套装),其可以包含侧向层析检测试纸及外壳。在一些实施方案中,可以分别设置试纸(例如在其上包括适当的控制反应的空隙)和外壳,从而相互配合进行流体控制,进而控制反应的进行。
优选的,所述层析试纸可以包含底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
优选的,所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫可以水平方向顺序固定在底板上,样品垫和结合垫之间、结合垫和结合垫之间设立间隙,用于控制反应过程或者反应速度。
优选的,所述外壳上盖的样品孔,用于施加压力,可用于控制反应过程或者反应速度;
与现有技术相比,本实用新型具有如下一种或多种有益效果:
1)设置控制反应的空隙0.6mm-6mm的范围可将不同灵敏度需求的MxA和CRP 项目进行联合检测;
2)用于区分病毒或者细菌感染;
附图说明
图1基于流体控制的CRP/MxA联合检测试剂盒中的试纸条和上盖示意图;
图2为常规两联检侧向层析试纸条示意图;
其中,1为PVC背板;2为样品垫;3为结合垫A;4为结合垫B;5为NC膜; 6为检测线1(T线1);7为检测线2(T线2);8为质控线(C线);9为吸水垫; 10为结合垫1与结合垫2间的间隙;12为外壳上盖;11为样品加样孔;
具体实施方式
下面结合实施例对本实用新型进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本实用新型,但不以任何形式限制本实用新型。
本实用新型的原理示意图如图1所示,样品垫2、结合垫3、结合垫4、NC 膜5、吸水垫9水平方向顺序固定在底板PVC背板1上,结合垫3与结合垫4间设立一个间隙,NC膜5上有两条检测线6、7以及质控线8,检测线包被生物特异性物质(检测线6、7分别为抗CRP抗体和抗MxA抗体),用于捕获样品中特定待检测物,质控线包被二抗(可以是羊抗鼠、羊抗兔等等抗体)或者独立于待检测物质以外的其他亲和系统(可以是亲和素、生物素偶联物质、抗FITC抗体、羊抗鸡、兔抗鸡抗体等等)。外壳上盖的样品孔可施加压力,可用于控制反应过程或者反应速度。
实施例1流体控制的CRP+MxA侧向层析联合检测
CRP是用于细菌感染或者脓毒血症的辅助诊断指标,MxA可用于病毒感染的辅助诊断,两个项目联检,对于患者区分病毒或者细菌感染同样有很高的使用价值,可以指导临床医生抗生素用药,但是两个项目的检测范围或者灵敏度需求相差较大,CRP灵敏度需要为0.5mg/L(0.5μg/mL)水平,MxA灵敏度在ng/ml水平,灵敏度需求同样相差百倍以上,在同一层析试制上检测时,整合难度非常高,本实用新型尝试采用流体控制的侧向层析实现CRP+MxA联合检测,同时兼顾两者的灵敏度和检测范围。
本实施例采用流体控制的侧向层析方式进行CRP+MxA检测。试纸条采用图1 方式进行组装,试纸条包括底板,以及粘贴在底板上的样品垫2、结合垫3(固定有抗CRP抗体)、结合垫4(固定有抗MxA抗体荧光微球、抗CRP抗体荧光微球、兔抗鸡IgY抗体荧光微球)、NC膜5和吸水纸9等组成,样品垫与结合垫3 无间隙,两者有部分层叠,结合垫3与结合垫4之间有间隙10,其他各层之间有部分层叠。
1、样品垫(释放垫)制备
样品垫(释放垫)为玻璃纤维素膜或者聚酯膜,预先采用样品垫处理缓冲液进行浸泡处理,然后37℃干燥24h备用,样品垫处理缓冲液包含0.05M Tris, 0.5%tween 20,0.5%BSA,0.5%PVA。
2、荧光标记物制备(抗CRP抗体荧光微球、抗MxA抗体荧光微球、兔抗鸡 IgY抗体荧光微球)
取1mg羧基荧光微球(100μl),加入100μl 500Mm MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲,pH5.O,再加入800μl纯化水,混匀后离心清洗去除上清液,清洗后用200μl 50mM pH5.O MES缓冲液重悬,加入0.1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),加纯化水至终体积500μL,室温混匀30min。加1mL 50mM MES pH5.0,离心清洗,弃去上清。清洗后用500μl 50mM pH5.O MES缓冲液重悬,加0.1mg单克隆抗体,室温25℃混匀30min。加BSA封闭液,4℃混匀过夜备用。
3、结合垫3制备
用微球稀释液将CRP抗体稀释成1mg/ml,用喷膜仪将抗体4ul/cm喷涂到释放垫上,37℃干燥24h备用,作为结合垫3。
微球稀释液液包含0.05M Tris,0.5%tween 20,0.5%BSA,10%蔗糖,1%海藻糖。
4、结合垫4制备
将上述2制备的荧光标记物用微球稀释液稀释至特定浓度(抗CRP抗体荧光微球终浓度0.5mg/ml,抗MxA抗体荧光微球终浓度0.5mg/ml,兔抗鸡IgY抗体荧光微球终浓度0.5mg/ml),用喷膜仪将抗体标记混合物喷涂在处理好的释放垫上,然后37℃干燥24h备用。
5、包被膜制备
用0.01M PBS(pH 7.4)配制抗CRP、抗MxA抗体、兔抗鸡抗体,浓度均为 1mg/ml。用喷膜仪将配制好的抗CRP抗体、抗MxA抗体和鸡IgY同时划在粘贴在底板的NC膜上,形成两条T线和1条C线,间隔5mm,37℃过夜,备用。
6、试纸条组装
将上述制备的样品垫2、结合垫3、结合垫4、以及吸水纸等按照图2的方式粘贴在贴有NC膜的背板上,各层之间有部分层叠,结合垫3和结合垫4之间留有1.6mm左右间隙。并用切条机切成4mm宽度的纸条,装配到外壳中备用。
7、检测结果
校准品采用生理盐水稀释10倍(由于样本CRP浓度过高,需要适当稀释), 70μl上样,上样3min后,在外壳上盖样品孔12处施加正压(此实施例采用注射器施加压力),使得样品中的CRP抗原先与结合垫3上的抗CRP抗体混合反应 3min后,从结合垫3通过间隙流到结合垫4,样本中未为抗体中和的CRP抗原继续与抗CRP抗体荧光微球反应,同时样本中的MxA抗原与抗MxA抗体荧光微球反应,并继续层析7min,采用QIAGEN公司ESE Quant荧光读数仪器读取T、C线信号值,采用T/C信号值作为系统响应信号,观察响应信号与样本浓度之间的关系,如下表1所示。
本实施例可进行一定的变形,仅采用一个结合垫(相当于将其中的样品垫与结合垫3进行结合,变成一个新的样品垫),即将CRP抗体直接喷涂在样品垫上,然后样品垫与结合垫4之间留有1.6mm左右间隙,用于流体控制,其最终效果与与上述实施例类似,测试数据见表1。
表1流体控制的侧向层析CRP+MxA检测结果
从表1可以看出采用流体控制的侧向层析检测模式,可以很好的将两个灵敏度要求不同的项目整合到一根试纸条中,且相互间互不干扰,通过流体控制,CRP 灵敏度有所下降,测量范围得到了明显改善,效果远优于实施例2中的常规方法,动态范围高端从之前的5mg/L提升到了200mg/L,而此反应MxA浓度适中,则采用常规侧向层析模式,尽管样本稀释了10倍,但仍然能够满足临床需求,经过流体控制,将两个项目整合到同一纸条中,两个项目的灵敏度和测量范围均能满足临床检测需求,且比常规侧向层析方式性能有了很大的提升。由于结合垫3 或者样品垫中预先处理了一部CRP抗体,样品上样后,与结合垫3或者样品垫中的游离CRP抗体充分反应后,才在压力的作用下通过间隙,流经结合垫4和NC 膜。由于结合垫3或者样品垫中的游离抗体中和了大部分待测抗原,使得有效 CRP抗原数量显著下降,检测的线性范围得到显著提升。而实施例2中尽管结合垫3中也处理了游离抗体,但因为样品上样后,层析速度很快,抗原与游离抗体反应很不充分,并不能有效提升检测的线性范围,常规层析,如果要满足CRP 检测范围,需要更大的稀释倍数,但稀释倍数太大,无法满足MxA对灵敏度的需求。
实施例2 CRP+MxA侧向层析联合检测(常规方法)
本实施例采用常规的侧向层析方式进行CRP+MxA检测。试纸条采用图2方式进行组装,试纸条包括底板,以及粘贴在底板上的样品垫2、结合垫3(固定有抗CRP抗体)、结合垫4(固定有抗CRP抗体荧光微球、兔抗鸡IgY抗体荧光微球、抗MxA抗体荧光微球)、NC膜5和吸水纸9等组成,样品垫、结合垫3、结合垫4各层之间有部分层叠。
1、样品垫(释放垫)制备
样品垫(释放垫)为玻璃纤维素膜或者聚酯膜,预先采用样品垫处理缓冲液进行浸泡处理,然后37℃干燥24h备用,样品垫处理缓冲液包含0.05M Tris, 0.5%tween 20,0.5%BSA,0.5%PVA。
2、荧光标记物制备(抗CRP抗体荧光微球、抗MxA抗体荧光微球、兔抗鸡 IgY抗体荧光微球)
取1mg羧基荧光微球(100μl),加入100μl 500Mm MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲,pH5.O,再加入800μl纯化水,混匀后离心清洗去除上清液,清洗后用200μl 50mM pH5.O MES缓冲液重悬,加入0.1mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),加纯化水至终体积500μL,室温混匀30min。加1mL 50mM MES pH5.0,离心清洗,弃去上清。清洗后用500μl 50mM pH5.O MES缓冲液重悬,加0.1mg单克隆抗体,室温25℃混匀30min。加BSA封闭液,4℃混匀过夜备用。
3、结合垫3制备
用微球稀释液将CRP抗体稀释成1mg/ml,用喷膜仪将抗体4ul/cm喷涂到释放垫上,37℃干燥24h备用,作为结合垫3。
微球稀释液液包含0.05M Tris,0.5%tween 20,0.5%BSA,10%蔗糖,1%海藻糖。
4、结合垫4制备
将上述2制备的荧光标记物用微球稀释液稀释至特定浓度(抗CRP抗体荧光微球终浓度0.5mg/ml,抗MxA抗体荧光微球终浓度0.5mg/ml,兔抗鸡IgY抗体荧光微球终浓度0.5mg/ml),用喷膜仪将抗体标记混合物喷涂在处理好的释放垫上,然后37℃干燥24h备用。
5、包被膜制备
用0.01M PBS(pH 7.4)配制抗CRP、抗MxA抗体、兔抗鸡抗体,浓度均为1mg/ml。用喷膜仪将配制好的抗CRP抗体、抗MxA抗体和鸡IgY同时划在粘贴在底板的NC膜上,形成两条T线和1条C线,间隔5mm,37℃过夜,备用。
6、试纸条组装
将上述制备的样品垫2、结合垫3、结合垫4、以及吸水纸等按照图2的方式粘贴在贴有NC膜的背板上,各层之间有部分层叠。并用切条机切成4mm宽度的纸条,装配到外壳中备用。
7、检测结果
校准品采用生理盐水稀释10倍(由于样本CRP浓度过高,需要适当稀释), 70μl直接上样,10min后,采用QIAGEN公司ESE Quant荧光读数仪器读取T、 C线信号值,采用T/C信号值作为系统响应信号,观察响应信号与样本浓度之间的关系,如下表2所示。
表2流体控制的侧向层析CRP+MxA检测结果
采用传统侧向层析方式,样本稀释10倍,且结合点3中固定有CRP抗体,但CRP仍然无法满足动态检测范围,5mg/L浓度以上即开始出现hook现象,若想满足需求,需要进一步增加稀释倍数。
Claims (9)
1.一种基于流体控制的CRP/MxA联合检测侧向流动层析试纸条,其包括样品垫和结合垫,其中a)样品垫和结合垫之间,和/或b)结合垫与结合垫之间设置有控制反应的空隙,其中所述空隙为0.6mm-6mm。
2.权利要求1所述的侧向流动层析试纸条,其还包括能与所述试纸条一起形成封闭空间的外壳,所述外壳的样品孔可用来控制反应。
3.权利要求1或2所述的侧向流动层析试纸条,其中:1)其包括一个结合垫,其中样品垫和结合垫之间设置有控制反应的空隙,其中所述空隙为0.6mm-6mm,或者2)其包括两个结合垫,两个结合垫之间设置有控制反应的空隙,其中所述空隙为0.6mm-6mm。
4.权利要求2所述的侧向流动层析试纸条,其外壳上的样品孔可用于向试纸条施加正压。
5.权利要求2所述的侧向流动层析试纸条,其中所述空隙和样品孔控制反应过程和/或反应速度。
6.权利要求1或2任一项所述的侧向流动层析试纸条,1)其包括一个结合垫,其中样品垫含有抗CRP抗体,结合垫中含有经过标记的抗CRP抗体和抗MxA抗体,其中样品垫和结合垫之间的空隙控制样品垫中分析物抗体和分析物之间的反应时间;或者2)其包括两个结合垫,其中第一个结合垫中含有抗CRP抗体,第二个结合垫中含有经过标记的抗CRP抗体和抗MxA抗体,其中两个结合垫之间的空隙控制分析物抗体和分析物之间的反应时间。
7.试剂盒,其包含权利要求1-6任一项所述的侧向流动层析试纸条。
8.权利要求7所述试剂盒,其还包含通过所述空隙控制反应的装置。
9.权利要求8所述试剂盒,其中所述装置为产生压力的装置。
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CN113702644A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-11-26 | 北京贝尔生物工程股份有限公司 | 建立胶体金免疫层析法检测MxA试剂盒 |
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